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Artículo de método

Cinemática ocular midiendo In Vitro la estimulación de los nervios craneales en la tortuga

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DOI:

10.3791/56864

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2 de junio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Neuroscience Program, Lafayette College, 2Department of Information Technology, Computer Science, and Digital Media, Juniata College

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar una en vitro aislado tortuga cabeza preparación para medir la cinemática de los movimientos del ojo. Después del retiro del cerebro del cráneo, los nervios craneales pueden ser estimulados con corrientes cuantificar rotaciones y cambios en el tamaño de la pupila.

Resumen

Después de que los animales son sacrificados, los tejidos comienzan a morir. Las tortugas ofrecen una ventaja debido a un tiempo de supervivencia de sus tejidos, especialmente en comparación con los vertebrados de sangre caliente. Debido a esto, se pueden realizar experimentos en vitro en tortugas para largos períodos de tiempo para investigar las señales neuronales y control de sus acciones de blanco. Con una preparación aislada de cabeza, medimos la cinemática de los movimientos oculares en tortugas, y su modulación por señales eléctricas por los nervios craneales. Después de que el cerebro fue quitado del cráneo, dejando intactos los nervios craneales la cabeza disecada fue colocada en un cardán para calibrar los movimientos de los ojos. Electrodos de vidrio fueron atados a los nervios craneales (oculomotor, trochlear y abducens) y estimulada con corrientes para evocar los movimientos de los ojos. Nos vigila movimientos de los ojos con un video infrarrojo de seguimiento sistema y cuantificada de rotación de los ojos. Corriente de pulsos con una gama de amplitudes, frecuencias, y las duraciones del tren fueron utilizadas para observar efectos sobre las respuestas. Porque la preparación se separa del cerebro, la vía eferente va a objetivos musculares puede examinarse aisladamente para investigar señales neuronales en ausencia de la información sensorial procesada centralmente.

Introducción

Justificación para el uso de las tortugas de orejas rojas Slider en experimentos electrofisiológicos:

Resbalador Rojo-espigado tortugas (Trachemys scripta elegans), son considerados uno de los peores de las especies invasoras del mundo1 y puede indicar que un ecosistema está en problemas. La razón de por qué tienen tanto éxito las tortugas resbalador Rojo-espigado es mal entendida pero en parte puede ser debido a su fisiología tolerante y posesión de los tejidos nerviosos que pueden sobrevivir bajo condiciones hipóxicas2,3,4 . Uso para experimentación no amenaza a sus números y con esfuerzos mínimos, preparaciones electrofisiológicas pueden permanecer viables sobre duraciones extendidas, tanto como 18 horas5,6. El beneficio es similar a la ventaja de usar animales invertebrados como cangrejos7, que también tienen la capacidad de resistir bajos niveles de oxígeno8.

Técnicas para la medición de movimientos de los ojos:

Enfoques para medir los movimientos oculares en animales frontal-eyed con primates no humanos han sido bien desarrolladas9. El ojo gira en la órbita alrededor de tres ejes: horizontal, vertical y torsional. El método de la bobina de búsqueda magnético se considera generalmente el más confiable para medirlas rotaciones, pero es invasivo, que requiere pequeñas bobinas para ser insertado en el scleras de animales10,11. Sistemas de video también pueden medir rotaciones y tienen la ventaja de ser no invasivo. El desarrollo de mejores cámaras con procesamiento de imágenes innovadoras han mejorado su funcionalidad hacer sistemas basados en vídeo una alternativa atractiva al considerar12,13,14.

Las técnicas desarrolladas para la medición de movimientos de los ojos en nonmammals han sido mucho menos importantes. Las medidas son cualquiera baja resolución o describen sólo algunas de las rotaciones15,16,17,18. La falta de desarrollo puede ser parcialmente atribuyó a la dificultad de nonmammals de formación a seguir objetivos visuales. Aunque los movimientos de los ojos han sido bien estudiados en el resbalador Rojo-espigado tortugas19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, debido al desafío en animales del entrenamiento para realizar un seguimiento de objetivos, la cinemática exacta de sus movimientos del ojo está mal entendido.

Tortugas resbalador Rojo-espigado generalmente son considerados como vertebrados con ojos laterales, pero porque puede retraer completamente su cabeza en su concha31, obstrucción significativa de los campos de visión lateral por el caparazón produce32. El resultado es que su línea de vista visual es forzado hacia el frente, haciendo que se comporte más como mamíferos frontal-eyed. Por lo tanto, su uso como un modelo para el desarrollo de enfoques para la medición de movimientos de los ojos también ofrece una perspectiva evolutiva única.

