Artículo de método

In situ detección Molecular de fitopatógenos transmitidos por el suelo mediante un sistema PCR en tiempo real Portable

DOI:

10.3791/56891

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23 de febrero de 2018

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1Department of Plant Pathology, Washington State University, 2Parma Research and Extension Center, University of Idaho

En este artículo

Resumen

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Detección rápida y precisa de agentes patógenos in situ, especialmente transmitidas por el suelo fitopatógenos, es crucial para prevenir aún más la producción de inóculo y la proliferación de enfermedades de plantas en el campo. El método desarrollado aquí usando un sistema de detección de PCR en tiempo real portátil permite diagnóstico in situ en condiciones de campo.

Resumen

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Diagnóstico in situ de enfermedades de plantas puede ser una herramienta útil para los productores de decisiones oportunas que permiten la implementación anterior de estrategias de manejo de la enfermedad que reducen el impacto de la enfermedad. Actualmente en muchos laboratorios de diagnóstico, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR en tiempo real especialmente, es considerado el método más sensible y exacto para la detección de patógenos de plantas. Sin embargo, PCRs en laboratorio normalmente requieren de equipo de laboratorio costoso y personal especializado. En este estudio, se utilizan agentes patógenos transmitidos por el suelo de la papa para demostrar el potencial para la detección molecular in situ. Esto fue alcanzado usando un protocolo rápido y sencillo que comprende magnética basada en grano de extracción, PCR en tiempo real portable (ensayo basada en sondeos fluorógenos). El método PCR en tiempo real portable comparado favorablemente con un sistema basado en el laboratorio de, detectar tan solo 100 copias de DNA de Spongospora subterranea. El método PCR en tiempo real portable desarrollado aquí puede servir como una alternativa a los enfoques de laboratorio y de utilidad in situ para el diagnóstico de patógenos.

Introducción

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Identificación precisa y rápida de los patógenos causales significativamente afecta a decisiones relativas al manejo de la enfermedad de planta. Enfermedades transmitidas por el suelo son particularmente difíciles de diagnosticar porque el ambiente del suelo es extremadamente grande en relación con la planta de masa y compleja, lo que es un desafío para entender todos los aspectos de las enfermedades transmitidas por el suelo. Por otra parte, las enfermedades transmitidas por el suelo pueden ser asintomáticas durante las primeras etapas de la infección, depende de factores ambientales estresantes, y algunas tienen largos períodos de latencia que resultan en la diagnosis retrasada1. Muchos patógenos de suelo han desarrollado estructuras de supervivencia, tales como esporas especializadas o melanized hifas, que pueden sobrevivir en el suelo durante muchos años incluso en la ausencia de sus hospedadores. Enfoques utilizados para el manejo de enfermedades transmitidas por el suelo incluyen: evitar conocidos campos infestados usando semillas certificadas libres de patógenos y plantas, manteniendo equipos sanitarios y restringir el movimiento de suelo y agua cuando sea posible. Conocimiento de la presencia del patógeno a través de estrategias de detección molecular también puede desempeñar un papel útil de informar decisiones oportunas con respecto a los tratamientos de la temprano-etapa o pre-evaluaciones de los campos de la planta. Pruebas in situ proporciona ventajas adicionales de proporcionar un resultado rápido sin enviar la muestra a un laboratorio de diagnóstico que quizás cierta distancia ausente y también puede comprometer al cultivador si dicho diagnóstico es realizan 'lado del campo' en su presencia.

Para el diagnóstico in situ basado en la detección molecular, sensibilidad, especificidad, robustez (repetibilidad y reproducibilidad) y eficiencia (es decir., rendimiento de simplicidad y costo) son factores cruciales para su consideración. Lateral aparatos de flujo (LFDs) Immunostrip como PocketDiagnostic, son métodos populares para la detección del patógeno in situ debido a su simplicidad como un ensayo de un solo paso. Sin embargo, LFDs no puede ser la herramienta de diagnóstico correcto en todas las situaciones porque carecen de la sensibilidad y especificidad y de vez en cuando ofrece resultados ambiguos si el patógeno objetivo está en bajas concentraciones y puede cruz-reaccionar con especies o géneros similares 2. amplificación isotérmica mediada lazo (lámpara) también es aplicable para la detección de patógenos in situ y es particularmente barata reactivos de bajo costo, las condiciones de reacción se mantienen constantes y simple análisis visual colorimétrico. Sin embargo, lámpara y LFDs se utilizan típicamente cualitativo, aunque ambos enfoques pueden usarse cuantitativamente con equipos más caros3. La reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) ofrece alta especificidad, alta sensibilidad y una capacidad cuantitativa en comparación con los ya mencionados métodos de detección. Sin embargo, la tecnología PCR convencional basada en laboratorio requiere equipo de laboratorio costoso y personal especializado, que es una gran desventaja en la adopción de esta tecnología como un método de detección con fines in situ.

