Utilizando un sistema de enriquecimiento integral inmunoprecipitación para identificar un perfil endógeno modificación poste-de translación de proteínas blanco

Resumen

Investigando múltiples, modificaciones post-traduccionales endógenas para una proteína de la blanco pueden ser extremadamente difíciles. Técnicas descritas aquí utilizan un sistema de buffer y filtro de lisis optimizado desarrollado con metas específicas de PTM, matrices de afinidad para detectar las modificaciones de fosforilación de tirosina, acetilación, ubiquitinación y sumoilación 2/3 para un objetivo proteína mediante un sistema único y aerodinámico.

Resumen

Ahora es bien apreciado que modificaciones post-traduccionales (PTMs) desempeñan un papel integral en la regulación de una proteína estructura y función, que puede ser esencial para la función de una proteína determinada fisiológicamente y patológicamente. Enriquecimiento del PTMs es a menudo necesario al investigar el estado de la PTM de una proteína diana, porque MPa a menudo es transitorios y relativamente bajo en abundancia. Se encuentran muchas trampas cuando enriquecedor para una PTM de una proteína de la blanco, como la incompatibilidad de búfer, el anticuerpo de la proteína de la blanco no es compatible con IP, la pérdida de señal PTM y otros. El grado de dificultad se amplía al investigar múltiples PTMs como acetilación, ubiquitinación, la sumoilación 2/3 y la tirosina la fosforilación de una proteína dada. Estudio de una combinación de estos MPa puede ser necesario, como interferencia entre el PTMs es prevalente y crítica para la regulación de la proteína. A menudo, se estudian estos PTMs en almacenadores intermediarios de la lisis diferentes y con composiciones de único inhibidor. Para simplificar el proceso, único desnaturalización lisis ha desarrollado un sistema que efectivamente aísla y conserva estos cuatro MPa; permitiendo así, investigación de potencial interferencia en un sistema único de lisis. Un sistema de filtro único fue diseñado para eliminar la contaminación de ADN genómico de lisado, que es un subproducto problemático de búferes de la desnaturalización. Matrices de afinidad sólida dirigida a cada uno de los cuatro MPa fueron desarrollados en conjunto con el sistema para maximizar el enriquecimiento y la detección de los Estados endógenos de estos cuatro MPa. Este completo conjunto de herramientas de detección de PTM agiliza el proceso de obtención de información crítica acerca de si una proteína es modificada por uno o más de estos MPa.

Introducción

Modificaciones post-traduccionales (PTMs) son alteraciones altamente reguladas a una proteína, por el que la modificación es añadida o eliminada de una manera específica. MPa es a menudo cambios dinámicos, transitorios que alteran significativamente la estructura de la proteína, interacciones con las proteínas de la pareja, localización espacial y en última instancia, lo que permite la proteína realizar distintas funciones^{1,2 , 3 , 4}. PTMs son tan abundantes que aumentan el número de formas de proteína único (o proteoforms) de aproximadamente 30.000 productos del gene a más 1 millón proteoforms^5,6. Identificación de PTMs y definir su efecto en una proteína de la blanco son crítico hacia la comprensión de las funciones fisiológicas y patológicas^{7,8,9,10, de la proteína 11,12,13,14}. Trabajo en seleccionadas proteínas como tubulin, p53 y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) han aclarado el papel regulador de MPa^15,16,17. Estos estudios descubrieron que la regulación de estas proteínas se produce por múltiples MPa, y en muchos casos estas modificaciones trabajan en conjunto para promover una función específica. Nuevos estudios han demostrado que interferencia PTM cooperativa y negativo puede ocurrir en varias diversas proteínas^{18,19,20,21,22, 2324,}de^,25. Sin embargo, los perfiles de la PTM de la mayoría de las proteínas se construyen de varios estudios que han utilizado diferentes modelos y condiciones únicas. Tener un sistema optimizado para investigar PTMs múltiples en un solo sistema sería altamente beneficioso para profundizar en la potencial interferencia PTM para una proteína de la blanco.

Un reto investigar MPa en un solo sistema es que PTMs específicos sean investigadas usando almacenadores intermediarios de la lisis distinto. Por ejemplo, la utilización de buffers como RIPA o NP-40 que se utilizan para las investigaciones de fosforilación o ubiquitinación puede ser inadecuada para el estudio de una lábil PTM como pequeño ubiquitin-like modifier (SUMO) ylation²⁶. Además, buffers no desnaturalizantes son inadecuadas para disociar las interacciones entre proteínas y pueden conducir a falsos positivos de identificación PTM²⁷. Investigación de MPa en un tampón de lisis desnaturalización puede ser preferido, es significativamente mejor en el aislamiento de proteínas de los compartimentos celulares²⁸, se disocian la mayoría de las interacciones de la proteína y se inhiben las proteasas que alteran los Estados de la PTM, como deSUMOylases ²⁶; sin embargo, desnaturalización búferes puede comprometer la integridad de los reactivos de afinidad específicos como ubiquitina atar herramientas basadas en dominio²⁷. Desarrollo de un sistema de lisis como desnaturalizantes para estudiar múltiples MPa de una proteína en un sistema compatible con reactivo de afinidad sería altamente beneficioso para las investigaciones de interferencia PTM.