El protocolo descrito en este trabajo utiliza una preparación de cabeza en vitro aislado para identificar la cinemática de los movimientos del ojo en las tortugas de orejas rojas slider. Se disecan los cerebros de los cráneos dejando intactos los nervios craneales. Las cabezas se colocan en un cardán para calibrar los movimientos de los ojos y evocar respuestas por estimulación eléctrica de los nervios craneales inervan los músculos del ojo. Medidas de rotaciones por los ojos se realizan mediante un sistema basado en el video, usando algoritmos de software, que la pista la pupila oscura y las manchas del iris. La preparación proporciona la oportunidad de medir cinemática de ambos extraocular (es decir, rotación horizontal, vertical o torsional)32 y intraocular (es decir, cambios de la pupila)33 movimientos.

Sistema modelo para el análisis de vías nerviosas eferentes:

Más generalmente, el enfoque proporciona a los investigadores la oportunidad para estudiar señales neuronales eferentes cómo generar movimientos de los ojos cuando los músculos de sus Estados relajados y en la ausencia de información sensorial integrada, procesada por el cerebro32, 33. Por lo tanto, la cinemática del ojo puede ser examinada en un sistema modelo en el que únicamente son procesados por la vía neural eferente dejando el cerebro y conectado a los músculos.

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Protocolo

Nota: Las tortugas resbalador Rojo-espigado, machos y hembras, fueron compradas de un vendedor. Las tortugas fueron alojadas en una suite de animal caliente que contiene dos tinas de 60 galones equipados con islas de ladrillo para asolearse bajo luces infrarrojos 250 W. El ambiente se mantuvo en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10-h con la temperatura del agua a 22 ° C. Luces se enciende a las 6:00 y apagar en 20:00. Los tanques equipados con sistemas de filtración se limpiaron semanalmente y tortugas fueron alimentadas ad libitum con cada otro día. El cuidado del resbalador Rojo-espigado tortugas y todos los siguientes procedimientos experimentales descritos aquí32,33 fueron aprobados por el cuidado Animal institucional y Comité uso (IACUC) en Lafayette College.

1. equipo instalación

  1. Preparar solución de Ringer de tortuga. Agregue lo siguiente al agua destilada en este orden: cloruro de sodio 96,5 mM (58.44 g/mol), cloruro de potasio 2,6 mM (74.56 g/mol), cloruro de magnesio 2,0 mM (203.31 g/mol), bicarbonato de sodio 31,5 mM (84.01 g/mol), dextrosa 20,0 mM (180.16 g/mol), concentrado ácido clorhídrico para ajustar el pH a 7.51 y cloruro de calcio 4.0 mM (110.98 g/mol) (véase Tabla de materiales). Mezcle la solución añadiendo cada sal.
    PRECAUCIÓN: El HCl concentrado es peligrosa (piel, ojos, inhalación e ingestión peligros).
  2. Hacer sugerencias para los electrodos de succión de 5 cm de largo tubo capilar de vidrio (véase Tabla de materiales), por el fuego-pulido a diferentes tamaños de diámetro interior para dar cabida a los nervios craneales de espesor variable.
    1. Utilice una lima pequeña para grabar una línea a través de un pedazo de vidrio capilar. Colocar en papel de seda y romper por la mitad.
    2. Poco a poco rodar uno de los extremos del vaso capilar en la llama de un mechero de Bunsen. Examinar periódicamente la punta para el tamaño, la suavidad y la simetría con una disección alcance y una luz de fibra óptica de la fuente (véase Tabla de materiales).
      Nota: Para las tortugas de cabeza anchura entre 20 y 30 mm, diámetro interior óptimo ajuste tamaños generalmente rango de 0,4 a 0,8 mm para el nervio oculomotor (nIII), 0.3 a 0.6 para el nervio troclear (nIV) y 0,2 a 0,4 mm para el nervio abducens (nVI).
  3. Limpiar y organizar gubias, una sonda de disección Roma, microscissors, pinzas finas, pinzas curvas y un mango de bisturí con hojas (véase Tabla de materiales) para la disección.
    Nota: La esterilización de los instrumentos es opcional.

