Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

Músculo esquelético puede adaptarse para el ejercicio de formación a través de cambios en su bioenergética y estructura física¹. Una de las principales alteraciones por entrenamiento de resistencia es la Biogénesis mitocondrial, que se puede evaluar por un aumento en la expresión de los componentes mitocondriales (p. ej., subunidades de c oxidasa [COX] citocromo), así como la expresión de el coactivator transcripcional, PGC-1α². Un creciente número de estudios ha indicado que numerosos otros factores, como volumen mitocondrial y mitofagia, también son importantes para las adaptaciones musculares. Sin embargo, los mecanismos por los cual ejercicio agudo o crónico regulan estos procesos en músculo esquelético aún no están claros.

Para delinear los caminos que se regulan las adaptaciones del músculo inducida por el ejercicio, varios modelos de ejercicio se han utilizado comúnmente en estudios de roedores, incluyendo rueda de ardilla, corriente de la rueda y ejercicio de natación. Sin embargo, estos protocolos tienen algunas limitaciones en eso ~ 4-12 semanas se necesitan para observar estos cambios fenotípicos^3,4,5. Como un método experimental alternativo, baja frecuencia inducida por estimulación crónica actividad contráctil (CCA) se ha utilizado eficazmente, como puede llevar a adaptaciones musculares en un período mucho más corto (es decir, hasta 7 días) y sus efectos ser comparables, o incluso superior a otros protocolos de ejercicio. Además, la presencia de hormonal⁶, temperatura⁷y efectos neurológicos⁸ puede hacer difícil entender las respuestas del músculo-específica al ejercicio crónico. Por ejemplo, la hormona de tiroides^9,10 y factor de crecimiento insulínico (IGF) -1 se han identificado¹¹ para mediar adaptaciones inducidas por el entrenamiento muscular, que pueden regular también otras vías de señalización en esqueleto muscular. En particular, los efectos inducidos por la CCA mínimamente son regulados por factores sistémicos, lo que permite centrarse en la respuesta directa del músculo esquelético a la actividad contráctil.

La unidad externa para el CCA fue introducida por Tyler y Wright¹²y ha sido desarrollada con modificaciones¹². En Resumen, la unidad se compone de tres partes principales: un detector de infrarrojos que puede activar y desactivar por exposición a luz infrarroja, un generador de pulsos y un indicador del pulso (figura 1). El diseño detallado del circuito de la unidad de estimulador ha sido descrito previamente¹³. Las características detalladas y específicas de CCA se pueden encontrar en mayor profundidad en un número de revisión artículos^14,15,16,17. En Resumen, el protocolo de estimulación está diseñado para activar el nervio peroneo común a baja frecuencia (es decir, 10 Hz), y los músculos inervados (tibialis anterior [TA] y Músculo extensor digitorum largo [EDL]) se ven obligados a contratar un longitud predeterminada de tiempo (por ejemplo, 3-6 h). Con el tiempo, esto cambia los músculos antes mencionados a un fenotipo más aeróbico, demostrado por un aumento en la densidad capilar¹⁸ y contenido mitocondrial^19,20,21. Así, este método es un modelo probado para imitar algunas de las adaptaciones de entrenamiento de resistencia importante en músculo esquelético de ratas.

Este trabajo presenta un procedimiento detallado de la cirugía de implante de electrodo para inducir CCA para que los investigadores pueden aplicar este modelo en sus estudios de ejercicio. CCA es un excelente modelo para estudiar el curso del tiempo de las adaptaciones del músculo, proporcionando así una herramienta eficaz para la investigación de varios eventos moleculares y de señalización en ambos puntos del tiempo temprano y más tarde tras el inicio del entrenamiento.

Todos los procedimientos relacionados con el animal fueron revisados y aprobados por el Comité de cuidado de Animal de Universidad de York. A su llegada en las instalaciones de animales en la Universidad de York, todas las ratas se les dio un mínimo de cinco días para aclimatarse a su entorno antes del procedimiento quirúrgico, con alimentos proporcionados ad libitum. Aunque este protocolo se ha aplicado previamente a otras especies de^17,15,22, el documento actual se basa en el trabajo pionero de Pette y colegas²³ y se centra en el modelo de la rata, específicamente.