Desnaturalización buffers tienen ventajas sobre buffers no desnaturalizantes para investigar PTMs, se utilizan con menos frecuencia debido a sus inconvenientes importantes, como la incompatibilidad con el análisis de la proteína convencional, significativa genómica contaminación de ácido desoxirribonucleico (ADN) y la interrupción a inmunoprecipitación (IP) reactivos²⁹. Estos inconvenientes pueden resultar en tiempo de preparación largo y posibles daños a las proteínas objetivo cuando corte la DNA genomic. Dos métodos comúnmente usados para esquilar el ADN incluyen jeringa lisis y sonicación²⁹. Ambos métodos requieren Optimización amplia y a menudo carecen de reproducibilidad precisa. Métodos alternativos para extraer la DNA de genomic incluyen la adición de DNAses; sin embargo, esto puede requerir optimización adicional y cambios en la composición del buffer. En definitiva, un método simple y reproducible para eliminar la contaminación de ADN genómica sería beneficioso cuando se trabaja con desnaturalización almacenadores intermediarios de la lisis de las investigaciones de la PTM.

El objetivo de esta técnica es desarrollar un sistema para aislar e investigar la ubiquitinación (Ub), fosforilación de la tirosina (pY), la sumoilación (SUMO 2/3) 2/3 y PTMs acetilación (Ac) en un solo sistema para investigar mejor diafonía PTM para una proteína diana. Este sistema de detección de la PTM fue utilizado para investigar rápidamente el perfil PTM endógeno de varias proteínas blanco en un solo sistema. Nueva visión sobre la interferencia potencial fue identificado^30,31. En general, la técnica descrita aquí mejora en los métodos existentes para investigar PTMs y PTM interferencia de tres maneras distintas: 1) un único búfer desnaturalización fue desarrollado que aísla las proteínas de todos los compartimentos celulares, sin dejar de ser compatible con Reactivos de afinidad PTM, 2) se desarrolló un sistema de filtro único que rápidamente elimina la contaminación del ADN genómica de lisados desnaturalizada con alta reproducibilidad y requiere ningún equipo especializado y 3) los granos de robusta afinidad, sistema de lisis e inhibitorio reactivos son compatibles; simplificando el aislamiento de estos cuatro MPa para una proteína objetivo maximizar enriquecimiento de PTM, y eficientemente examinar la interferencia potencial.

Protocolo

1. Preparación: Cultivo de células

1. Crecen cuatro placas de 150 mm de células A431 en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal 10%.
   1. Crecen las células A431 a 50% de confluencia.
   2. Suero restringir las cuatro placas de células A431 con DMEM libre de suero durante 24 h.
   3. Tratar dos placas de células A431 con 33,3 mg/mL de factor de crecimiento epidérmico para h. 1 deja las otras dos placas sin tratamiento.
      Nota: Condiciones de crecimiento y tratamiento de la célula, se muestra a continuación proporcionan un ejemplo; sin embargo, esta metodología es aplicable a muchos tipos de células diferentes y condiciones de tratamiento.
2. Preparar blastR almacenadores intermediarios de la lisis y la dilución con inhibidores (tabla 1). Combinar 2,895 mL de tampón de lisis de blastR con 15 μl de inhibidor de la tirosina fosfatasa, 30 μl de deubiquitinase, inhibidor de la deSUMOylase, 30 μl de inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) y 30 μl de inhibidor de la proteasa cóctel.
   1. Con 50 μl de inhibidor de la tirosina fosfatasa, 100 μl de deubiquitinase, inhibidor de la deSUMOylase, 100 μl de inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) y 100 μl de inhibidor de la proteasa cóctel se combinan 9,65 mL de tampón de dilución de blastR.
      Nota: Ver Tabla de materiales para tampón composición e inhibidor de la información.
3. Retirar los medios de cultivo y colocar las células en hielo. Luego, se lavan las células dos veces con 10 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS).
   1. Quite tanta PBS como sea posible antes de añadir el tampón de lisis de blastR para maximizar la lisis celular.
      Nota: Ver Tabla de materiales para la composición del buffer.
4. Añadir 600 μl de buffer de lisis de blastR para cada placa de 150 mm. La cantidad de buffer se basa en producción de proteína esperado (tabla 2).
   1. Lyse las células usando un raspador celular. El lisado se convertirá en viscoso debido a lisis nuclear.
5. Use una pipeta de 1 mL cortada para transferir el lisado crudo en un filtro de blastR que ha sido colocado en un tubo de colección de 15 mL (figura 1). Aquí, se utiliza un tubo falcon de 15 mL.
6. Utilice un émbolo provisto de filtro totalmente comprimir el blastR filtro y recoger el lisado flujo a través, incluyendo cualquier burbuja en un tubo de 15 mL (figura 1).
7. Opcional: Transferencia aclaró lisado a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar el lisado a aproximadamente 10.000 x g durante 1 min a 4 ° C.
   1. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo falcon de 15 mL.
8. Diluir el clarificado lisado con tampón de dilución de blastR hasta un volumen final de 3 mL en cada placa de 150 mm. El volumen final se basa en el rendimiento de proteína esperado (tabla 2).
   Nota: Este paso es importante ya que la composición del tampón final afecta a la severidad de la reacción de IP.
9. Cuantificar la concentración de proteína (sección 2).

