Cinemática ocular midiendo In Vitro la estimulación de los nervios craneales en la tortuga

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar una en vitro aislado tortuga cabeza preparación para medir la cinemática de los movimientos del ojo. Después del retiro del cerebro del cráneo, los nervios craneales pueden ser estimulados con corrientes cuantificar rotaciones y cambios en el tamaño de la pupila.

Resumen

Después de que los animales son sacrificados, los tejidos comienzan a morir. Las tortugas ofrecen una ventaja debido a un tiempo de supervivencia de sus tejidos, especialmente en comparación con los vertebrados de sangre caliente. Debido a esto, se pueden realizar experimentos en vitro en tortugas para largos períodos de tiempo para investigar las señales neuronales y control de sus acciones de blanco. Con una preparación aislada de cabeza, medimos la cinemática de los movimientos oculares en tortugas, y su modulación por señales eléctricas por los nervios craneales. Después de que el cerebro fue quitado del cráneo, dejando intactos los nervios craneales la cabeza disecada fue colocada en un cardán para calibrar los movimientos de los ojos. Electrodos de vidrio fueron atados a los nervios craneales (oculomotor, trochlear y abducens) y estimulada con corrientes para evocar los movimientos de los ojos. Nos vigila movimientos de los ojos con un video infrarrojo de seguimiento sistema y cuantificada de rotación de los ojos. Corriente de pulsos con una gama de amplitudes, frecuencias, y las duraciones del tren fueron utilizadas para observar efectos sobre las respuestas. Porque la preparación se separa del cerebro, la vía eferente va a objetivos musculares puede examinarse aisladamente para investigar señales neuronales en ausencia de la información sensorial procesada centralmente.

Introducción

Justificación para el uso de las tortugas de orejas rojas Slider en experimentos electrofisiológicos:

Resbalador Rojo-espigado tortugas (Trachemys scripta elegans), son considerados uno de los peores de las especies invasoras del mundo¹ y puede indicar que un ecosistema está en problemas. La razón de por qué tienen tanto éxito las tortugas resbalador Rojo-espigado es mal entendida pero en parte puede ser debido a su fisiología tolerante y posesión de los tejidos nerviosos que pueden sobrevivir bajo condiciones hipóxicas^2,3,4....

Protocolo

Nota: Las tortugas resbalador Rojo-espigado, machos y hembras, fueron compradas de un vendedor. Las tortugas fueron alojadas en una suite de animal caliente que contiene dos tinas de 60 galones equipados con islas de ladrillo para asolearse bajo luces infrarrojos 250 W. El ambiente se mantuvo en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10-h con la temperatura del agua a 22 ° C. Luces se enciende a las 6:00 y apagar en 20:00. Los tanques equipados con sistemas de filtración se limpiaron semanalmente y tortugas fueron alimentadas ad libitum con cada otro día. El cuidado del resbalador Rojo-espigado tortugas y todos los siguientes procedimientos experimentales descritos ....

Resultados

La figura 1 muestra imágenes fijas de imágenes tomadas de un video que describe la disección. Imágenes ofrecen localizaciones típicas de los nervios antes de cortar el cerebro.

Figura 1: imágenes de imágenes capturadas del vídeo de la disección para mostrar ubicaciones del nervio óptico (nII), nervio oculomot.......

Discusión

Pasos críticos:

Los pasos críticos en este protocolo son los siguientes: 1) la disección y el cuidado para mantener la viabilidad de los nervios seccionados; 2) la correspondencia de los tamaños de los electrodos de succión para los nervios craneales para proporcionar respuestas coherentes; y 3) la colocación de la cabeza en el cardán para proporcionar la calibración adecuada de la rotación del ojo.