En este protocolo, se demostró un método de diagnóstico in situ mediante un instrumento portátil de PCR en tiempo real. Tecnología PCR en tiempo real ofrece ventajas sobre otros métodos en cuanto a la precisión cuantitativa, sensibilidad y versatilidad y ha sido ampliamente utilizada para la detección de una amplia gama de planta patógeno4,5, incluidos varios patógenos de la papa en el suelo6. Debido a las recientes tendencias del mercado competitivo, rápido crecimiento, equipo necesario para la tecnología de PCR ha continuado desarrollando para ser más compacto y menos costoso7. El protocolo se compone de los siguientes pasos: magnética basada en grano de extracción, PCR en tiempo real portable (ensayo basada en sondeos fluorógenos) y análisis de datos cuantitativos que se pueden todos hacer remotamente usando un ordenador portátil (figura 1).

Utilizando el protocolo PCR portátil desarrollados aquí, las muestras de suelo fueron analizadas para detectar los patógenos transmitidos por el suelo, Spongospora subterranea. Spongospora fue elegido ya que es un patógeno importante de patata como el agente causal de la sarna polvorienta8. En las últimas décadas, se considera que la presencia de esta enfermedad se han extendido a muchas regiones donde las papas se cultivan9,10. Sarna polvorienta, con la presencia de espinillas como lesiones en los tubérculos puede causar pérdidas de rendimiento cualitativo considerable a los cultivadores de patata. Además, S. subterranea puede vector Potato Mop Top Virus (PMTV), que pueden causar síntomas de lesión interna en tubérculos (conocidos como spraing)11,12. Por lo tanto, es importante saber si S. subterranea está presente en campos antes de plantar6. También demostramos la utilidad de este protocolo para la detección de Rhizoctonia solani 3 Grupo de Anastomosis (AG3) y PMTV. Aunque varios grupos de anastomosis de Rhizoctonia solani causan enfermedades en papas, AG3 es posiblemente el más importante a nivel mundial13, provocando cancro de tallo y caspa negra dando por resultado pérdidas de rendimiento de hasta un 30%14. PMTV causa lesiones necróticas en los tubérculos, que son comúnmente llamados spraing. Este virus se ha divulgado recientemente por primera vez en varios Estados en el noroeste del Pacífico15,16,17y es de creciente preocupación para los productores en esta región cada vez más importante de la patata. Además de determinar la eficacia de la PCR portátil para estas enfermedades importantes, DNA extracción suelo y metodología muestra tamaño óptimo también fueron investigados en este estudio.

Los resultados sugieren que el método PCR portátil es versátil y aplicable para la detección de diferentes patógenos. El método de detección en el sitio que desarrollamos puede permitir que a los trabajadores de primera línea en la agricultura (p. ej., agricultores) anteriores decisiones relativas al manejo de la enfermedad, tales como selección de la variedad o rotaciones y puede cuantificar un patógeno de la planta en la muestra durante un estudio de campo, antes de la siembra, para evitar posibles brotes de enfermedades.

Protocolo

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1. in situ detección Molecular de patógenos mediante un sistema portátil de PCR en tiempo real

Nota: Vea la figura 1.