2. ensayo de cuantificación de proteínas

Nota: Utilizar un ensayo de cuantificación de proteína colorimétrico estándar para determinar la cuantificación de proteína. Aquí, cuantificación de proteínas se determina mediante ensayo de rojo proteína avanzada de precisión.

1. Añadir 1 mL de reactivo de ensayo de rojo proteína avanzada de precisión a cada uno de dos cubetas de 1 mL.
2. Mezclar 10 μl de tampón de lisis de blastR y 40 μl de tampón de dilución de blastR en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL en hielo.
   Nota: Se utilizará para la lectura de la muestra en blanco de la proteína.
3. Añadir 20 μl de la mezcla de buffer de lisis/dilución (del paso 2.2) a la primera cubeta y mezcle por inversión dos a tres veces.
4. Añada 20 μl de lisado diluido de la célula (del experimento) a la segunda cubeta, mezcla como se indica arriba.
5. Incubar las muestras durante 1 min a temperatura ambiente.
6. Espectrofotómetro en blanco con la muestra de mezcla de tampón de lisis/dilución (del paso 2.3).
7. Medir la absorbancia de la muestra lisada (del paso 2.4) a 600 nm.
8. Determinar la concentración de proteína lisado como sigue;
   muestra lectura de OD₆₀₀ x 5 = concentración de proteínas en mg/mL
   Nota: Las lecturas de OD por debajo de 0.05 o por encima de 0.5 son cerca de la capacidad del rango lineal del ensayo de proteína. Lecturas > 0.5, las muestras pueden diluirse. Para las lecturas < 0.05 más lisado puede añadirse al reactivo de ensayo rojo proteína avanzada precisión (hasta 50 μL). Ver tabla 3 para multiplicadores para convertir lecturas de espectrofotómetro a concentración de lisado de proteínas mg/mL. Si hay insuficiente de proteínas en una placa, se recomienda utilizar 2 o más placas por IP. En este caso, las placas serán cosechadas en serie, la original 300 μL de tampón de lisis de la transferencia entre placas.
9. Basado en la concentración de proteína, diluir la muestra con una mezcla de buffer (lisis de blastR 1 parte: 4 partes blastR dilución) a una concentración final deseada (generalmente 1 mg/mL).
10. Snap freeze alícuotas de muestras que no se usará inmediatamente.
    1. Almacenar las muestras a-70 ° C.
    2. Proceder a la sección 3.

3. inmunoprecipitación (IP) ensayo

Nota: Afinidad concentraciones de grano lisadas concentraciones y tiempos de incubación son pautas recomendadas y pueden ser únicas para cada proteína diana y PTM específico investigado.