2. anestesia y eutanasia

  1. Lugar la tortuga en un hielo del cubo durante 60 min a cryoanesthetize lo.
  2. Eutanasia a la tortuga por decapitación con una pequeña guillotina animal (véase Tabla de materiales).
    1. Levante suavemente las mandíbulas del animal abierto con una pequeña espátula de pesaje para que un gancho se introduce y se dio vuelta para quedar bajo la punta de la mandíbula superior.
    2. Tire con constante presión para extender la cabeza del animal a través de la guillotina. Decapita rápidamente a los animales.
  3. Coloque la cabeza en un plato de disección. Tiene solución de Ringer de suficiente tortuga para irrigar el tejido. Oxigena la solución con 95/5 O2/CO2 (véase Tabla de materiales).
  4. Mantener el tejido en 4 ° C mediante la colocación de hielo en el exterior del plato.

3. disección

  1. Utilice el alcance de la disección con una fuente de luz óptica de fibra para llevar a cabo la disección.
  2. Retire la mandíbula inferior. Coloque una sonda de disección Roma a través de la boca para proporcionar una dirección más fácil de la cabeza. Corte de la articulación que conecta el hueso dental al cráneo con un bisturí. Uso gubias para tirar de la quijada más baja del cráneo. Usar gubias para quitar la piel y los músculos de sus accesorios en las regiones dorsales y laterales del cráneo.
  3. Quitar la columna vertebral.
    1. Identificar la columna vertebral en el extremo caudal del cráneo. Doblar la columna vertebral ventral para exponer la médula espinal. Utilice microscissors para cortar la médula espinal. Utilizar gubias para quitar la columna vertebral y otros tejidos de cráneo tirando caudalmente.
  4. Extraer el cerebro del cráneo después de cortar los nervios craneales.
    1. A partir de la botella doble de agujero, utilizar gubias para cortar dos incisiones en el cráneo dorsal. Hacer cortes superficiales para evitar daños en el cerebro por debajo.
    2. Usar gubias para sacar cuidadosamente el cráneo dorsal. Utilice microscissors para quitar el meninx para exponer al resto del cerebro. Retire suficiente meninx hasta los bulbos olfativos, en la cavidad craneal anterior, se puede identificar (ver figura 1A). Seguir irrigar el cerebro con solución de Ringer de tortuga, como sea necesario.
    3. Uso de fórceps curvado suavemente tirar caudalmente el cerebro y producir leve tensión sobre los nervios craneales. Cuidadosamente corte y retire los bulbos olfativos y cerebro con fórceps curvado.
    4. Use microscissors para empujar suavemente el midbrain hacia la línea media para exponer los nervios craneales; nIII, se observan unos 0,6 mm, frente a nIV, y el diámetro de la VNI será ligeramente inferior a la nIII. Corte nIII y nIV donde unen al cerebro medio (ver figura 1B). Repetir este proceso en el otro lado.
    5. Corte del izquierda y derecho del nervio óptico (nII) con microscissors. Luego incline el tronco encefálico hacia un lado. Observar nVI emergiendo de la superficie ventral cerca del cruce del puente de Varolio y la médula (véase figura 1); el diámetro de la nVI es pequeño y aproximadamente 0,3 mm. cortar tanto la nVI izquierdo y derecho.
    6. Quitar las partes restantes del médula oblonga de la tortuga con microscissors y pinzas finas. Una vez vaciado el cráneo, examinar el piso de la cavidad craneal. Identificar nIII, nIV y nVI.
  5. Retire los párpados superiores e inferiores con pinzas finas y microscissors.