  1. Extracción de ADN basados en grano magnética
    Nota: Un magnético basado en grano DNA kit de extracción (por ejemplo de Primerdesign) fue utilizado según las instrucciones del fabricante. Todos los reactivos deben almacenarse a temperatura ambiente (18-25 ° C). Una vez que se suspende la proteinasa K liofilizada (botella n º 1) (con botella No.1a), almacenar a-20 ° C.
    1. Mezclar 20-50 mg de muestra de suelo con 500 μl de solución de preparación de la muestra en un microtubo.
      Nota: La proporción de suelo: preparación de solución es importante como mezcla en otras proporciones puede provocar una falla en experimentos posteriores (por ejemplo, la contaminación por los inhibidores de PCR).
    2. Moler el suelo en la parte inferior del tubo con un pequeño mortero estéril hasta que la solución está turbia. Además suspender las partículas de suciedad en la solución agitando el microtubo y dejar reposar, dejar el suelo partículas asentarse completamente (normalmente entre 5 a 10 min.).
    3. Transfiera 200 μL de sobrenadante a un microtubo fresco y añadir 200 μL de tampón de lisis (botella n ° 2: solución de clorhidrato de la guanidina) y 20 μl de proteinasa K (botella n º 1).
    4. Homogeneizar el lisado por inversión del tubo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
      Nota: Si el lisado se encuentra en la tapa de microtubo, golpee el tubo o una centrifugadora, si está disponible para extraer la tapa.
    5. Añadir 500 μl de la mezcla de grano amortiguamiento magnético de enlace (botella No.3) a las muestras sometidas a lisis. Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos el portatubos magnético.
      Nota: Asegúrese de mezclar la solución de grano bien antes de usarlo para asegurarse de que los granos son alícuotas uniformemente de la botella de almacenamiento.
    6. Colocar los microtubos en el portatubos magnético. Esperar al menos 2 minutos o hasta que todos los granos en el microtubo fije a la pared del lado magnético. Entonces, retire y deseche todo el sobrenadante mediante pipeteo.
      Nota: Remover y aspirar el sobrenadante, no molestar los granos magnetizados. ADN ya ha sido capturado por las bolas magnéticas.
    7. Retire el microtubo el portatubos magnético, agregar 500 μl de tampón de lavado-1 (botella n º 4: solución de sodio perclorato y etanol) y vuelva a suspender las cuentas mediante pipeteo repetido hasta que los granos están uniformemente dispersos. Realizar este paso de lavado para eliminar proteínas y sal de la muestra. Deja la mezcla reposar 30 s.
    8. Repetir el punto 1.1.6.
    9. Retire el microtubo el portatubos magnético, agregar 500 μl de tampón de lavado-2 (botella n º 5: solución de sodio perclorato y etanol) y resuspender los granos mediante pipeteo repetido hasta que los granos están uniformemente dispersos. Deja la mezcla reposar 30 s.
    10. Repetir el punto 1.1.6.
    11. Retirar el portatubos magnético de microtubo y luego agregar 500 μl de etanol al 80% (botella No.6).
      Nota: Este paso es necesario para la eliminación de las sales residuales de la muestra.
      1. Vuelva a suspender las cuentas mediante pipeteo repetido hasta que los granos están uniformemente dispersos. Que esta posición por 10 min con ocasional mezcla por inversión.
    12. Repetir el punto 1.1.6.
    13. Secar el sedimento de grano magnético durante 10 min a temperatura ambiente con la tapa de microtubo abierta.
      Nota: Los granos deben estar libres de cualquier etanol residual visible pero no completamente seca.
    14. Retirar el portatubos magnético de microtubo, añade 50-200 μL de tampón de elución (botella No.7) y vuelva a suspender las cuentas mediante pipeteo repetido hasta que los granos se dispersan uniformemente y dejaron reposar por 30 s.
      Nota: En los pasos anteriores, se libera el ADN purificado de las bolas magnéticas en el tampón de elución.
    15. Colocar los microtubos en el portatubos magnético. Esperar al menos 2 minutos o hasta que todos los granos en el microtubo fije a la pared del lado magnético.
    16. Transferir el sobrenadante que contiene ahora el ADN/ARN purificado en un microtubo de 0,5 mL para su uso en los pasos posteriores.
  2. PCR en tiempo real portable
    Nota: Un termociclador portable y el kit de ensayo PCR fueron utilizados según las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de materiales).
    1. Abrir y ejecutar el software asociado de Termociclador, seleccione prueba de detección de objetivo y toda la información de descripción en los campos de entrada de datos nombre y detalles, notas, muestras y pruebas de entrada.
      Nota: Pozos #1 y #2 se señalan por el software para el control negativo y control positivo, respectivamente.
    2. Preparar antes reactivos PCR. Transferir 500 μl del buffer de resuspensión de master mix en la mezcla de maestro liofilizado que contienen tubo y mezclar bien por inversión. Transferir la mezcla principal toda en el microtubo marrón etiquetado cartillas/sonda (tabla 2).
      1. La tapa y agite el microtubo para mezclar. Mezcla completa es necesaria para asegurar que todos los componentes nuevamente suspenden completamente. Deja esta mezcla reposar 5 minutos antes de su uso.
        Nota: Guarde la mezcla de reacción a-20 ° C después de su uso.
    3. Preparar un control negativo por transferir 10 μl de la mezcla de reacción preparada desde el paso anterior en un tubo PCR de 0.2 mL y añadir 10 μl de agua desionizada estéril libre de nucleasas.
    4. Preparar un control positivo por transferir 10 μl de la mezcla de reacción preparada desde el paso 1.2.2 en un tubo PCR de 0.2 mL y añadir 10 μl de plantilla de control positivo.
    5. Para cada muestra, transferir 10 μl de la mezcla de reacción preparada en el paso anterior en un tubo PCR de 0.2 mL y agregue 10 μl de DNA de la muestra preparada en el paso 1.1.16.
    6. Cargar los pozos del termociclador con el contenido de sus respectivos tubos PCR como se describe en el paso 2.1.1.
    7. Una vez que toda la información necesaria ha sido ingresada y confirmado, seleccione Inicio ejecutar y elegir el instrumento conectado por ethernet o una unidad USB.
      Nota: Si está seleccionada una unidad USB, el archivo ejecutado debe guardarse en el disco para ser utilizado con el termociclador (e.g., F:\genesig). La carrera comenzará inmediatamente después de que el disco se inserta en el termociclador.
  3. Análisis de los datos de la PCR en tiempo real portable.
    1. Una vez finalizado el plazo, abra el archivo de ejecución (.usb) desde la unidad USB con el software asociado de Termociclador o ver directamente los resultados de ejecución en el software haciendo clic en resultados.
    2. Antes de analizar los resultados, excepto el plazo terminado para evitar perder datos.
    3. En la ficha resultados , ver el estado del funcionamiento, categorizados por muestras.
      Nota: Datos que pueden obtenerse en esta ficha son el estado de resultados y copia número detectado en la muestra.
    4. Haga clic en la pestaña detalles para ver las curvas de amplificación. Cuando el objetivo es detectado correctamente, se muestran valores de Cq (ciclo de cuantificación) del objetivo y control interno.
      Nota: Estos valores son calculados en el informe final y se utilizan para determinar si una muestra es positiva para el destino y si hay problemas con la reacción o las muestras de ADN.