1. preparación de la unidad de actividad contráctil crónica

1. Con un voltímetro, compruebe el potencial de las pilas de litio de la moneda.
   Nota: El potencial de cada batería debe ser de 3.0 ± 0.10 V.
2. Pilas dos o tres en la ranura de la unidad para que el potencial total es 6-9 V.
   Nota: Depende de la discreción de los investigadores a considerar cuánto potencial (6 o 9 V) para mantener durante el procedimiento todo experimental. Dependiendo del diseño del estudio y la intensidad deseada del estímulo, pueden utilizar 2 ó 3 baterías.
3. Verificar que la unidad funciona correctamente mediante el indicador del pulso, al exponer la unidad a 1 pulso emitido por una luz del estroboscópico infrarrojo portátil.

2. intervención de la actividad contráctil crónica

Nota: Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas antes del procedimiento quirúrgico. Tanto durante como inmediatamente después de la cirugía, se mantiene la temperatura corporal de las ratas por una almohadilla de calefacción. Es conveniente realizar el procedimiento quirúrgico en un paño quirúrgico. El cirujano debe usar guantes quirúrgicos estériles, así como una bata limpia. Si es necesario, se recomienda usar una mascarilla de respiración desechable.

1. Anestesiar ratas debajo 1-3% inhalación isoflurano con oxígeno, que es operado por un sistema vaporizador de gas. Confirmar el animal está totalmente sedado marcando sujetador de miembro posterior del dedo del pie y observando la frecuencia y profundidad respiratoria. Aplique lubricante ocular en los ojos para evitar la sequedad. Aplicar una inyección subcutánea de Meloxicam (0.5 mg/mL) a 2 mg/kg.
   Nota: Se recomienda también tener una aplicación multimodal de la analgesia (p. ej., Meloxicam más lidocaína) para reducir al mínimo cualquier dolor durante y después de la cirugía.
2. Suavemente afeitado la trasera izquierda, así como una tira alrededor del torso de la parte posterior del cuello, unos detrás de los miembros anteriores y en el tórax anterior. Suavemente Limpie áreas afeitadas con yodo y alcohol etílico para desinfectar.
3. Con el animal en su estómago, hacer una pequeña incisión (~0.5 cm) en la parte posterior del cuello en el centro de la región afeitado (la zona palpable entre los omóplatos) con bisturí (hoja no. 10).
4. Localizar el nervio peroneo común.
   1. Rollo de animal sobre su lado derecho y hacer un ~ 2-3 cm-largo corte en la piel de la trasera izquierda. El área de incisión alrededor de los grupos de músculos de la parte superior del muslo que es landmarked entre la concavidad de la articulación de la rodilla y la parte posterior cerca del origen de la cola de destino.
      Nota: Tenga cuidado de no contaminar la primera zona de la incisión al cambiar la posición del cuerpo.
   2. Utilizando punta curvada tijeras quirúrgicas, disecar ampliamente la zona subcutánea ~3.5 - 4 cm, separando la piel del músculo subyacente para hacer un bolsillo entre la piel abierta y el músculo subyacente. Abrir la piel del tejido subyacente en toda la circunferencia de la incisión (~1.5 cm²).
   3. Hacer una pequeña incisión (menos de 0,5 cm) en el músculo bíceps femoral con tijeras quirúrgicas, asegurándose que las puntas de las tijeras se corta directamente a través del músculo.
   4. Abra suavemente el área del corte hasta que los grupos musculares interno y nervio peroneo común son accesibles (la profundidad de los tejidos musculares externos (es decir, bíceps femoris) es alrededor de ~0.5 cm). Con unas pinzas, suavemente touch/pellizcar el nervio visible y observar las respuestas de los grupos musculares (por ejemplo, TA músculo) y los dedos del pie (dorsiflexión visible) para confirmar que el nervio peroneo común es aislado.
      Nota: Este paso debe hacerse con extremo cuidado para evitar cortar o dañar el nervio.
   5. Fijar la ventana tirando con retractores de metal tal que el tamaño de la ventana es de ~1.5 cm² con el nervio peroneo en el centro de la ventana. Utilizar pequeños ganchos de metal Unidos a las correas o bandas de goma que se fijan la superficie de la mesa (o junta de cirugía) (figura 2A).
5. Conecte el cable a ambos lados del nervio.
   1. Preparar ~ 50-60 cm de politetrafluoroetileno (PTFE)-revestido alambre de acero fino y doblar por la mitad.
      Nota: Puede ser útil exponer PTFA-revestido del alambre bajo la luz UV antes de la cirugía.