1. Invierta los tubos de reactivo stock que contiene granos de afinidad Ub, granos de afinidad pY, SUMO afinidad 2/3 cuentas y cuentas de afinidad CA varias veces para asegurarse de que las cuentas son suspendidas completamente en el tubo.
2. Para cada análisis de IP, suspensión de grano alícuotas en tubos de microcentrífuga separados 1,5 mL en hielo (tubo de IP). Aquí, añadir 20 μl de granos de la afinidad de ubiquitina, 30 μl de granos de afinidad la fosfotirosina, 40 μl de granos de 2/3 afinidad la sumoilación o 50 μl de granos de afinidad la acetilación a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL cada sobre hielo.
   Nota: Véase el cuadro 4 para el volumen recomendado de la suspensión de grano para cada grano de afinidad.
3. Invierta los tubos de reactivo stock que contiene granos de control IP de ubiquitinación y IgG control granos varias veces para asegurarse de que las cuentas son suspendidas completamente en el tubo.
4. Cuentas de control alícuota por reacción de control para determinar la fijación no específica (tubo de Control IP). Aquí, añadir 20 μl de granos de Ub control, 30 μl de cuentas control de pY, 40 μl de granos SUMO control 2/3 o 50 μl de cuentas de control CA a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL cada sobre hielo.
   Nota: Véase el cuadro 4 para el volumen recomendado de la suspensión de grano a utilizar para cada tipo de grano de afinidad.
5. Ahorre una pequeña cantidad de lisado (20 μl) para funcionar como una mancha blanca /negra occidental había entrada control lisado. Añadir 5 μl de tampón de muestra de 5 x y hierve a 95 ° C durante 5 minutos.
   Nota: Ver Tabla de materiales para la composición del buffer.
6. Añadir lisado a cada IP y tubo control IP. Aquí, 1 mg de lisado fue utilizado por IP y control de la reacción, resultando en un total de 8 reacciones de IP.
   Nota: 1.0 mg de lisado por ensayo se recomienda como punto de partida. La cantidad de lisado voluntad requerida varía dependiendo de la abundancia de la proteína diana modificada.
7. Incubar los tubos en un extremo sobre plataforma giratoria a 4 ° C por 2 h. Aquí, un rotador de tubos ATR fue utilizado en velocidad 22.
8. Recoger granos por centrifugación a 3.000-5.000 x g durante 1 min a 4 ° C.
9. Aspirar apagado tanto sobrenadante como sea posible sin molestar a los granos.
10. Lavar los granos en blastR 1 mL tampón de lavado (inhibidores no son necesarios en esta etapa) por 5 min en un 4 ° C girando la plataforma.
11. Recoger granos por centrifugación a 3.000-5.000 x g durante 1 min a 4 ° C.
12. Aspirar apagado tanto sobrenadante como sea posible sin molestar a los granos.
13. Repita el paso de lavado (pasos 3.10-3.12) dos veces más.
14. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante de búfer. Interrupción mínima de la pelotilla del grano es aceptable (hasta un 5% de pérdida). Eliminar sobrenadante residual utilizando un fino agujero proteína carga punta.
15. Añadir 30 μl de tampón de elución de grano y suspender las cuentas de tapping/sacudiendo suavemente el lado del tubo. No use una pipeta en esta etapa.
    Nota: Ver Tabla de materiales para la composición del buffer.
16. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
17. Transferir suavemente cada suspensión de grano a una columna de spin de microcentrífuga de 1,5 mL que se ha colocado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    Nota: Se recomienda cortar el extremo de la punta de la pipeta de transferencia para la transferencia de más.
18. Centrifugar a 9.000-10.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente para recolectar la muestra IP.
19. Añadir 2 μl de 2-Mercaptoetanol para cada muestra y mezclar bien.
    Nota: Es conveniente ajustar la tapa de la columna de la vuelta y utilizar esto para tapar el tubo de recogida para su posterior procesamiento.
20. Coloque las muestras en un baño de agua de 95 ° C para la muestra recoja de 5 min. por centrifugación a 10.000 x g durante 1 min a TA.
21. Si es necesario, almacenar las muestras a-70 ° C y deje aquí o proceder a correr de SDS-PAGE, la transferencia y el análisis de western blot (sección 4).

4. Western Blot análisis: Identificación de la proteína de interés

1. Las muestras separadas por dodecil sodio sulfato poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) y transferencia a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro, según protocolos de laboratorio estándar³².
2. Utilizar un anticuerpo primario para detectar las versiones de modificación postraduccional de la proteína de interés. Aquí, PD-L1 anticuerpo se utilizó para detectar la modificación postraduccional PD-L1.
3. Para la detección, utilice reactivo de detección ultrasensible de la quimioluminescencia.
   Nota: El reactivo quimioluminiscente debe utilizarse conjuntamente con un anticuerpo secundario marcado con HRP capaces de detectar el anticuerpo primario.
4. Utilizar un volumen de 2 mL de reactivo quimioluminiscente por membrana de transferencia mini-gel-tamaño (aproximadamente 8 x 7 cm).
   1. Después de la incubación con el anticuerpo secundario adecuado (se recomienda 60 minutos a temperatura ambiente), lave la mancha 6 x 10 min en 30 mL de solución salina con tampón tris con tween-20 (TBST).
      Nota: Ver Tabla de materiales para la composición del buffer.
   2. Inmediatamente antes del uso, mezclar 1 mL de reactivo quimioluminiscente con 1 mL de reactivo quimioluminiscente B (suficiente para membranas de 8 cm x 7 cm).
   3. Añadir reactivo quimioluminiscente para la membrana e incubar con balanceo suave a temperatura ambiente durante 1-5 min antes de la visualización de la señal de la proteína usando la película de radiografía o la proyección de imagen de cámara dispositivo de carga acoplada (CCD).
      Nota: Tiempos de incubación más cortos en el reactivo quimioluminiscente pueden ser necesarios para las proteínas muy abundantes.

