Monitoreo de la transmisión de célula a célula de los agregados de la proteína Prion-como en Drosophila Melanogaster

Resumen

Acumulación de evidencia apoya la idea de que agregados de proteína patógena asociada a enfermedades neurodegenerativas entre células con propiedades similares a los priones. Aquí, describimos un método que permite la visualización de la propagación de célula a célula del prion-como los agregados en el organismo modelo Drosophila melanogaster.

Resumen

Agregación de la proteína es una característica central de la mayoría las enfermedades neurodegenerativas, como esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP) y la enfermedad de Huntington (HD). Agregados de proteína están estrechamente asociados con neuropatología en estas enfermedades, aunque no se conoce el mecanismo exacto por el cual la agregación de la proteína aberrante interrumpe homeostasis celular normal. Surgiendo datos proporcionar fuerte apoyo para la hipótesis de patógenos agregados en TDA, PD, y ALS tienen muchas similitudes a los priones, que son sólo proteínas agentes infecciosos responsables de las encefalopatías espongiformes transmisibles. Priones autoreplicarse por plantillas la conversión de forma nativa doblado versiones de la misma proteína, causando la propagación del fenotipo de agregación. Cómo los priones y las proteínas del prión-como en AD, PD, HD y ALS se mueven de una celda a otra es actualmente un área de intensa investigación. Aquí, se describe un modelo de Drosophila melanogaster que permite monitoreo de transmisión del prión-como, célula a célula de agregados de la huntingtina (Htt) asociados con el HD. Este modelo se aprovecha de potentes herramientas para manipular la expresión de transgenes en muchos diversos tejidos de Drosophila y utiliza una proteína citoplásmica fluorescencia etiquetada transferencia directamente de prion-como del informe de agregados Htt mutantes. Lo importante, el enfoque se describe aquí puede utilizarse para identificar nuevos genes y vías que median la separarse de agregados de proteína entre célula diversos tipos en vivo. Información obtenida de estos estudios será ampliar la limitada comprensión de los mecanismos patogénicos que subyacen a las enfermedades neurodegenerativas y revelar nuevas oportunidades para la intervención terapéutica.

Introducción

La hipótesis del prión afirma que el agente infeccioso responsable de las encefalopatías espongiformes transmisibles (p. ej., enfermedad de Creutzfeldt - Jakob en los seres humanos, scrapie en ovejas, la caquexia crónica en ciervos y alces y "enfermedad de las vacas locas" en bovinos ) está exclusivamente compuesto de proteína y desprovista de ácidos nucleicos¹. En enfermedades por prión, la proteína priónica celular (PrP^C) asume un pliegue (PrP^Sc) no nativos, estable que es altamente beta ricos en hoja y puede uno mismo-propagar por conversión y reclutar moléculas monoméricas de PrP^C en amiloide establ....

Protocolo

1. acoplamiento Gal4 y QF-mediada por Htt Transgene expresión en Drosophila

1. Recopilar o generar transgénicos Drosophila melanogaster líneas que contienen tejidos específicos Gal4 o QF "controladores", así como líneas que contienen el tipo salvaje o mutantes Htt los transgenes aguas abajo de Gal4-UAS³⁸ o³⁹de QF-QUAS. Asegúrese de que las proteínas que se expresan de estos transgenes son fusionados a proteínas fluorescentes o epitopo etiquetados para permitir la diferenciación de los productos de transgen mutantes y el salvaje-tipo Htt en la mosca de la misma. Vea la figura ....

Resultados

Los métodos descritos aquí producen datos robustos demostrando a-como prión transferencia de agregados de la proteína Htt de población de una célula a otra en la mosca intacta del CNS. Conversión de tipo salvaje Htt de difuso a punteado se observa por fluorescencia directa de esta proteína de fusión YFP en glia receptor como resultado de la expresión HttQ91-mCherry en donantes ORNs (A-C de lafigura 2y figura 4

Discusión

Sigue aumentando el número de pacientes que sufren de enfermedades neurodegenerativas, hay una necesidad urgente de aumentar la comprensión de la patogenia molecular de estas enfermedades que se pueden desarrollar mejores terapias. Aquí, describimos los métodos que permiten monitoreo de transmisión del prión-como de agregados de proteínas patogénicas entre diferentes tipos de células en el organismo modelo Drosophila melanogaster. Recientemente hemos utilizado esta metodología para demostrar la transmisión del p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10X, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	Diluido a 1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas Scientific	2904F24
20% paraformaldehído (PFA)	Microscopía electrónica Sciences	15713-S
Suero de cabra normal (NGS),	Lampire filtrado Biological Laboratories	7332500	Alícuota y congelación a la recepción
Pollo anti-GFP	Aves Labs	GFP-1020	Uso con dilución 1:500
Conejo anti-DsRed	Clontech	632496	Uso con dilución 1:2000; puede reconocer proteínas fluorescentes a base de DsRed (por ejemplo, mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Ratón anti-Bruchpilot	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas	nc82	Úselo con una dilución de 1:100; marcará las estructuras presinápticas activas en todo el cerebro de mosca
FITC anti-pollo	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	Uso con una dilución de 1:250
Alexa Fluor 568 anti-conejo	Life Technologies	A11011	Uso con dilución 1:250
Alexa Fluor 647 anticuerpo anti-ratón	Life Tecnologías	A21235	Uso con dilución 1:250
Slowfade Gold Antifade Reactivo Life	Technologies	S36936
Portaobjetos de microscopio (25 x 75 x 1,0 mm)	Fisher Scientific	12-550-143
Cubreobjetos (22 x 22 mm)	Globe Scientific	1404-15
Pinzas de grado biológico Dumont, estilo 3	Ted Pella	503	uso en mano no dominante
Pinzas Dumont Biology Grade, Estilo 5	Ted Pella	505	uso en la mano dominante
software de análisis de imágenes LAS X software de análisis	Leica
Imaris	Bitplane

de imágenes