Alto rendimiento, la absoluta determinación del contenido de una proteína seleccionada a nivel de tejido con punto cuantitativo Blot análisis (QDB)

Resumen

Aquí se demuestra un detallado proceso de análisis de cuantitativo dot blot (QDB) determinando el contenido absoluto de una proteína específica, capsulando la proteína actina, gelsolina-como (CAPG), en tres tejidos de ratón diferente. Demostrar un alto rendimiento, técnica de immunoblot conveniente y cuantitativa para la validación de biomarcadores a nivel celular y tejido.

Resumen

Falta un conveniente, método de immunoblot cuantitativa, de alto rendimiento para la determinación absoluta del contenido de una proteína específica a nivel celular y tejido dificulta significativamente el progreso en la investigación proteómica. Resultados derivados de las técnicas de inmunoblot actualmente disponibles son también relativos, evitando esfuerzos para combinar estudios independientes con un análisis a gran escala de las muestras de proteína. En este estudio, demostramos el proceso de análisis de cuantitativo dot blot (QDB) para lograr la cuantificación absoluta en un formato de alto rendimiento. Usando un estándar de proteína disponible en el mercado, somos capaces de determinar el contenido absoluto de capsular proteína actina, gelsolina-como (CAPG) en muestras de proteínas preparados a partir de tres tejidos de ratón diferente (riñón, bazo y próstata) junto con una detallada explicación de los detalles experimentales. Proponemos el análisis QDB como un método de inmunoblot conveniente, cuantitativo de alta rendimiento de cuantificación absoluta de proteínas individuales en el nivel celular y tejido. Este método ayudará sustancialmente a validación de biomarcadores y la verificación de la vía en varias áreas de investigación biológica y biomédica.

Introducción

Junto con los avances emocionantes en la investigación genómica en los últimos años, campo de la investigación biomédica testigos también el importante avance en la investigación proteómica. Con el aumento de acumulación de datos biológicos en tanto genómicos y proteómicos, usando herramientas bioinformáticas para analizar estos datos se ha convertido en el foco de la investigación biomédica en el futuro puedan percibir. En consecuencia, el éxito de la investigación de bioinformatical plantea la demanda de más y mejor calidad de los datos de la comunidad de investigación biológica y biomédica, una tarea sólo puede lograrse a través de adelanto de la técnica en genómica y proteómica.

Espectrometría de masas (MS) y el análisis de immunoblot son actualmente dos técnicas vigentes de análisis de la proteína. MS ha dominado la investigación proteómica en los últimos años para permitir análisis de miles de proteínas individuales al mismo tiempo. Las técnicas basadas en immunoblot, incluyendo western blot y dot blot, por el contrario, han también desempeñado un papel importante en la investigación de proteína incluso desde su invención^{1,2,3,4, 5}. Enzima ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo^5,6,7 y fase inversa proteína microarrays (RPPM)^8,9 se puede considerar el formato de alto rendimiento de immunoblot Análisis. Sin embargo, todos estos métodos de inmunoensayo, excepto ELISA, medir el nivel de expresión relativa de una proteína específica. La naturaleza relativa de estos métodos se convertirá en un verdadero problema para los estudios de población, como el análisis debe hacerse al mismo tiempo, evitando cualquier esfuerzo para aumentar el tamaño de la piscina a través de múltiples análisis. Además, los resultados derivados de estos estudios sólo son semi-cuantitativo, complicando así los esfuerzos de la Bioinformática en el análisis de datos. Mientras tanto, aunque ELISA está bien adaptado para el análisis absoluto de alto rendimiento de muestras de proteínas, esta técnica parece que retos en entornos complejos como las células o los tejidos debido a su baja capacidad y multiplexación¹⁰.

Hemos desarrollado un método de inmunoblot adecuado para estudios de población con las características de ser conveniente, alto rendimiento, cuantitativo y conveniente para la determinación absoluta del contenido de proteínas y nombre de esta técnica cuantitativa punto la mancha blanca /negra Análisis (QDB)¹¹. En este estudio, presentamos un protocolo detallado para el análisis QDB y demuestran el método de determinación del contenido de proteína absoluta de una proteína específica, CAPG, en tres tejidos de ratón diferente incluyendo próstata, riñón y bazo. Creemos que este protocolo detallado bien ilustra la factibilidad y conveniencia de este método y proporcionar orientación sobre cómo evitar las trampas posibles en la práctica de este método.

Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron llevadas a cabo en consonancia con la Directiva de uso de Binzhou médica Universidad Animal y aprobados por la Junta de revisión ética de la Universidad médica de Binzhou.

1. preparación de la muestra

1. Tomar tejido de ratón 50 mg en un tubo de 1,5 mL. Añadir 200 μL de tampón de lisis (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 10 m m de Na₂P2O₇, 1% Tritón X-100, glicerol al 10%), suplementado con los inhibidores de la proteasa y fosfatasa (NaF, phenylmethylsulfonyl 0,1 mM 100 mM fluoruro, 5 μg/mL pepstatin, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinina).
2. Homogeneizar el tejido con un homogenizador durante 1 min en hielo.
3. Centrifugar 10 min a 8 000 x g a 4 ° C.
4. Recoger el sobrenadante en tubos nuevos (1.5 mL) y sacar 1 μL para el ensayo de concentración de proteína con kit de BCA.
   Nota: Todos los búferes de lisis utilizado para análisis de western blot y Dot blot se pueden utilizar para el análisis QDB.

2. determinar la especificidad del anticuerpo

1. Preparan muestra lisados (20 μg) en la sección 1.4, BSA libre de IgG (20 μg), proteína estándar (pg 600), para el análisis de western blot.
   Nota: IgG BSA libre se utiliza como un control negativo y la proteína estándar se utiliza como control positivo. La especificidad del anticuerpo se demuestra mostrando una banda de tamaño adecuado mediante el análisis de western blot.

3. definir el rango lineal del análisis QDB

1. Disolver la proteína estándar con ddH₂O. diluir la proteína a una concentración de 1.200 pg/μl.
2. Diluir el concentrado proteína de las muestras preparadas en sección 1.4 a 4 μg/μl.
3. Disolver la BSA con ddH₂O. diluir la proteína a una concentración de 4 μg/μl y de 1.200 pg/μl.
4. Se prepararon una serie de dilución de la proteína estándar y muestras preparadas con la dirección de la tabla 1 y tabla 2.
5. Mezclar 10 μl dilución estándar proteína o dilución preparado muestras y 10 μl de 2 x de buffer de carga (120mM Tris-HCl de pH 6.8, de 20% glicerol, 4% SDS, 0.2% azul de bromofenol, 200 mM DTT) juntos.

	S1 (0pg/μL)	S2 (33.3pg / μL)	S3 (100pg/μL)	S3 (300pg/μL)	S5 (600pg/μL)	S6 (1200pg/μL)
protein(1200pg/µl) estándar	0	1.39	4.17	12.5	25	50
BSA libre de igG (4pg/μL)	50	48.61	45.83	37.5	25	0
total	50	50	50	50	50	50

Tabla 1. Esquema de dilución para la curva estándar de proteína.

	X1 (0µg/μL)	X2 (0.25µg / μL)	X3 (0.5µg / μL)	X4 (1μg/μL)	X5 (2µg/μL)	X6 (4 μg/μl)
Sample(4µg/µl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
IgG BSA(4µg/µl) gratis	50	46.875	43,75	37.5	25	0
total	50	50	50	50	50	50