4. calibración de los movimientos de los ojos

  1. Utilice una tabla rígida (véase Tabla de materiales) para apoyar la colocación del cardán y otros instrumentos. Coloque la cabeza de la tortuga en el mandril de cardán para que la superficie dorsal de la cabeza es paralela al horizonte con un pequeño nivel de burbuja de descanso a través del cráneo. Aproximadamente, coloque uno de los ojos en el centro de rotación horizontal y vertical de cardán.
  2. Coloque la cámara infrarroja, con una luz infrarroja diodo (LED), que forma parte del sistema de seguimiento de ojo basado en video (véase Tabla de materiales), en una distancia de aproximadamente 12 cm de ojo de la tortuga.
    1. Ángulo de la cámara 45 grados por encima de la línea de visión del ojo. El LED debe estar en la posición de 11:00 en la lente de la cámara. Centro el LED a lo largo del eje óptico del ojo. La cámara será ligeramente fuera de eje (como vista desde arriba del ojo).
    2. Ajustar la distancia de la cámara del ojo para que la vista de cámara es llenada máximo por el globo ocular. Asegurar que las esquinas de los ojos (canthi) en los bordes de la vista horizontal.
  3. Conecte la cámara al ojo basado en video sistema para procesar los datos de seguimiento. Dividir la señal a un DVD-grabador para capturar el vídeo sin procesar. Enfoque la cámara para obtener una imagen clara del ojo. Tenga cuidado de multa-posición del ojo en el centro de la vista de cámara mediante los tres grados de ajuste lineal (x, y, z) proporcionado con el cardán.
  4. Detectar a la pupila oscura estableciendo el umbral y el contraste apropiadamente usando el programa con el ojo de vídeo sistema de seguimiento.
    1. Con el ratón, haga clic en el menú "Video" y en "Mode" seleccione "Alta precisión" para capturar imágenes a una velocidad de muestreo de 30 Hz (resolución de 640 píxeles x 480 líneas). También en "Video", seleccione a "Pupila oscura" para "Alumno tipo" y "Elipse (elipse rotada)" para "Método de segmentación de alumno".
    2. En la ventana "EyeCamera", pinche en el icono del alumno buscar área «ajuste» (pequeño rectángulo vertical con un punto en el centro). Utilice el ratón para arrastrar a un rectángulo que limita un área alrededor de la pupila. Evitar las zonas oscuras que podrían confundirse con la pupila.
    3. En la ventana de "Controles", confirman que cajas para "Auto imagen" y el "umbral de bloqueo positivo-seguimiento" estén marcadas. Haga clic en "Auto-umbral" para optimizar la densidad de exploración, que se muestra como puntos verdes sobre la pupila oscura.
  5. Calibrar la pantalla de video del ojo basado en video programa de seguimiento a las rotaciones de la cardán 12,5 ° (+-) alrededor de su eje horizontal y 10 ° (+-) alrededor de su eje vertical.
    1. En la ventana de "Control", haga clic en "Pantalla". Marque las casillas debajo de "Mirada" y "Stim" para "Punto de mira", "Calib región" y "Geometría de la red". Después de comprobar las casillas debajo de "Geometría Grid", una ventana se el pop y el decir, "la geometría de la pantalla de estímulo se medirá antes de que puede visualizarse la cuadrícula de la geometría. ¿Desea hacerlo ahora?" Seleccione "Y" para sí.
    2. Con el ratón, haga clic en el menú "Windows" y seleccionar "Estímulo". Abrirá la ventana de "Estímulo" que muestra un cruce de la línea vertical y horizontal en el centro de la pantalla. Medir las longitudes de las líneas al mm más cercano. Pulse "Esc" del teclado para salir de la ventana de "Estímulo".
    3. Con el ratón, haga clic en el menú de "Estímulo" y seleccione "Configuración de la geometría". Las longitudes de las líneas que se midieron a la entrada. Ajustar la distancia de visualización para que la línea de grados igual a 25 ° de la línea horizontal y 20 ° de la línea vertical. Haga clic en el botón "Store" y cerrar la ventana.
    4. En la ventana "EyeSpace", seleccione el número de calibración "Datos punto" a "9". Con el ojo de la tortuga situado en el centro, haga clic en el centro de datos de punto y haga clic en el botón "Volver a presentar".
      Nota: Se abrirá la ventana de "Estímulo" y "Get Ready" aparece en el centro de la pantalla. Un cuadro aparecerá en la ubicación del centro y luego desaparecer. Sobre su desaparición, se cerrará la ventana de "Estímulo". Ahora se deberá calibrar la posición central.
    5. Repetir la operación girando el Stick derecha/izquierda,-12,50 °, +12,5 ° y arriba/abajo + 10 /-10 ° a calibrar los puntos restantes.
  6. Para calibrar la rotación torsional, utilice la plantilla de montaje de algoritmo con el ojo basado en video programa de seguimiento. El algoritmo establece una posición cero basada en las marcas del iris y calcula un ángulo de rotación cuando las marcas se convierten en un desvío desde el centroide de la pupila.
    1. Con el puntero del mouse, haga clic en el menú "Windows" y seleccione "Torsión". Haga clic en el botón "Inicio" en la ventana de "Torsión". En la ventana "EyeCamera", un arco aparecerá sobre la imagen del ojo.
    2. Ajustar el radio, el ángulo y la longitud del arco con el cursor en un lugar donde las marcas irregulares están presentes en el iris. Active las casillas de "Gráficos en tiempo real" y "Auto-Set después de ajuste". Si es necesario, ajustar el brillo y el contraste en la ventana de controles y re-umbral la pupila oscura (ver paso 4). Haga clic en el botón "Set plantilla".
  7. Coloque una regla en el mismo plano focal como la pupila y registre el ancho de la vista de cámara completo. El valor se utilizará más adelante para determinar la anchura real de la pupila.