2. otros protocolos

  1. Métodos de extracción de ADN basada en laboratorio alternativos
    1. Métodos basados en CTAB-fenol-cloroformo
      1. Realizar métodos de CTAB-fenol-cloroformo basado, siguiendo el método Doyle del18 y el método Dellaporta del19 como se describió anteriormente.
    2. Método de preparación mini ADN
      Nota: El método de Edwards20 se realizó como sigue.
      1. Añadir 500 mg del suelo, seguida de cinco granos de cerámica de 1.4 mm y 750 μl de tampón de Edwards (200 mM Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) a un microtubo y mezcle bien.
      2. Incubar el microtubo a 65 ° C durante 5 minutos.
      3. Homogeneizar la muestra con un homogeneizador de batidor de grano de 60 s (o utilizando un mortero y una maja).
      4. Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 5 minutos.
      5. Transferir 500 μl del sobrenadante a un microtubo fresco y luego mezclar con 500 μl de isopropanol frío. Mezclar por inversión del tubo 10 veces.
      6. Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 15 min granular el ADN.
      7. Decantar el sobrenadante y deje que el ADN pellets aire seco a temperatura ambiente hasta que se evapore el etanol restante.
      8. Lavar el pellet de ADN con 750 μl de etanol frío al 70%.
      9. Secar el pellet antes de volver a suspender en 50-100 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 y 1 mM EDTA).
    3. Otros métodos alternativos
      1. Realizar la extracción de ADN de silicona-base usando el juego #1 (MP BIO Fast ADN centrifugado) y kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) según las instrucciones del fabricante.
  2. PCR en tiempo real basado en el laboratorio convencional.
    Nota: Se utilizó un termociclador convencional con mastermix para PCR basada en sondeos, varios cebadores y sondas de oligonucleótidos (tabla 2).
    1. Mediante PCR de fondo no transparente tubos o una placa PCR, preparar 20 reacciones μL para todas las muestras de ADN a analizar, así como un negativo de control (agua desionizado libre de nucleasas) y un control positivo plantilla preparada en casa.
    2. Para cada PCR tubo o bien, preparar una mezcla incluyendo 10 μl de la mastermix, 7 μl de agua desionizada libre de nucleasa, 2 μl de 2 μm de primers/sonda y 1 μl de muestra de ADN (de paso 1.1.16 o 2.1) o plantilla de control, por ejemplo.
    3. Cerrar los tubos PCR o la placa y comenzar la reacción seleccionando el apropiado programa PCR.
  3. Análisis de datos de PCR en tiempo real basado en el laboratorio convencional
    1. Utilizar software de asociados de Termociclador para analizar los resultados del termociclador convencional. Para comenzar el análisis de datos, transferir el archivo ejecutado desde el termociclador a una unidad USB, inserte una unidad USB y selecciona exportar.
    2. Abierto el archivo de datos (.pcrd) de la exportación se ejecutan en el software asociado de termociclador.
    3. Destacan el pozo de una muestra ubicando su correspondiente bien en el instrumento. Automáticamente se generan curvas de amplificación y curvas estándar (si corresponde). Si no se introduce la información de muestra, haga clic en Configuración de la placa o una función similar para iniciar la entrada de datos antes de analizar los datos.
    4. Ver los datos de la ficha de cuantificación; Esto se puede exportar para el análisis de datos con un software de terceros como lectores de archivos CSV, XML o HTML.
    5. Obtener datos de Cq basados en los umbrales determinados y comparar con los controles positivos y negativos.
      Nota: Si las normas de la DNA de la blanco fueron utilizadas en el análisis, comparar los datos de Cq muestra que de las normas para determinar el corte de Cq