Tabla 2. Esquema de dilución para muestras preparadas

6. Calentar las mezclas a 85 ° C durante 5 minutos.

4. proceso de análisis QDB

1. Aplicación de ejemplo
   1. Apoyar la placa QDB para evitar que la parte inferior de la placa de contacto con la superficie de la mesa. Por ejemplo, utilice una caja de punta de la pipeta vacía como apoyo.
   2. Carga hasta 2 μl de la muestra al centro de la membrana en la parte inferior de la unidad individual de la placa QDB.
2. La placa de secado
   1. Deja la placa cargada de QDB durante 1 hora en sitio templado (RT) o como alternativa dejar cargada la placa a 37 ° C durante 15 min en un espacio bien ventilado.
3. Bloqueo de la placa
   1. Sumergir la placa QDB en el tampón de transferencia (0,039 M glicina, 0,048 M Tris, 0.37% SDS, el alcohol metílico 20%) y agitar suavemente la placa por 10 s.
   2. Lavar la placa QDB suavemente con TBST (Tris-buffer salina, 0,1% Tween 20) tres veces y luego lavar la placa por 5 min en TBST bajo agitación constante.
   3. Bloquear la placa QDB con solución amortiguadora de bloqueo (5% de leche descremada en TBST (100 μL/pocillo) durante 1 hora bajo agitación constante.
4. Incubación del anticuerpo primario
   1. Diluir el anticuerpo primario en el amortiguador de bloqueo en una concentración elegida (entre 1:500 y 1:5 000) y añadir 100 μl a cada pozo individual de una placa bien 96 ordinaria. Inserte la placa QDB en el 96 placa bien e incubar las placas combinadas ya sea por 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C bajo agitación constante.
   2. Alternativamente, coloque la placa QDB dentro de una caja y llene la caja con solución amortiguadora de bloqueo 2 a 3 mm por encima de la porción de la membrana de la placa si el mismo anticuerpo se utiliza para la placa entera. Añadir el anticuerpo primario en la concentración solicitada e Incube la placa ya sea por 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C por bajo agitación constante.
   3. Lavar la placa con TBST tres veces antes de que se lava con TBST por tres veces, cada vez durante 5 minutos bajo agitación constante.
5. Incubación del anticuerpo secundario
   1. Diluir el anticuerpo secundario en la solución amortiguadora de bloqueo en la concentración solicitada (de 1:1, 000 a 1:50, 000) y cualquier alícuota 100 μL/pocillo en una placa bien 96 o en una caja tal como se describe en la sección 4.4.2 y entonces Incube la placa QDB dentro ya sea 96 pla bien cargado te o la caja por 1 h a temperatura ambiente en agitación constante.
   2. Lavar la placa QDB suavemente 3 veces con TBST, luego lavar la placa para 3 veces, 5 minutos cada uno con TBST bajo agitación constante.
6. Cuantificación
   1. Preparar sustrato quimioluminescencia realzada (ECL) siguiendo las instrucciones del fabricante.
   2. Sustrato de alícuota ECL en un 96 placa bien (100 μL/pocillo) e inserte la placa QDB dentro de la placa bien 96 por 2 min en agitación constante.
   3. Retire la placa QDB de la 96 placa bien y agitar brevemente para eliminar el exceso de líquido. Coloque la placa sobre una placa de microtitulación blanco.
   4. Encienda el lector de microplacas y seleccione "placa con tapa" en la interfaz de usuario antes de colocar las placas combinadas (QDB placa + adaptador placa blanca) dentro del lector de microplacas para la cuantificación.
      Nota: Asegúrese de utilizar la placa de microtitulación blanco, no transparente como un adaptador para evitar cualquier interferencia de la placa. Asegúrese de elegir "placa con tapa" para evitar el bloqueo de la máquina cuando se combinan placas (QDB placa + 96 placa bien el adaptador) se colocan dentro del lector de microplacas.

Resultados

La determinación de la cantidad absoluta de cualquier proteína como la proteína CAPG en tejidos de ratón requiere un anticuerpo específico y una proteína purificada como estándar. La gama linear de los análisis de la proteína estándar y los lisados también necesita ser establecida antes de cualquier análisis a gran escala. La gama linear del anticuerpo es altamente dependiente de los anticuerpos por sí, y la gama de dilución de un anticuerpo específico que deba ser verificada por cada usuario individual.