Resultados

La capacidad de estas herramientas para investigar la interferencia PTM detectando eficazmente estos 4 PTMs es en parte dependiente en el sistema de tampón de lisis único. El búfer de desnaturalización de blastR efectivamente aísla proteínas de todos los compartimentos celulares de manera similar a otros búferes de desnaturalización, que asegura un perfil de proteína completo (figura 2A). Además, preserva las señales altamente lábiles de PTM como SUMO 2/3, que disminuye rápidamente en tampones no desnaturalizantes como ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (figura 2B). Lo importante es que, cuando se diluye adecuadamente, no afecta la integridad de los reactivos de afinidad como otros búferes de desnaturalización (p. ej., Tampón Laemmli).

Un obstáculo importante cuando se trabaja con búferes de desnaturalización es la capacidad de eliminar eficazmente la contaminación del ADN genómica. La metodología convencional para reducir viscosidad es distorsionar el ADN usando una aguja de jeringa o sonicando la muestra. Figura 3A muestra contaminación de ADN genómica en A431 celda lisado después del tratamiento con el BlastR filtro, aguja de la jeringuilla o sonicación. Hay una eliminación casi completa de la DNA genomic usando el filtro de BlastR, que no es el caso utilizando una aguja de jeringa convencional o sonicación. Contaminación del ADN genómica afecta significativamente la migración de proteínas a través de un gel de acrilamida SDS; sin embargo, el tratamiento con el filtro de BlastR elimina el ADN genómico, lo que resulta en la migración de proteína adecuada (figura 3B). Alterada la migración causada por la contaminación del ADN genómica significativamente puede afectar la interpretación de manchas blancas /negras occidentales; por ejemplo, el patrón EGFR embarrado en el sin filtrar lisado puede ser inexacto interpretada como aumento de la expresión en relación a la muestra filtrada (figura 3).

Mediante la utilización de este sistema optimizado de enriquecimiento y detección de PTM, uno puede determinar rápidamente si una proteína Diana es modificada por uno o más PTMs. investigación del perfil PD-L1 PTM recientemente fue realizada con esta técnica, y los resultados mostraron que era PD-L1 ubiquitinated, acetilado y tirosina fosforilada en respuesta al EGF (figura 4). Lo importante, estos datos registrados cambios endógenos de la PTM PD-L1, que representa un pequeño porcentaje de la PD-L1 total identificada.

Figura 1: ADN genómico de lisado de células de filtración con filtro de BlastR. (A) imagen de BlastR filtro. (B) Lysate se carga en el filtro que se coloca en un tubo de colección de 15 mL. (C) el émbolo se coloca en la jeringa y lisado se pasa a través del filtro por la compresión. (D) recopilar lisado, incluyendo las burbujas a través de la compresión completa. (E) filtrada lisado.

Figura 2: comparación de buffer lisis BlastR tampones alternativos lisis. Figura 2A adaptado de Horita et al. 2017. Biosci. De la Rep. ³¹ (A) A431 células fueron sometidas a lisis con BlastR, RIPA, mPER, lisis IP, desnaturalizantes (SDS 1%) y buffer de lisis de Laemmli. Los lisados desnaturalización tenían DNA genomic usando filtro de BlastR. Aislamiento de proteínas de la membrana citoplasmática, mitocondrial y marcadores nucleares fueron determinados usando los anticuerpos contra las proteínas del marcador compartimiento respectivo. (B) células A431 fueron sometidas a lisis con BlastR, RIPA y 1% SDS desnaturalización buffer. Lisados fueron immunoprecipitated con SUMO 2/3 o control IgG afinidad los granos. Muestras fueron separadas por SDS-PAGE y se analizaron por western blot utilizando un anticuerpo SUMO 2/3-peroxidasa (HRP). Representante de blots de N≥3 se muestran experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: BlastR lisis filtro es eficaz en la eliminación de la DNA genomic. (A) A431 células fueron sometidas a lisis con un tampón de lisis desnaturalización. ADN genómico fue quitado o cortado con filtro, aguja de la jeringuilla o sonicación durante 5, 10, 20 o 30 segundos de BlastR. 2% del lisado se analizó con bromuro de etidio, electroforesis en gel de agarosa. (B) Lysate de células A431 lisis con un tampón de desnaturalización era sin filtro o filtro con el filtro de BlastR. Las muestras fueron separadas por SDS-PAGE y visualizaron mediante tinción de Coomassie. (C) las muestras del duplicado de B se separaron por SDS-PAGE, transferido a PVDF, y proteína EGFR fue examinada usando un anticuerpo EGFR. Se muestran manchas representativas de experimentos independientes de N ≥ 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: detección de modificaciones poste-de translación inducida por EGF para PD-L1. Figura adaptada de Horita et al. 2017. neoplasia³⁰(A). Restricción de suero A431 células fueron ambos sin estimular (UT) o estimularon con EGF durante una hora antes de la lisis con tampón de lisis de BlastR. CMT se analizó para los niveles de PD-L1 (carriles 1, 2). Cuentas de enlace de ubiquitina (UBA01) fueron utilizados para las proteínas IP ubiquitinated (carriles 3, 4). Phosphotyrosine cuentas de enlace (APY03) fueron utilizados para las proteínas fosforiladas en tirosina IP (carriles 5,6). Cuentas de enlace 2/3 de SUMO (ASM24) fueron usados para sumoiladas de IP 2/3 de proteínas (carriles 7,8). Cuentas de enlace acetil lisina (AAC01) fueron utilizados para las proteínas IP acetilado (carriles 9,10). Cuentas de control de enlace de igG fueron utilizados para proteínas de Unión no específica IP (carriles 11,12). Muestras fueron separadas por SDS-PAGE y se analizaron por western blot utilizando un anticuerpo PD-L1. Se muestra un blot representativo de experimentos independientes de N ≥ 3. Asteriscos blanco fueron utilizados para resaltar pY PD-L1 y bandas de proteínas Ac. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cálculos para el tampón de lisis de BlastR
	1,0 mL	2.0 mL	5,0 mL	10,0 mL
Tampón de lisis de BlastR	965 ΜL	ΜL DE 1930	4,825 mL	9,650 mL
Fosfatasa inhibidor de la tirosina	5 ΜL	10 ΜL	25 ΜL	50 ΜL
inhibidor de la de-ubiquitinase/de-sumoylase	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
Inhibidor de HDAC	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
Inhibidor de la proteasa cóctel	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
Cálculos para el tampón de dilución de BlastR
	4,0 mL	8,0 mL	20,0 mL	40,0 mL
Tampón de lisis de BlastR	3,86 mL	mL 7,72	19,3 mL	38,6 mL
Fosfatasa inhibidor de la tirosina	20 ΜL	40 ΜL	100 ΜL	200 ΜL
inhibidor de la de-ubiquitinase/de-sumoylase	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL
Inhibidor de HDAC	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL
Inhibidor de la proteasa cóctel	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL

Tabla 1: Lisis y dilución tampón preparación gráfico. Tabla proporcionando concentraciones de inhibidores a insertar para un lisis y dilución buffer volumen dado durante la preparación de buffers para la lisis celular.

Contenido de proteína de la placa	Volumen de Buffer de lisis de BlastR recomendada	Volumen de tampón de dilución de BlastR recomendada
< 1 mg	Combinar proteínas de placas múltiples	A volumen final de 1.5 mL
1-2 mg	300 ΜL	A volumen final de 1.5 mL
2-4 mg	600 ΜL	A volumen final de 3 mL
4-6 mg	900 ΜL	A 4,5 mL de volumen final

Tabla 2: Lisis de BlastR/dilución Buffer gráfico. Tabla proporcionando recomienda volúmenes de buffer de lisis y dilución obtener lisado.

Volumen de lisado de célula añadido a 1 ml de reactivo de ensayo de proteína rojo precisión (μL)	Multiplicador con muestra lectura de OD600
10	10
20	5
30	3.3
40	2.5
50	2

Tabla 3: Multiplicadores para convertir lecturas de espectrofotómetro en mg/mL lisado. Tabla proporciona números de conversión a asistente de cálculo de la concentración de proteína.

granos de afinidad	volumen de grano de la mezcla/IP (mL)
Ubiquitinación	20
Phosphotyrosine	30
Sumoilación 2/3	40
Acetilación	50
cuentas de control	volumen de grano de la mezcla/IP (mL)
Cuentas de control de ubiquitinación	20
Cuentas de control de Phosphotyrsoine	30
Cuentas de control 2/3 de la sumoilación	40
Cuentas de control de acetilación	50

Tabla 4: Recomienda el volumen de granos/IP gráfico. Tabla proporcionando recomienda cantidades de cuentas de afinidad para utilizar por reacción de IP.

Discusión

Planteamientos iniciales para determinar si una proteína Diana es modificada por un PTM pueden realizarse utilizando el anticuerpo específico de la proteína diana para IP, seguida de western blot con un anticuerpo PTM (e.g., anti-acetil lisina), o mediante un anticuerpo de la PTM para IP, seguido por western blot con destino proteína anticuerpo específico^30,31,33. Mientras que ambos enfoques funcionan teóricamente, utilizando un anticuerpo específico de la proteína objetivo tiene más peligros potenciales, tales como el anticuerpo no sea IP compatible, o grandes modificaciones de PTM pueden bloquear el sitio de reconocimiento del anticuerpo a la proteína diana^{34 ,35}. La ventaja de las cuentas de afinidad de la PTM es que los dominios del anticuerpo o vinculante reconocen específicamente la PTM de interés; por lo tanto, modificaciones en la proteína diana no deberían alterar reconocimiento por las perlas de afinidad. Como ejemplo, PD-L1 Ub se identificó con la técnica descrita aquí, y ambos endógeno mono - y poli-Ub se observó (figura 4). Una publicación reciente por Lim et al. utilizado en vitro Ub técnicas para investigar Ub PD-L1, y el resultado fue muy similar a los resultados mostrados en la figura 4³⁶. Curiosamente, también realiza IP con un anticuerpo PD-L1 para enriquecer PD-L1 de lisado, la célula donde se sobreexpresa la Ub y MG-132 fue añadido para mejorar la señal. El patrón de la Ub no era robusta y muy distinto del patrón de Ub en vitro . Investigación de la Ub de PD-L1 endógena en los modelos de cultura de célula no se realizó en Lim et al. Informe para clarificar la diferencia entre los datos de cultura y en vitro de sus células.