Resultados

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Comparación de métodos de extracción de ADN

Se evaluó la compatibilidad de un método de extracción basado en el grano magnético DNA con PCR en tiempo real detectando la cantidad de ADN de S. subterranea en una muestra de suelo de campos infestados con el patógeno. Como se muestra en el suplementario figura 1, el método basado en el grano magnético se comparó con los otros métodos incluyendo una CTAB-fenol-cloroformo basado en método18, rápido ADN mini preparación métodos19,20y otros basados en sílice DNA extracción kits estándar. Muestras de ADN extraídas por medio de los seis diferentes métodos fueron sometidas a PCR en tiempo real basado en el laboratorio convencional. Los resultados sugirieron que el método basado en el grano magnético es comparable con los otros métodos, aunque basados en sílice kit de extracción de ADN mostró el mejor rendimiento entre los métodos que hemos probado. Todos los kits contienen tiocianato de guanidinio o hidrocloruro de guanidinio: ambos son agentes poderosos caotrópico, que desnaturalice la mayoría de las proteínas celulares, incluyendo RNasas y DNases. Por lo tanto, utilizando los métodos es adecuado para las extracciones de ADN y ARN.

Comparación entre una polimerización en cadena en tiempo real portable y una PCR en tiempo real basado en el laboratorio convencional

Comparar la sensibilidad y especificidad de un PCR portátil a una PCR convencional basada en laboratorio, cuantificación absoluta del patógeno de que ADN fue realizado usando diferentes cantidades de S. subterranea su gene, que fue llevado por el vector pGEM-T21 . Una serie de diluciones 10 veces de su gen (106 a 100 copias) se analizaron los SsTQ cartillas/sonda set22. Los resultados demostraron que el método PCR portátil detecta el patógeno objetivo ADN (~ 100 copias), aunque la sensibilidad fue 10 veces inferior que el método PCR convencional basado en el laboratorio, que detectó al menos 10 ejemplares (figura 2).

Para su posterior validación, se analizaron suelos artificialmente infestadas. Sporosori de S. subterranea se obtuvieron de agallas de raíz de sarna polvorienta de las raíces de la patata. Los suelos se infestaron con suspensiones de sporosori a una concentración final de 105 sporosori/g de peso seco del suelo. El método magnético basado en el grano, se extrajo ADN de las muestras de suelo infestado y se prepararon diluciones seriadas 10 veces para obtener concentraciones equivalentes a 105104103, 102, 101y 100 sporosori/g peso de suelo seco. Las muestras de ADN fueron utilizadas para la polimerización en cadena usando el primer punta de prueba SPO sistema23. Los resultados mostraron que el método PCR portátil tiene capacidad analítica comparable a un método PCR basado en laboratorio convencional, pero una vez más, la sensibilidad fue reducida por un factor de ~ 10 (figura 3).

Por último, probamos una muestra de suelo de un campo que era naturalmente contaminado con S. subterranea. Se realizó la extracción de ADN basados en grano magnética en diferentes cantidades de suelos (10, 20, 50 y 100 mg de suelo por 500 μl de tampón de extracción). Los resultados sugirieron que el peso óptimo del suelo como material de partida para la extracción de ADN fue 50-100 mg (figura 4). Cantidades de suelo fuera de la gama causaron una falla en los pasos posteriores de PCR. Este efecto podría ser debido a cuando se utilizan cantidades excesivas de suelo como material de partida, contaminaciones (p. ej., compuestos fenólicos) pueden interferir con la polimerización en cadena24. En el caso de volúmenes menores de suelo, la cantidad de ADN extraído puede ser menor que el límite de detección de PCR (p. ej., el rendimiento total fue variada la DNA extraída del suelo 10-20 mg). La sensibilidad fue bastante similar entre la portátil PCR y los métodos convencionales de PCR. Resultados similares fueron obtenidos en muestras de ADN de diferentes métodos de extracción (figura 2 complementaria)

Detección de otros patógenos por el sistema de detección in situ mediante una PCR en tiempo real portable

Probamos el portátil método PCR para la detección de otros patógenos importantes transmitidas por el suelo Papa, r. solani AG3 y PMTV. En este estudio, realizamos la PCR en tiempo real usando el RsTq cartillas/RQP1 sonda set25 para r. solani AG3 detección con ADN de cultivo puro. También realizamos la PCR en tiempo real usando el PMTV D primer punta de prueba set26 para detección de PMTV con RNA de una muestra de tubérculos sintomáticos spraing fue utilizado. Como se muestra en la figura 5, el método PCR portátil detectó con éxito ambos patógenos. Los resultados fueron comparables entre los instrumentos convencionales y portátiles, lo que sugiere que el método PCR portátil versátil y aplicable a otras detecciones de patógeno si se dispone de las secuencias de la cartilla diseñadas para PCR en tiempo real.