   2. Gancho de la parte doblada del alambre en la ranura de una barra de acero inoxidable 30 cm de largo. Pasar la varilla, junto con el cable, por vía subcutánea desde el bolsillo abierto del miembro posterior hacia la zona de incisión en la parte posterior del cuello, en un patrón en forma de L hasta la pierna y a lo largo del centro de la espalda.
   3. Encontrar los dos extremos del cable en la trasera. Tira de los cables ya que todos los cables con aislamiento de PTFE. Con un bisturí, tira cuidadosamente los extremos del alambre por ~1.5 cm. Si los cables se convierten en deshilachado, recorto y tira de nuevo. Enrollar los extremos pelados del cable alrededor de una aguja de 21 G romas (5 veces), hacer una bobina. Una vez que las bobinas están hechas correctamente, suelte la aguja de ellos.
   4. Usando un tamaño de 6-0 seda quirúrgica, asegurar cada una de las bobinas a cada lado del nervio peroneo común (figura 2A).
      1. Hacer un nudo al final de la bobina y sutura en el lado izquierdo del nervio. Asegúrese de que la bobina está en 1,5-2,5 mm del nervio.
      2. Para asegurar la bobina, se aplican dos o tres suturas adicionales a lo largo de la bobina.
      3. Repita estos pasos en el lado derecho del nervio.
   5. Aplique 2-3 gotas de solución de antibiótico (ampicilina en solución salina; 132 mg/mL) y luego la sutura cuidadosamente la ventana (es decir, tejido del músculo bíceps femoral) con seda de 5-0 de tamaño.
6. Libremente del viento la holgura restante del alambre (sobre el diámetro del dedo índice) y empuje en el bolsillo subcutáneo por encima de la incisión suturada del músculo bíceps femoral (aproximadamente por encima de la cadera).
7. Aplicar 2-3 gotas de solución de antibiótico otra vez (ampicilina en solución salina; 132 mg/mL). Cerca de la piel abierta por sujetar con grapa.
8. Conecte los cables (saliendo de la zona de la incisión del cuello) para el estimulador CCA.
   1. Conectar pin enchufes con los cables.
      1. Corte el bucle del cable que sale de la incisión en la parte superior del cuello para crear 2 extremos del cable (estos conduzca a las bobinas de sutura a cada lado del nervio peroneo).
      2. Con un bisturí, tira de los extremos de los cables de ~0.5 cm. corte de los cables pelados, si cualquier.
      3. Lentamente empuje las piezas peladas de los cables en el orificio de los conectores de pin y usando un cautín, suelda los cables en los enchufes del perno.
   2. Opcionalmente, revise la conexión de los cables.
      1. Conecte las clavijas a una unidad de sobremesa gran estimulador mediante pinzas de cocodrilo.
      2. Entregar un solo pulso de 9 V (0,1 ms, 10 Hz) para confirmar que TA músculo contratos y la izquierda del pie dorsiflexionan.
   3. Pasar los extremos de los cables conectados pin a través de la almohadilla de gasa estéril que es ~ 4 cm x 4 cm.
   4. Conectar las patillas a la unidad de estimulador CCA.
      1. Pase el alambre por el orificio en la base de la caja del estimulador.
         Nota: Este cuadro es una cámara casera para la unidad de estimulador CCA y 3,5 cm × 3,5 cm x 2,5 cm¹³.
      2. Inserte las clavijas de las tomas de conexión de la unidad de la CCA. Ponga suavemente la unidad de la CCA en la cámara. Usar una tachuela pegajosa para asegurar la unidad CCA en la parte inferior de la cámara.
   5. Usando una cinta athletic o el esparadrapo poroso, fije la cámara con cinta alrededor del torso depilado. Cierre la tapa del compartimiento con tres capas de cinta adhesiva y terminar envolviendo una cinta alrededor de los lados de la caja de estimulador para asegurar la caja (figura 2B).
9. Controlar si la CCA trabaja al exponer la unidad a un solo pulso de luz infrarroja (espectro de longitud de onda > 770 nm) que emite una luz del estroboscópico infrarrojo portátil.
   Nota: Si la CCA está funcionando correctamente, los investigadores serán capaces de ver que en respuesta a la luz infrarroja se están contrayendo los músculos del miembro posterior (es decir, TA).
10. Observar la rata y vigilar su temperatura hasta que completamente ha recuperado la conciencia. Casa en una jaula solo ocupante para evitar cualquier daño de otros animales y no dejar objetos de plástico ni túneles en la jaula para el resto del estudio para mitigar el riesgo de daños a la unidad de estimulador o lesiones al animal. De la fuente con una botella de agua incluyen amoxicilina (0.5 mg/mL).
11. Aplicar dosis de 1 mg/kg de Meloxicam por vía subcutánea cada 24 h después de la cirugía, que continúa al menos durante 72 h.