Solución de problemas:

La disección puede ser.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tortugas deslizadoras de orejas rojas	Kons Scientific	Trachemys scripta elegans	Tamaño grande (longitud del caparazón 15-20 cm)
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S5886
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich Co. LLC.	P5405
Corido de magnesio	Sigma-Aldrich Co. LLC.	M7304
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S5761
Dextrosa	Sigma-Aldrich Co. LLC.	C5767
Ácido clorhídrico concentrado	Sigma-Aldrich Co. LLC.	H7020
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich Co. LLC.	C7902
Medidor de pH	Oakton	pH 6+
Electrodo de estimulación de succión	A-M Systems	573000	Electrodo de succión bipolar. Tenga en cuenta que 573000 ha sido reemplazado por 573050.
Vidrio capilar	A-M systems	626000	Vidrio capilar de borosilicato de un solo barril sin microfilamento, longitud 10 cm, diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,50 mm
Electrodo de estimulación de succión alternativo	A-M Systems	573050	Electrodo de succión bipolar. Requiere vidrio capilar de mayor diámetro: 627000, diámetro exterior 1,2 mm, diámetro interior 0,68 mm
Estereoscopio	Lieca	GZ7	Rango de aumento, 10x – 70x
Fuente de luz de fibra óptica	Amscope	HL250-A	150W Caja de luz iluminadora de microscopio de fibra óptica
Rongeurs	Carolina Biological Supply Company	625654	acero inoxidable, resorte recto, 5.25"
Sonda de disección roma	Carolina Biological Supply Company	627405	Sonda del centro comercial Huber, sonda y buscador de doble extremo,
6" Microtijeras Carolina	Biological Supply Company	623555	Tijeras de microdisección Iris, acero inoxidable, cuchillas de 0.5", 4.75" de largo
Pinzas finas	Sigma-Aldrich Co. LLC.	F6521	Pinzas de joyería, dumont No. 5, aleación de acero inoxidable, pinzas curvas de 4.25"
	Sigma-Aldrich Co. LLC.	Z168696	Punta mediana, pinzas curvas, acero inoxidable,
mango de bisturí	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S2896	Mangos de bisturí, n.º 3, acero inoxidable
Hoja de bisturí	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S2771	Hojas de bisturí, n.º 11, acero
Guillotina	Aparato Harvard	73-1918	Guillotina Kleine tipo 7575
Espátula	Sigma	Z648299	Micro cuchara y espátula juego de pesaje. Use una espátula pequeña: 5.9" largo x 0.07" Diámetro del mango con extremo cuadrado: 0.17" x 1.3" largo, otro extremo redondo: 0.17" x 1.27"
Gancho	Autozone	98069	Juego de ganchos y ganzúas SureBilt. Use el molinillo para desafilar las puntas afiladas del gancho para evitar lesiones en la boca de los animales.
95/5% O2/CO2	Airgas, Inc.	X02OX95C2003102	% Mezcla de gases estándar certificada con oxígeno de equilibrio de dióxido de carbono, cilindro de tamaño 200, regulador CGA-296
	Airgas, Inc.	Y11244D296-AG Regulador de	cilindro analítico de latón de una sola etapa 0-100 psi CGA-296 con salida de aguja. Utilice una válvula de tubo de línea de aire ajustable de latón para pasar de un tubo de línea de vinilo de 3/8" de diámetro interior conectado al regulador a una conexión de línea de aire de 3/16", de diámetro interior, que va a la pipeta de piedra difusora o de vidrio pasteur.
Válvula de tubo de línea de aire ajustable	Doctors Foster and Smith	CD-12061 Válvula de	latón
Mesa rígida	Desconocido	Desconocido Puerta	de autoclave colocada encima de una mesa resistente. Nueve pelotas de tenis de 5" de diámetro aíslan las vibraciones de la superficie superior de la mesa.
Pelota de tenis de 5"	Petco Animal Supplies, Inc.	712868	Pelota de tenis Petco Jumbo Pet: las pelotas no están cortadas y se mantienen dentro de un marco integrado en la parte inferior de la puerta del autoclave.