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Figura 1. Procedimiento de un sistema portátil de PCR en tiempo real para detección de patógenos en el sitio. El protocolo se compone de pasos en el siguiente orden: preparación de lisado por breve homogeneización (A), magnética basada en grano de extracción (B), PCR en tiempo real portable (C) y análisis de datos cuantitativos usando una computadora portátil (D). Tenga en cuenta que se pueden completar todos los pasos en el sitio.

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Figura 2 . Comparación de sensibilidad entre un PCR portátil y una PCR convencional basado en el laboratorio. Cuantificación del patógeno de ADN fue realizada usando diferentes cantidades de S. subterranea su gen (106 a 100 copias) con la sonda/cartillas de SsTQ. Regresión lineal entre el valor de registro de ADN de plásmido de S. subterranea y valor de registro recíproco de Cq en el termociclador convencional (A) y el termociclador portátil (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3 . Comparación del rendimiento de detección en suelos infestados artificialmente con S. subterranea. Los suelos se infestaron artificialmente (105 100 sporosori/g peso de suelo seco) con suspensiones de sporosori de S. subterranea . El método magnético basado en el grano, se extrajo ADN de las muestras de suelo infestado. PCRs se realizaron utilizando las muestras de suelo con el conjunto de la primer punta de prueba SPO. Regresión lineal entre el valor de registro de la cantidad inicial en sporosori por gramo de suelo y el valor de registro recíproco de Cq en el termociclador convencional (A) y el termociclador portátil (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 . Comparación de la cantidad de muestras de suelo para la extracción de ADN a partir de. Se utilizó el método magnético basado en grano para extracción de ADN de 10, 20, 50 y 100 mg de muestras de suelo. PCR en tiempo real se realizaron utilizando el termociclador portátil. Curvas estándar representan la relación entre la cantidad de ADN total extraído de las muestras de suelo (eje x) y las cantidades del producto de PCR (eje y) amplificadas por el conjunto de la primer punta de prueba de Sss. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5 . Detección de otros patógenos de la papa, r. solani y PMTV. PCR en tiempo real se realizaron utilizando el termociclador portable y el termociclador convencional. R. solani AG3 fue detectado en el ADN total extraído de cultivo puro con RsTq primers y la sonda de RQP1 (A) PMTV se detectó en ARN total extraído de una muestra de tubérculos infectados PMTV usando que el PMTV D primer punta de prueba establecida (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-6
Figura 6 . Una tubería diagnóstico de fitopatógenos. Diagrama de flujo muestra un flujo de trabajo general para el diagnóstico de fitopatógenos. Tenga en cuenta que se puede omitir el paso tradicional, por ejemplo, identificación visual, si se utiliza in situ detección molecular, que hace todo el proceso de diagnóstico simple y rápido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PCR en tiempo real portablePCR en tiempo realLÁMPARAELISAFlujo lateral
Costo por reacción del destino$0,60-$8,47$0,60$0,75$0,60$4,74
Sensibilidad100 copias10 copias10 copias1-10 de sporosori33
1-10 ng/mL (proteína)33 		1-10 de sporosori34
5 x 105UFC/mL35
Gasto de tiempo90 minutos80-240 minutos50-90 minutos32 3-24 horas10-15 minutos
Preparación necesariaExtracción ácida ●nucleic
● diseño de cartilla		Extracción ácida ●nucleic
Diseño Primer Punta de prueba del ●		Extracción ácida de ● Nucelic
● diseño de cartilla		Extracción de proteínas ●
● Anticuerpos		N / A
Otros materiales necesariosTermociclador portátil ●Termociclador convencional ●Mancha de Colormetric ●
● la incubadora		Lector de placas ●
● Lavado equipo		N / A

Tabla 1. Tabla comparativa de métodos de detección serológica y molecular de fitopatógenos