3. crónica actividad contráctil

1. Después de la cirugía, permiten al menos 5-7 días para una recuperación completa de incisión y sutura en/alrededor de los músculos esqueléticos.
   Nota: Durante y después del procedimiento CCA, atentamente para comprobar la condición de cada animal mediante la observación de sus comportamientos (p. ej., comer, beber o moverse). Además, determinar cualquier estrés severo o efectos adversos marcando un cambio de peso corporal antes y después del procedimiento CCA.
2. En el día de la estimulación de la CCA, encienda el CCA si expone el equipo estimulador para un único pulso de luz infrarroja (longitud de onda > 770 nm) por una luz del estroboscópico infrarrojo portátil.
3. Aplique 3 o 6 h de estimulación de 10 Hz CCA.
   Nota: El plazo para la estimulación es hasta el investigador. La frecuencia de la estimulación no ha sido alterada en estos experimentos y se han observado solamente muy modestas mejoras en la adaptación mitocondrial mediante la extensión de la estimulación de 3 a 6 h/día, en nuestra experiencia. Si es posible, compruebe el estímulo y el animal cada 30-60 minutos.
4. Tras el período deseado del CCA, apague la unidad CCA por exposición a la luz infrarroja (mismo procedimiento que el encender la unidad).
5. Si varios días, repita el paso 3.2. a 3.4.
6. Determinar el tiempo de colección de tejido. Por ejemplo, recoger los tejidos 24 h después del inicio de la pelea final de CCA (es decir, 18 h después de la última estimulación de CCA de 6 h), que se realiza bajo la anestesia como hecho durante el procedimiento quirúrgico de CCA. Inmediatamente después de recoger todos los tejidos, eutanasia animales suprimiendo el corazón mientras el animal está todavía bajo anestesia.