Mesa alternativa de aislamiento de vibraciones	Newport Corporation	INT1-36-6-N Sistema de control de	vibraciones rígido, integridad 1: Dimensiones de la superficie, 3' x 6'
Gimbal	ISI, International Scientific Instruments, Inc.	Etapa de la	etapa excéntrica de 5 ejes EM de escaneo SUPER III-A: X, Y movimientos lineales Z, ± 20 mm, precisión de 0,1 mm; Rotaciones, verticales, ± 10°, y horizontal, ± 12.5°, con 1.25° precisión. Nota: del instrumento de desmantelamiento.
Mandril para cardán	Desconocido Desconocido		mandril de un viejo micrótomo de fabricación desconocida fue mecanizado para adaptarse al eje del portamuestras del cardán alternativo de la etapa EM de escaneo
	ThorLabs, Inc.	GN2/M con MBT602/M	Goniómetro de doble eje (GN2/M) montado en una platina de microbloque de 3 ejes con ajustadores de tornillo de mariposa (MBT602/M): diseñe un mandril para sujetar la cabeza de tortuga con el ojo a 12,7 mm por encima de la superficie superior del goniómetro (distancia al punto de rotación)
Sistema de seguimiento ocular basado en vídeo	Arrington Research, Inc.	ViewPoint EyeTracker, PC-60 Método de	seguimiento: Vídeo infrarrojo con pupila oscura; Cámara en blanco y negro (Artículo BC02): 30 Hz, 640 x 480; Requisitos del sistema: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Rango visual: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Precisión ~0.5°; Resolución espacial ~0.15°; Resolución del tamaño de la pupila ~0,03 mm; Datos oculares: X, Y, posición de la mirada, altura y anchura de la pupila, torsión, tiempo delta, tiempo total y regiones de interés (ROI); Comunicación en tiempo real (artículo 0022): Salida analógica de 4 canales con ocho canales de entrada TTL para marcar códigos en el archivo de datos
Base magnética multiposición	Herramientas de carga portuaria	Pittsburg, artículo #5645	El soporte magnético alcanza hasta 12" y produce 45 libras de tracción magnética. Úselo para colocar la cámara. La máquina enrosca agujeros en el extremo de la varilla para montar las cámaras.
Micromanipulador	Kopf	900	Manipulación de 5 ejes para el montaje del electrodo de succión: X, Y, Z recorrido lineal, 2 ejes de rotación
Osciloscopio de disección en la pluma	Lieca	GZ6	Rango de aumento, 6,7x – 40x
Estimulador nervioso/muscular	Astro-Med Grass Telefactor	Grass S88	Estimulador de voltaje de doble pulso: dos canales de salida que pueden funcionar de forma independiente o sincronizada para generar pulsos de voltaje constante no aislados (10 mv a 150 V). Los pulsos pueden ser simples (10 μ seg. a 10 s), repetitivos (de 0,01 Hz a 1 KHz) y trenes (de 1 ms a 10 s) y sincronizados con entradas y salidas TTL. Envíe salidas TTL a través de los canales de salida de un conector DB25 a los canales de entrada TTL del ViewPoint EyeTracker. Nota: Astro-Med Grass Telefactor ya no está en el negocio.
Dispositivo de aislamiento de corriente	Astro-Med Grass Telefactor	PSIU6	Unidad de aislamiento de estímulo de corriente: permite el suministro seguro de corrientes constantes por parte del S88 a la preparación. El PSIU6 se conecta mediante un cable BNC a uno de los canales de salida del S88. Los interruptores multiplicadores del PSIU6 permiten que el S88 genere una amplia gama de amplitudes de corriente que van desde 0,1 y micro; De A a 15 mA.
Estimulador alternativo de nervios/músculos con aislamiento	A-M Systems	2100	Estimulador de pulso aislado: La unidad tiene un aislador incorporado para producir corrientes constantes.

de 4" largo 5 El