5. colocación de electrodo de succión en nervio craneal para evocar movimientos oculares

  1. Coloque con cuidado un electrodo de referencia del pin en el tejido conectivo o muscular restante en la cabeza.
  2. Coloque el electrodo de succión (véase Tabla de materiales) en el nervio craneal usando un micromanipulador y disección alcance montado en un brazo. Utilice una fuente de luz óptica de fibra para ver y la colocación de la guía.
    1. Coincide con el tamaño de un nervio a una punta de vidrio capilares. Ensayo y error es necesario para obtener un mejor ajuste en el diámetro de un nervio (ver paso 1.2 para recomendaciones de tamaño). Coloque la punta del cristal hacia el electrodo de succión. Rellenar el electrodo de succión con solución de Ringer y ajustar el volumen dentro de la jeringa aproximadamente la mitad de su capacidad.
    2. Mueva con cuidado la punta de vidrio del electrodo con el instrumental quirúrgico para una posición por encima del extremo cortado del nervio seleccionado. Asegúrese de que solución de Ringer llena el cráneo y la punta está por debajo de su superficie. Si es necesario, utilizar la arcilla de modelado a la presa hasta lugares donde solución de Ringer es que sale del cráneo.
    3. Tire el émbolo de la jeringa.
      Nota: El vacío extrae el nervio en el extremo de la punta del capilar. El nervio queda dentro de la punta con poco o ningún vacío adicional aplicado indica un buen ajuste.