Investigan si una proteína es modificada por un PTM puede ser difícil, debido a su baja abundancia y naturaleza transitoria^37,38y a menudo requiere enriquecimiento a través de IP. Propiedad intelectual eficaz del PTMs requiere optimización de varios pasos y los reactivos, como almacenadores intermediarios de la lisis y reactivos de afinidad. Al investigar el PTMs múltiples de una proteína objetivo, aumenta la optimización requerida probablemente. Utilizando el sistema de lisis de blastR es un paso crítico en este protocolo, como mantiene capacidad robusta de la IP, permitiendo la detección de la PTM de la pY, SUMO 2/3, Ub y CA MPa en un solo sistema. Esta técnica optimiza el tiempo y los recursos necesarios para determinar si una proteína Diana es modificada por estos cuatro PTMs y potencialmente proporciona una mejor imagen de interferencia de la PTM en relación con la comparación de resultados PTM realizadas usando varios sistemas de lisis. Investigación de la compatibilidad del sistema de lisis de blastR con PTMs alternativos, como la glicosilación, fue realizada; sin embargo, que ha no sido examinado exhaustivamente para todo tipo de MPa.

Abundante ADN genómico puede interferir con las mediciones de proteína utilizando colorimétrico o métodos de nanodrop, afectan la migración de las proteínas en un gel de acrilamida SDS y prevenir la matriz de interacción proteína y afinidad durante ensayos IP. El método descrito aquí utiliza un filtro especializado para quitar con eficacia la contaminación del ADN genómica, que es otro paso crítico de este protocolo. Para resaltar este punto, realizaron pruebas de viscosidad antes y después del tratamiento de blastR filtro, y los resultados mostraron una reducción de alta viscosidad la viscosidad del agua (datos no mostrados). Este cambio de viscosidad fue apoyada por los resultados en la figura 3, que había sido quitado casi todo el ADN genómico. Lo importante, ADN no es cortado con este método, como cualquier ADN esquilado no será capturado por el filtro (datos no mostrados). Esta herramienta es superior a los métodos convencionales, como sonicación o jeringa-ADN-de corte, porque no requiere ningún equipo especializado, es altamente reproducible y elimina el ADN en el lugar de lo esquila. Además, no degradará la proteína en el lisado que puede ocurrir con los métodos convencionales de²⁹. Utilizando el filtro de toma 5-30 segundos por muestra en comparación con métodos alternativos donde eficaz de ADN puede tardar varios minutos (es decir, jeringa de corte) y puede resultar en la heterogeneidad de la muestra siendo contaminantes de ADN en el lisado. Extenso análisis de lisado blastR pre y post filtrado fue realizada, y no hay diferencia observable en el perfil de proteína fue observada por Coomassie, análisis PTM occidentales, o total y específico del destino de destino específicos; así, la integridad del perfil de proteínas pudo no haber sido afectada al filtrar el ADN genómico. En última instancia, este sistema de filtro es beneficioso para cualquier occidental o el uso de IP donde ADN genómico está presente y puede afectar la interpretación de los análisis de proteínas.

Es importante tener en cuenta que hay potencial para la detección de falsos negativa utilizando esta técnica, que puede ser debida en parte a la saturación de grano de afinidad, Unión sitio interferencias o enmascaramiento de la PTM. Por ejemplo, una proteína particular destino puede ser modificada por Ac a niveles muy bajos; por lo tanto, no puede ser aislado por pan-acetil lisina afinidad los granos que han sido saturados por proteínas más abundantes CA-modificado objetivo. Los estudios se realizan para evaluar los límites de detección de los reactivos de afinidad utilizados en este protocolo, pero una reciente publicación sugiere un límite de detección muy robusto. Los datos mostraron que esta técnica podría identificar tan sólo 17 moléculas de proteína blanco acetilado por celular³¹. Todavía, circunstancias específicas tales como células tipo especificidad, PTMs transitorias en respuesta a estímulos específicos, o enmascaramiento de MPa debido a la interacción de la proteína puede todos dan lugar a resultados falsos negativos. Estos son peligros potenciales de esta técnica, así como métodos más PTM IP. Por lo tanto, se recomienda confirmar los resultados mediante múltiples enfoques.