Hemos demostrado que la actividad contráctil crónica (CCA) es una herramienta eficaz para inducir adaptaciones favorables mitocondriales en músculo esquelético. Ratas sometidas a 7 días de la CCA (6 h al día) pantalla mejorada la Biogénesis mitocondrial en el músculo estimulado en comparación con el miembro posterior contralateral sin estimular (control). Este aumento de la Biogénesis mitocondrial se indica por la expresión creciente de la proteína de PGC-1α (Figura 3A), considerado como el principal regulador de la Biogénesis mitocondrial, junto con elevaciones de otras proteínas mitocondriales claves COX-COX-IV y me que son componentes importantes de la cadena de transporte de electrones. Además, el citocromo c oxidasa (COX) la actividad enzimática, un indicador útil del contenido mitocondrial, aumentó aproximadamente un 30% después de 7 días de CCA (figura 3B). Además, se evaluaron cambios en la función mitocondrial, mediante fibras musculares permeabilized para medir la capacidad respiratoria mitocondrial y encontraron que el CCA dieron lugar a un aumento en el máximo respiratorio (es decir, estado 3) capacidad del músculo sometidas a 7 días de estimulación en relación con el músculo de control (figura 3). Además, ambas poblaciones mitocondriales, subsarcolémicos (SS) y intermyofibrillar (FMI), aumentó después de 7 días de CCA (Figura 4A y B), y nos encontramos con las fracciones de IMF del músculo sometido a 7 días de la actividad contráctil que color rojo observable más que los derivados de los músculos de control (CON) mediante centrifugación diferencial, probablemente indicando altos niveles de mioglobina, hemo y otros elementos relacionados con el oxígeno (figura 4).

Adaptaciones a los sistemas lisosomales y autofagia también pueden ser provocadas por la CCA. En particular, hemos observado un aumento en la abundancia de la proteína del factor de transcripción EB (TFEB; Figura 5A), el principal regulador de la biogénesis lisosomal, por CCA en todos puntos de tiempo (es decir, 1, 3 y 7 días), así como otros marcadores lisosomales tales como proteína de la membrana lisosomal asociada 1 (LAMP1; Figura 5B). Curiosamente, nuestro estudio ha demostrado que alteraciones en la autofagia, mitofagia y sistemas lysosomal ocurren antes de la Biogénesis mitocondrial.

Figura 1. Un diagrama muestra los componentes principales de un estimulador portátil de CCA unidad. Esta figura ha sido modificada desde Takahashi et al. 13. IR, infrarroja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Implantación de electrodos y estimulador de. (A) una ventana de conexión de los cables a ambos lados del nervio peroneo común. (B) una imagen ejemplar para demostrar un conjunto de unidad CCA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. PGC-1 alfa, la respiración mitocondrial y la actividad enzimática con CCA. (A) CCA induce adaptaciones mitocondriales en músculo esquelético, como se muestra por el aumento en los niveles de proteína de PGC-1α. Una imagen de blot representativo se muestra junto con ß-actina como control de carga. CON se refiere a Control, es decir, miembro posterior contralateral no sometidos a CCA, y se obtuvieron datos de cambio doble por normalización de resultados en relación con en 1 día. (B) actividad COX y (C) permeabilized respiraciones de músculo fueron también mayor 7 días siguientes del CCA. Todos los datos se muestran como media ± SEM (N = 6-8). †P < 0.05, efecto de la interacción entre el CCA y el tiempo; §P < 0.05, principal efecto del CCA; P < 0.05, diferencia significativa vs control en el día 1. Figura 3A y 3B se han modificado de Kim y campana19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Pruebas de la Biogénesis mitocondrial en músculo con CCA. (A y B) Imágenes microscopio de electrón indican volúmenes agrandados de subsarcolémicos (SS) y intermyofibrillar mitocondrias (FMI) en músculo esquelético de ratas expuestas a CCA durante 7 días. Esta imagen ha sido modificada de Ljubicic, et al. 21y barras de escala indican 1 μm. (C) comparación de la fractionations mitocondrial muscular entre el control (CON) y músculo (CCA) estimulado después de 7 días de estimulación de la CCA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. El sistema lisosomal es upregulated por 7 días de la CCA. Esto se indica por el aumento en la abundancia de la proteína en TFEB (A) y (B) LAMP1. Resultados se muestran como cambios del doblez por la normalización de datos relativos a CON en el día 1. (C) se muestran imágenes de blot representativo y GAPDH es un control de carga. §P < 0.05, efecto principal de CCA. Todos los datos se muestran como media ± SEM (N = 8); ¶P < 0.05, principal efecto del tiempo; P < 0.05, diferencia significativa vs control (CON) en 1 día. Esta figura ha sido modificada de Kim y campana19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.