6. estimulación del nervio craneal y análisis de movimientos del ojo

  1. Usar un estimulador de nervio/músculo de propósito general con un dispositivo de aislamiento actual (véase Tabla de materiales) para estimular el nervio craneal mediante el electrodo de succión.
    1. Conectar el electrodo de succión con el actual dispositivo de aislamiento utilizando un cable. Conecte el cable del electrodo de referencia del pin para la conexión a tierra del dispositivo de aislamiento.
    2. Seleccionar los parámetros de las corrientes de los selectores y enciende el dispositivo estimulador y el aislamiento. Utilizar una gama de corrientes de 1 a 100 mA, con frecuencia de 10 a 400 que Hz. Use 1 o 2 ms impulsos en duración 100, 500 o 1.000 ms trenes.
  2. Registro de la sincronización de estímulos.
    Nota: Los pulsos Transistor-transistor-logic (TTL) se sincronizan con las entregas de las corrientes del estimulador y comunicarse en tiempo real mediante un cable a los canales de entrada del sistema de seguimiento de ojo basado en video. Un módulo de software proporcionado con el ojo basado en video, controles de programa de seguimiento de la comunicación.
    1. Para visualizar el calendario de las aplicaciones actuales y su influencia en los movimientos de ojo, haga clic en el menú de "PenPlots". Selecciona "Posición de la mirada de X", "Posición de la mirada Y", "Torsión" y "Ancho de la pupila" para mostrar en tiempo real datos parcelas X y Y los ojos puestos, torsión y ancho de la pupila. Seleccione también los "segundos & marcadores" del menú "PenPlots" para mostrar una parcela de distribución con marcas, que aparecen a intervalos de 1 s.
      Nota: Una letra "T" aparecerá marcado el inicio del pulso TTL, que ocurre simultáneamente con la aplicación actual.
    2. Para almacenar los datos de movimientos del ojo evocados por las corrientes, haga clic en el menú "Archivo" y seleccione "Nuevo archivo de datos" debajo de "Datos". Introduzca un nombre de archivo y pulse «Enter». Datos de ahorro pueden hacer una pausa y luego reinicie utilizando la combinación de comandos de teclas "Ctrl" + "p". Cuando una sesión experimental haya finalizado, seleccione "Cerrar fichero de datos" menú "Archivo" en "Datos".
    3. Para ayudar a mantener un registro de tipo de corrientes aplicadas, haga clic en el menú "Windows" y selecciona "Datos Pad". Aparecerá la ventana de "Teclado/DataMarker". Haga clic en una letra o un número para identificar los parámetros de los estímulos actuales siendo entregados al nervio.
      Nota: por ejemplo, "X" podría estar parado de 10 μA. clic en "X" almacena su entrada en el archivo de datos en tiempo real para el análisis post hoc . También aparece en el "PenPlot" para los "Segundos & marcadores" para la observación continua.
  3. Analizar los datos del sistema de seguimiento del ojo.
    1. Abra el archivo de datos guardados, que está en un formato de texto delimitado, en un programa de hoja de extensión de la opción para organizar los datos y realizar análisis estadístico.
      1. Convertir los valores de ancho de pupila almacenados en el archivo a tamaño real en mm.
      2. Convertir los valores de X y Y ojos posiciones y torsiones a las unidades de grados y utilizar convenciones para describir los movimientos de los ojos; por lo tanto, las direcciones positivas de rotaciones: intorsion, elevación y aducción; y la negativa de las direcciones de rotaciones: secuestro, extorsión y depresión.
    2. Copiar la información de encabezado en una hoja nueva. Se incluirán los valores para el tamaño de pantalla (ancho y alto) y la distancia de la visión. Ocho columnas de los datos recopilados a una frecuencia de 30 Hz a seguir a continuación la información del encabezado.
    3. Volver a la hoja de cálculo que contiene los datos crudos. Hacer un "hallazgo" por "X" en la última columna titulada "Marcador" para localizar donde se aplicó estimulación con 10 μA. incidencia del hallazgo de "T", marca el comienzo de la estimulación actual. Copiar 15 filas (0,5 s) de datos que ocurre antes de "T" y 90 Marcos después de "T" (3.0 s); es decir, 3,5 total s. Pegar los datos en la hoja de cálculo nueva debajo de la información del encabezado.
    4. Insertar una columna en blanco después de "PupilWidth". En la columna en blanco, pasar a la dimensión de calibrado en mm:
      Diámetro de la pupila horizontal = × "PupilWidth" la dimensión de la anchura de la vista de cámara
    5. Insertar 2 columnas en blanco después de "X_Gaze" y "Y_Gaze". Normalizar las posiciones para las dimensiones de la pantalla de visualización: coordenadas (0, 0) en la parte superior izquierda de la pantalla que se extiende a (1, 1) en la parte inferior derecha. En la primera columna en blanco, traducir posiciones contar con un sistema de coordenadas (0, 0) en el centro de la pantalla. Incluyen la conversión a las dimensiones de la pantalla en mm:
      X = (0.5 × ancho) – (× width del "X_Gaze"); Y = (0.5 x altura) – (altura del × del "Y_Gaze")
      Nota: La secuencia de operación es para el ojo izquierdo. La secuencia deberá invertirse para el ojo derecho con el fin de seguir la Convención de negatividad para el secuestro y la positividad para la aducción.
    6. En las columnas segunda, utilizar funciones de trigonometría para convertir (°) ángulos de rotación:
      rotación horizontal = arctan (Xla distancia de windonw); rotación vertical = arctan (Ydistancia de windonw)
    7. Torsión se muestra ya en unidades de grados, pero para conformarse con Convención de positividad para el intorsion, si la medición se realiza en el ojo izquierdo, multiplicar por -1. Para el ojo derecho, no multiplicación es necesario. El programa códigos de rotación en sentido horario como positivo.
    8. Trazar el diámetro de la pupila y rotaciones en función del tiempo.

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Resultados

La figura 1 muestra imágenes fijas de imágenes tomadas de un video que describe la disección. Imágenes ofrecen localizaciones típicas de los nervios antes de cortar el cerebro.

figure-results-1
Figura 1: imágenes de imágenes capturadas del vídeo de la disección para mostrar ubicaciones del nervio óptico (nII), nervio oculomot...

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Discusión

Pasos críticos:

Los pasos críticos en este protocolo son los siguientes: 1) la disección y el cuidado para mantener la viabilidad de los nervios seccionados; 2) la correspondencia de los tamaños de los electrodos de succión para los nervios craneales para proporcionar respuestas coherentes; y 3) la colocación de la cabeza en el cardán para proporcionar la calibración adecuada de la rotación del ojo.