Cartilla deSecuencia (5′-3′)un Objetivob
SsTQ-F13 CCGGCAGACCCAAAACCITS1-ITS2 de S. subterranea
SsTQ-R13 CGGGCGTCACCCTTCAITS1-ITS2 de S. subterranea
SsTQ-P13 [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM]ITS1-ITS2 de S. subterranea
Genesig S.subterranea primer punta de pruebaN / AActina en S. subterranea
SPO1014 GGTCGGTCCATGGCTTGAITS en S. subterranea
SPO1114 GGCACGCCAATGGTTAGAGAITS en S. subterranea
SPOPRO114 [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM]ITS en S. subterranea
RsTqF119 AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTTITS1-ITS2 de r. solani
RsTqR119 AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTTITS1-ITS2 de r. solani
RQP119 [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM]ITS1-ITS2 de r. solani
Genesig PMTV primer punta de pruebaN / ACP-RT en PMTV
PMTV-D-F20 AGAATTGRCATCGAAACAGCACP en PMTV
PMTV-D-R20 GTCGCGCTCCAATTTCGTTCP en PMTV
PMTV-D-P20 [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM]CP en PMTV
un Primers oligo ADN fueron modificados con FAM (6-carboxyfluorescein) o TAM (5-carboxytetramethylrhodamine)
b ITS: Espaciadores transcritos internos, CP: capa de proteína; CP-RT: capa proteína readthrough

Tabla 2. Primers utilizados en este estudio

Suplementario Figura 1. Comparación de los métodos de extracción de ADN para la detección del patógeno sarna polvorienta. Se compararon seis métodos diferentes de extracción ADN (A-F) para la detección del patógeno sarna polvorienta, S. subterranea en muestras de suelo. (B, D, F). Se extrajo ADN utilizando kit basados en sílice #1 (véase la tabla de materiales para todos los nombres de equipo), basados en sílice kit #2 y kit magnético basado en el grano, repsectively. PCR fue realizada usando el termociclador PCR convencional basado en el laboratorio. Curvas estándar representan la relación entre la cantidad de ADN total extraído de las muestras de suelo y las cantidades del producto de PCR amplificado por el conjunto de sonda/cartillas de SsTQ. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 2. Comparación del límite de detección entre un PCR portátil y una PCR convencional basado en el laboratorio. ADN total fue aislado de una muestra de suelo usando tres diferentes métodos de extracción: (un, método B) Doyle, (C, D) basados en sílice kit #2 y (E, F) el kit magnético basado en el grano. Gráficos que se muestra a la izquierda son datos usando el termociclador portable con el juego de primers/sonda de Sss, mientras que los gráficos de la derecha representan los datos generados con el termociclador convencional basado en el laboratorio de la sonda/cartillas de SsTQ establecido. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Discusión

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Como se muestra en la tabla 1, los avances tecnológicos recientes en la identificación molecular de agentes patógenos han aumentado la eficacia, precisión y velocidad de diagnóstico, que han contribuido a la detección de infecciones pre sintomático27. En cuanto a diagnóstico in situ, lámpara y los métodos de flujo lateral se utilizan con frecuencia porque son portátiles y proporcionan resultados inmediatos a un coste menor. Sin embargo, en el caso de métodos serológicos, detección específica puede ser difícil de lograr. Esto en ocasiones causa misdetection de microbios objetivo como habitantes comunes del suelo. Por ejemplo, puede haber reactividad cruzada entre las pruebas serológicas de Phytophthora spp. y Pythium spp. en el caso de patata patógeno28, indicando que a veces hay dificultades detectar la planta específica agentes patógenos.

En el presente estudio, hemos desarrollado un protocolo optimizado para in situ detección molecular de patógenos de papa transmitidas por el suelo mediante el sistema PCR en tiempo real portable comparando sus capacidades con la de un laboratorio basado en tiempo real PCR sistema convencional. Hemos encontrado que el in situ método detecta específicamente los patógenos de la papa en la muestra de suelo, aunque la sensibilidad es aproximadamente 10 veces más baja que el de un ensayo equivalente basado en el laboratorio. También vale la pena teniendo en cuenta que en este caso prueba de laboratorio y campo no utilizó un tamaño de muestra biológicamente relevantes. Tamaños de muestra grandes se requieren para el uso en investigación rutinariamente suelos de campo descrita29,30, donde se procesan los tamaños de muestra de entre 250 g a 1 kg, aunque estos métodos requieren operadores calificados y sofisticados equipo para extraer ADN. Por lo general, un suelo a gran escala extraer ADN se toma de una muestra representativa de suelo agregada solo de numerosas submuestras sobre 1 a 4 hectáreas6,29,30. Sin embargo, el protocolo desarrollado aquí es rápido, fácil de usar para usuarios sin experiencia previa en diagnóstico molecular y puede ser utilizado fuera de un laboratorio. Como el método es rápido y relativamente barato en comparación con la extracción del suelo a gran escala, podría utilizarse para muchas pequeñas muestras tomadas de un área de muestreo similar a las muestras de agregado a gran escala de la pantalla. Podría superar algunas de las deficiencias de un pequeño tamaño muestral y determinar información adicional sobre la distribución espacial del patógeno en el campo. Además, la portabilidad y la velocidad del método significa que también puede ser utilizado en actividades de demostración a productores para educación y fines de la contratación.