Primero determinamos la especificidad del anticuerpo CAPG en riñón de ratón, tejidos de bazo y de la próstata mediante análisis de western blot con el control negativo (IgG de BSA libre) y control positivo (proteína disponible en el mercado de CAPG) (figura 1A). El anticuerpo anti-CAPG fue específico contra lisados de bazo de ratón, corazón, músculo y de la próstata (una banda detectada). No específico bandas fueron observadas en lisados de riñón y hígado. Sin embargo, en riñón lisado, las bandas no específicos fueron significativamente más débiles que la banda específica, que sugiere que el anticuerpo es conveniente para el análisis del tejido renal. A continuación, la gama linear de la proteína estándar y la cantidad de lisados de análisis fueron determinados por dos curvas de dosis de lado a lado. Una proteína CAPG comercialmente disponible se diluyó en serie como se indica en la tabla 1 , basada en nuestras experiencias previas y los lisados de tejidos de riñón de ratón, bazo y la próstata también se diluyeron basado en la cantidad de proteína total en los lisados determinados por un kit de determinación de proteína total de BCA. Dos estudios de dosis realizaron al lado del otro y juntos trazan en figura 1B. La cantidad apropiada de lisados de próstata, el bazo y el riñón de ratón fueron seleccionados en base a las señales QDB medidas por el lector de microplacas en unidad arbitraria. La lectura original para este experimento se muestra en la tabla 3.

En el último paso, el estándar de proteína CAPG diluido en serie y los lisados de riñón de ratón, bazo y próstata fueron cargados en la placa QDB. En este caso, elegimos carga 0,3 μg/muestra para lisados de bazo y de riñón de ratón y 1 μg/muestra para lisados de análisis de la próstata del ratón, como en estos niveles, la lectura de QDB fue menos 20-fold sobre el fondo mientras que dentro de la gama linear del análisis basado en la curva de dosis de los lisados y la proteína estándar. La placa fue sometida al Protocolo de QDB descrito antes de que la placa se cuantificó directamente por el lector de microplacas. Usando la proteína purificada diluida en serie de CAPG, podríamos establecer una curva de dosis-respuesta la ecuación y R2 por análisis de regresión simple utilizando el software disponible (por ejemplo, Microsoft office excel). Señales de la QDB de lisados de riñones de ratón, bazos y próstatas fueron convertidos a la cantidad absoluta de CAPG proteína en estos lisados utilizando la ecuación establecida y los resultados fueron corregidos por la cantidad de proteína total, en este caso, 0,3 μg para lisados de bazos de ratón y los riñones y 1 μg de lisados de la próstatas de ratón, para la concentración final de proteína CAPG en estos tejidos como pg/μg. Los resultados se muestran en la figura 1C con la lectura original se muestra en la cuadro 4.

Figura 1 . Resultado representativo de un análisis QDB para determinar los niveles CAPG absolutos en tres tejidos de ratón (bazo, riñón y próstata). A. examinar la especificidad de anticuerpos anti-CAPG usando lisados de tejidos de ratón preparado a partir de bazo, corazón, músculo, riñón, hígado y próstata mediante western blot análisis con el control positivo y control negativo (IgG de BSA libre) (comercialmente proteína CAPG disponible). B. definir el análisis linear gama de QDB de anticuerpos anti-CAPG usando lisados de próstata, riñón, bazo y usando purificaron recombinante proteína CAPG estándar. Los resultados fueron un promedio de triplicados. C. absoluta determinación de los niveles CAPG en lisados de próstata, bazo y riñones de ratón. Cada barra representa un tejido de un ratón individual. Los resultados fueron la media de triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 3: Resultado de lector de microplacas de los estudios de dosis utilizando ambos diluidos en serie, los lisados de bazos de ratón, riñones, próstata y proteínas recombinantes purificadas del CAPG.

Tabla 4: Resultado de lector de microplacas del análisis del nivel absoluto de CAPG QDB en riñones de ratón (8), bazo (4) y próstata (5) utilizando una proteína recombinante de CAPG como estándar.

Discusión

Entre todas las actuales inmunoensayo disponibles técnicas de análisis de la proteína excepto ELISA, QDB análisis es el único método para alcanzar el contenido absoluto de una proteína específica a nivel celular y tejido en un formato de alto rendimiento. Aunque con el estándar marcado con el isótopo estable, espectrometría de masas es capaz de lograr la cuantificación absoluta de algunas proteínas, este método todavía no está diseñado para alto rendimiento. En este estudio, hemos demostrado el proceso de análisis QDB para lograr la absoluta determinación del CAPG nivel de proteína en tejidos de ratón incluyendo la próstata, riñón y bazo. Niveles CAPG se encontraron entre 200 y 360 pg/g en los tejidos de riñón de ratón, 460 a 650 pg/g en bazos de ratón y 330 a 390 pg/g en los tejidos de próstata del ratón.