Solución de problemas:

La disección puede ser...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Sra. Paulette McKenna y Lisa Pezzino en este estudio para apoyo secretarial y Sr. Phil Auerbach para soporte técnico. Los autores también agradecen los Drs. Michael Ariel y Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) para introducirnos a la preparación principal en vitro aislado. Fondos para apoyo de esta colaboración fue proporcionada por el Departamento de Biología (Robert S. Chase fondo), la Comisión de investigación académica y el programa de Neurociencia en la Universidad de Lafayette. Por último, este trabajo está dedicado al Sr. Phil Auerbach, quien falleció el 28 de septiembre de 2016; había desarmado de un microscopio electrónico de barrido y reconoce la utilidad de su etapa de 5 ejes para el uso de este protocolo. Su amistad y su ingenio se echará de menos enormemente.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tortugas deslizadoras de orejas rojasKons ScientificTrachemys scripta elegansTamaño grande (longitud del caparazón 15-20 cm)
Cloruro de sodioSigma-Aldrich Co. LLC.S5886
Cloruro de potasioSigma-Aldrich Co. LLC.P5405
Corido de magnesioSigma-Aldrich Co. LLC.M7304
Bicarbonato de sodioSigma-Aldrich Co. LLC.S5761
DextrosaSigma-Aldrich Co. LLC.C5767
Ácido clorhídrico concentradoSigma-Aldrich Co. LLC.H7020
Cloruro de calcioSigma-Aldrich Co. LLC.C7902
Medidor de pHOaktonpH 6+
Electrodo de estimulación de succiónA-M Systems573000Electrodo de succión bipolar. Tenga en cuenta que 573000 ha sido reemplazado por 573050.
Vidrio capilarA-M systems626000Vidrio capilar de borosilicato de un solo barril sin microfilamento, longitud 10 cm, diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,50 mm
Electrodo de estimulación de succión alternativoA-M Systems573050Electrodo de succión bipolar. Requiere vidrio capilar de mayor diámetro: 627000, diámetro exterior 1,2 mm, diámetro interior 0,68 mm
EstereoscopioLiecaGZ7Rango de aumento, 10x – 70x
Fuente de luz de fibra ópticaAmscopeHL250-A150W Caja de luz iluminadora de microscopio de fibra óptica
RongeursCarolina Biological Supply Company625654acero inoxidable, resorte recto, 5.25"
Sonda de disección romaCarolina Biological Supply Company627405Sonda del centro comercial Huber, sonda y buscador de doble extremo,
6" Microtijeras CarolinaBiological Supply Company623555Tijeras de microdisección Iris, acero inoxidable, cuchillas de 0.5", 4.75" de largo
Pinzas finasSigma-Aldrich Co. LLC.F6521Pinzas de joyería, dumont No. 5, aleación de acero inoxidable, pinzas curvas de 4.25"
Sigma-Aldrich Co. LLC.Z168696Punta mediana, pinzas curvas, acero inoxidable,
mango de bisturíSigma-Aldrich Co. LLC.S2896Mangos de bisturí, n.º 3, acero inoxidable
Hoja de bisturíSigma-Aldrich Co. LLC.S2771Hojas de bisturí, n.º 11, acero
GuillotinaAparato Harvard73-1918Guillotina Kleine tipo 7575
EspátulaSigmaZ648299Micro cuchara y espátula juego de pesaje. Use una espátula pequeña: 5.9" largo x 0.07" Diámetro del mango con extremo cuadrado: 0.17" x 1.3" largo, otro extremo redondo: 0.17" x 1.27"
GanchoAutozone98069Juego de ganchos y ganzúas SureBilt. Use el molinillo para desafilar las puntas afiladas del gancho para evitar lesiones en la boca de los animales.
95/5% O2/CO2Airgas, Inc.X02OX95C2003102% Mezcla de gases estándar certificada con oxígeno de equilibrio de dióxido de carbono, cilindro de tamaño 200, regulador CGA-296
Airgas, Inc.Y11244D296-AG Regulador decilindro analítico de latón de una sola etapa 0-100 psi CGA-296 con salida de aguja. Utilice una válvula de tubo de línea de aire ajustable de latón para pasar de un tubo de línea de vinilo de 3/8" de diámetro interior conectado al regulador a una conexión de línea de aire de 3/16", de diámetro interior, que va a la pipeta de piedra difusora o de vidrio pasteur.
Válvula de tubo de línea de aire ajustableDoctors Foster and SmithCD-12061 Válvula delatón