Otra consideración es que muchos análisis PCR en tiempo real son ya publicados para una amplia gama de patógenos de planta5. Este sistema puede hacer uso de estos ensayos existentes sin la necesidad de diseñar nuevas cartillas de lámpara para habilitar en pruebas de campo. Una crítica frecuente de análisis de la lámpara es que puede ser difíciles diseñar31. PCR de portátil, por lo tanto, permite la relativamente fácil aplicación de una amplia gama de pruebas de patógenos disponibles para pruebas in situ.

Los métodos tradicionales pueden ser a menudo costosos, laboriosos, inexactas y desperdiciador de tiempo. La simplicidad del método in situ que desarrollamos permite a productores y trabajadores de la industria realizar detección de patógenos por sí mismos y tal vez generar un resultado mucho más rápido que enviar a un laboratorio de diagnóstico que podría ser cierta distancia. La rapidez y sensibilidad del método PCR portátil pueden ayudar a los productores a evitar potencial de infecciones secundarias, que pueden fomentar el aumento de la población del patógeno y la propagación inadvertida (a través de equipos o seres humanos). En conclusión, el método in situ desarrollado en el presente estudio permite la detección exacta y relativamente sensible de patógenos de suelo importantes en el campo. Nuestra esperanza es que el método in situ desarrollado en este estudio contribuirá en una tubería diagnóstico actual (figura 6), no sólo proporcionando respuestas rápidas y precisas a preguntas epidemiológicos sobre enfermedades de las plantas en el campo, sino también proporcionando mayor comprensión de la biología y la epidemiología de patógenos de plantas.

Divulgaciones

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Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Neil C. Gudmestad Universidad Estatal de Dakota del norte para proporcionar S. subterranea plasmid DNA, Dr. Hanu Pappu en Universidad de Estado Washington (WSU) para proporcionar PMTV ARN y Dr. Debra Inglis en WSU para proporciona r. solani AG3. Agradecimiento especial a Dr. Jeremy Jewell en WSU para proporcionar comentarios sobre el manuscrito y WSU CAHNRS comunicaciones de videografía. Esta investigación fue apoyada por el consorcio de investigación de papa del noroeste y el Departamento de Estado Washington de agricultura - programa de subvención de cultivos de especialidad (no de la concesión. K1764). PPNS Nº 0741, Departamento de Fitopatología, Facultad de agricultura, Ciencias de recursos naturales y humanos, centro de investigación agrícola, portilla proyecto Nº WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de PCR de carcasa blancaBio-Rad HSP9601
CFX ManagerBio-Rad1845000
SsoAdvanced Sondas universales Supermix Bio-Rad1725280
CFX96 Touch instrumento de qPCRBio-Rad 
Alcohol etílico, puro 200 gradosDecon Laboratories04-355-222
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Fisher BioReagentsBP118-500
Fenol, saturado Fisher BioReagentsBP1750I-400
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)Fisher BioReagentsBP152-5
q16 máquina de PCR en tiempo realgenesigMBS486001
Sulfato de dodecilo de sodio ultrapuro (SDS)Invitrogen15525-017
2-Propanol (Isopropanol)JT Baker67-63-0
CloroformoJT Baker9180-03
Ácido clorhídrico, 36.5-38.0% (HCl)JT Baker9535-03
iso-Alcohol amílicoJT Baker9038-01
FastDNA Spin kit MP Biomedicals6560-200Kit de extracción de ADN a base de sílice #1
Luna Universal One-Step RT-qPCR KitEngland BiolabsE3005S
0.1ml Tubos de PCR individuales de bajo perfilPhenix ResearchMPC-100LP
ADN/ARN PrimerdesigngenesigEASY-EK
genesig Easy Tubos de 1,5 mLPrimerdesigngenesigEASY-1.5
Gradilla magnética para tubosPrimerdesigngenesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy KitPrimerdesignPath-S.subterranea-EASY
Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB)Sigma-AldrichH6269-100G
Morteros de pelletsThermo Fisher Scientific12-141-364
Cloruro de sodio (NaCl)Thermo Fisher Scientific7647-14-5
DNA Miniprep kit ZymoBIOMICSD4300Kit de extracción de ADN a base de sílice #2
1855195 New Kit de extracción fácil de

Referencias

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  1. Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
  2. Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
  3. Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
  4. Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
  5. Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
  6. Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
  7. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
  8. Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
  9. Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
  10. Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241(2008).
  11. Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
  12. Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
  13. Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
  14. Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
  15. Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
  16. Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
  17. Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337(2016).
  18. Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
  19. Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
  20. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349(1991).
  21. Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
  22. van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
  23. Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
  24. Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
  25. Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
  26. Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
  27. Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
  28. Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
  29. Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
  30. Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
  31. Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
  32. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
  33. Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
  34. Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).

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