Comparado con el ELISA, QDB análisis requiere esfuerzos mínimos a desarrollar en un laboratorio normal. En primer lugar, la placa QDB está basado en una membrana de nitrocelulosa para eliminar el paso de la capa de ELISA. En segundo lugar, el análisis QDB sólo requiere uno en vez de dos anticuerpos específicos en un sandwich ELISA. En tercer lugar, la alta capacidad de la membrana de nitrocelulosa en comparación con la superficie de la placa de ELISA también permite que la membrana soportar los pasos de lavado riguroso suele utilizados en el análisis de immunoblot para reducir la interferencia de fondo. Esta característica es muy útil para analizar la complicada lisados de células y tejidos. Por el contrario, debido a la capacidad relativamente baja de placas de ELISA, la reducción del fondo al analizar complicadas Lisados celulares y tejido se convierte en un verdadero desafío en el proceso de desarrollo.

Análisis QDB pueden ser adoptada fácilmente en cualquier laboratorio con el acceso de un anticuerpo específico. Sin embargo, es importante mencionar que la especificidad del anticuerpo es un término relativo, limitado por factores como la especie, tipos de tejidos y tipos celulares. Como se muestra en la figura 1A, CAPG anticuerpo es específico al análisis de lisado de próstata, el bazo y el riñón de ratón y todavía se convierte en no específicos al analizar el hígado del ratón. De hecho, habitualmente encontramos un anticuerpo que específico para el tipo de un tejido, pero no siempre específico a otro tipo de tejido de la misma especie. Así, mancha blanca /negra occidental previo análisis es necesario para asegurar la especificidad de los análisis QDB. De hecho, la relativa especificidad del anticuerpo puede ser la causa de resultados falsos a menudo asociados con el análisis de ELISA, que no importa cuánto esfuerzo la empresa puede haber pasado para asegurar la especificidad de la prueba, no escape el posible tipos de muestras los usuarios pueden optar por analizar utilizando sus productos de ELISA.

Como con todos los inmunoensayos, un problema potencial con el método de análisis QDB es la falta de consistencia de la calidad de los anticuerpos comerciales. Aunque la calidad aparente de un anticuerpo de la misma empresa (mismo catálogo número, etc.) se utiliza, puede haber grandes diferencias de una compra a otro debido a la variabilidad de lote a lote. Por lo tanto, salvo que haya alcanzado la plena confianza en la calidad de los anticuerpos disponibles, volver a caracterizar el anticuerpo sobre cada compra es importante.

En Resumen, le ofrecemos aquí un protocolo detallado y un ejemplo al utilizar el método de análisis QDB para lograr absoluta determinación cuantitativa de una proteína específica en el nivel de tejido. Nos muestran que el método de análisis QDB es una herramienta conveniente para cualquiera que esté interesado en alto rendimiento, el análisis de immunoblot cuantitativa. Su capacidad para lograr la absoluta determinación del contenido de una proteína específica a nivel celular y tejido también distinguir esta técnica de inmunoblot tradicionales técnicas. Esta característica permite la combinación y la comparación de los resultados de múltiples análisis, un paso necesario especialmente en estudios más amplios de la población y la realización de estudios de la Asociación pertinente en el nivel de proteína en un futuro cercano.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lector de microplacas	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB	plate Yantai Zestern Co.Ltd		Las placas están disponibles a pedido para fines de verificación, ya sea por correo electrónico o visitando www.zestern.net.
Peroxidasa AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, gp, sy hms, hrs, hu, ms, rata, shp sr prot)	jackson	711-035-152
Sustrato de quimioluminiscencia mejorada	Thermo	32134
Rabbit anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
Proteína CAPG	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin Special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Reactivo Químico Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo prueba de medicina china	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glicerol	Sigma	G7757
fenilmetilsulfonilo fluoruro Sigma		P7626-5G
pepstatina	Sigma	Z290033
leupeptina	Sigma	L2884
aprotinin	Sigma	A3428
Tris-HCl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920