Mesa rígidaDesconocidoDesconocido Puertade autoclave colocada encima de una mesa resistente. Nueve pelotas de tenis de 5" de diámetro aíslan las vibraciones de la superficie superior de la mesa.
Pelota de tenis de 5"Petco Animal Supplies, Inc.712868Pelota de tenis Petco Jumbo Pet: las pelotas no están cortadas y se mantienen dentro de un marco integrado en la parte inferior de la puerta del autoclave.
Mesa alternativa de aislamiento de vibracionesNewport CorporationINT1-36-6-N Sistema de control devibraciones rígido, integridad 1: Dimensiones de la superficie, 3' x 6'
GimbalISI, International Scientific Instruments, Inc.Etapa de laetapa excéntrica de 5 ejes EM de escaneo SUPER III-A: X, Y movimientos lineales Z, ± 20 mm, precisión de 0,1 mm; Rotaciones, verticales, ± 10°, y horizontal, ± 12.5°, con 1.25° precisión. Nota: del instrumento de desmantelamiento.
Mandril para cardánDesconocido Desconocidomandril de un viejo micrótomo de fabricación desconocida fue mecanizado para adaptarse al eje del portamuestras del cardán alternativo de la etapa EM de escaneo
ThorLabs, Inc.GN2/M con MBT602/MGoniómetro de doble eje (GN2/M) montado en una platina de microbloque de 3 ejes con ajustadores de tornillo de mariposa (MBT602/M): diseñe un mandril para sujetar la cabeza de tortuga con el ojo a 12,7 mm por encima de la superficie superior del goniómetro (distancia al punto de rotación)
Sistema de seguimiento ocular basado en vídeoArrington Research, Inc.ViewPoint EyeTracker, PC-60 Método deseguimiento: Vídeo infrarrojo con pupila oscura; Cámara en blanco y negro (Artículo BC02): 30 Hz, 640 x 480; Requisitos del sistema: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Rango visual: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Precisión ~0.5°; Resolución espacial ~0.15°; Resolución del tamaño de la pupila ~0,03 mm; Datos oculares: X, Y, posición de la mirada, altura y anchura de la pupila, torsión, tiempo delta, tiempo total y regiones de interés (ROI); Comunicación en tiempo real (artículo 0022): Salida analógica de 4 canales con ocho canales de entrada TTL para marcar códigos en el archivo de datos
Base magnética multiposiciónHerramientas de carga portuariaPittsburg, artículo #5645El soporte magnético alcanza hasta 12" y produce 45 libras de tracción magnética. Úselo para colocar la cámara. La máquina enrosca agujeros en el extremo de la varilla para montar las cámaras.
MicromanipuladorKopf900Manipulación de 5 ejes para el montaje del electrodo de succión: X, Y, Z recorrido lineal, 2 ejes de rotación
Osciloscopio de disección en la plumaLiecaGZ6Rango de aumento, 6,7x – 40x
Estimulador nervioso/muscularAstro-Med Grass TelefactorGrass S88Estimulador de voltaje de doble pulso: dos canales de salida que pueden funcionar de forma independiente o sincronizada para generar pulsos de voltaje constante no aislados (10 mv a 150 V). Los pulsos pueden ser simples (10 μ seg. a 10 s), repetitivos (de 0,01 Hz a 1 KHz) y trenes (de 1 ms a 10 s) y sincronizados con entradas y salidas TTL. Envíe salidas TTL a través de los canales de salida de un conector DB25 a los canales de entrada TTL del ViewPoint EyeTracker. Nota: Astro-Med Grass Telefactor ya no está en el negocio.
Dispositivo de aislamiento de corrienteAstro-Med Grass TelefactorPSIU6Unidad de aislamiento de estímulo de corriente: permite el suministro seguro de corrientes constantes por parte del S88 a la preparación. El PSIU6 se conecta mediante un cable BNC a uno de los canales de salida del S88. Los interruptores multiplicadores del PSIU6 permiten que el S88 genere una amplia gama de amplitudes de corriente que van desde 0,1 y micro; De A a 15 mA.
Estimulador alternativo de nervios/músculos con aislamientoA-M Systems2100Estimulador de pulso aislado: La unidad tiene un aislador incorporado para producir corrientes constantes.
de 4" largo 5 El

Referencias

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