Modificaciones como la glicosilación y fosforilación han demostrado competir para similar los aminoácidos^39,40y otros PTMs como ha demostrado que trabajar secuencialmente para regular una proteína ubiquitinación y fosforilación función^17,41. Recientes trabajos sobre la proteína neuropathological Tau destacan la importancia de la interferencia de la PTM, donde hyper-fosforilación del Tau y Tau sumoilación mejorado⁴². Por otra parte, este grupo demostró que la sumoilación de Tau impidió poly-Ub y posterior degradación de Tau, posiblemente conduce a la agregación. Este es sólo uno de muchos ejemplos de interferencia reguladora de PTM, y la utilidad de esta técnica ayudará a iluminar la importancia de PTMs y su interferencia en la regulación de proteínas clave en salud y enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
fuerte/Eliminación y análisis de ADN genómicosolución salina tamponada con fosfato (PBS) fuerte>
1x		Receta: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
		BLST01	Mezcla patentada de detergentes, sales y otros aditivos tampón
Tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)	tampón		Receta: Tris-HCl, NaCl, SDS, Desoxicolato de sodio, Igepal
Reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (mPER)	Thermofisher	78503	Mezcla patentada de detergentes, sales y otros aditivos tampón
Perforación de lisis por inmunoprecipitación (IP)		87787	Mezcla patentada de detergentes, sales y otros aditivos tampón
Tampón desnaturalizante de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1%	Tampón		Receta: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Tampón		Laemmli	Receta: Tris-HCl, SDS, glicerol, azul de bromofenol
Tampón de dilución BlastR	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Mezcla patentada de detergentes, sales y otros aditivos tampón
Cóctel de inhibidores de proteasa	Cytoskeleton Inc.	PIC02
N-etilmaleimida (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-piridilmetil)etilendiamina (TPEN)	Citoesqueleto Inc.
Trichostatina A (TSA) & Citoesqueleto de nicotinamida	Inc.	TSA01
Ortovanadato de sodio activado (Na3VO4)	Cytoskeleton Inc.	Raspadores celulares PYI01
	Costar	3008
BlastR Filter	Cytoskeleton Inc.	BLR02
BD Aguja de jeringa de insulina	BD	08290-3284-11
sonicador (Branson Sonifier)	Branson	Sonifier 450
Precision Red Advanced Protein Reagent	Cytoskeleton Inc.	ADV02
Cubetas de 1 mL	Espectrofotómetro Fisher	14955127
(Genesys20)	Thermofisher	4001	Se pueden utilizar otros espectrofotómeros para medir la concentración de proteínas
Agarosa	Fisher	BP1356-500
1kb Escalera de ácido desoxirribonucleico (ADN)	NEB	N3232L
Caja de gel de ADN	Thermofisher	7312 B1A
Tampón de Tris/Borato/EDTA (TBE) tampón			Receta: Tris-HCl, ácido bórico, EDTA
fuerte>PTM Inmunoprecipitación
fosfotirosina	Citoesqueleto Inc.	APY03-beads
Cuentas de ubiquitinación	Cytoskeleton Inc.	UBA01-beads
SUMOilation 2/3 beads	Cytoskeleton Inc.		ASM24
Perlas de acetilación	Cytoskeleton Inc.	AAC04-beads
Perlas de control de fosfotirosina	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Perlas de control de ubiquitinación	Cytoskeleton Inc.	CUB02-beads
SUMOilación 2/3 perlas de control	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Perlas de control de acetilación	Cytoskeleton Inc.	CIG02-beads
Tampón de lavado BlastR	Cytoskeleton Inc.	BWB02	Mezcla patentada de detergentes, sales y otros aditivos tampón Tampón de
elución de perlas	Cytoskeleton Inc.	BEB01	Mezcla patentada de detergentes, sales y otros aditivos tampón
microcentrífuga	Eppendorf	5417	Se pueden utilizar otras microcentrífugas
rotor de tubo	ATR	RKVSD	Se pueden utilizar otros rotadores de tubo de extremo a extremo
puntas de carga de proteínas	VWR	37001-150
columnas de centrifugación	Cytoskeleton Inc.	SPN22
95 ° C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transferencia/Análisis occidental
		bromofenol, ditiotreitol (DTT), glicerol, SDS, Tris-HCl
1x Tampón de ejecución	tampón		: Tris-HCl , Glicina, SDS Escalera de
proteínas seeblue Célula	Technologies	LC5625
Célula	Invitrogen	Xcell surelock Se	pueden utilizar otras células de electroforesis, sin embargo, estas son compatibles con los geles novex wedgewell
fuente de alimentación	Biorad	PowerPac HC	pueden utilizar otras fuentes de alimentación
1x Tampón de transferencia	de tampón		: Tris-HCl, glicina, metanol
Celda de transferencia	Mini celda trans-blot	Biorad	pueden utilizar otras celdas de transferencia
Membranas Immobilon-P (PVDF)	millipore	IPVH 304F0
leche descremada	prospera	813503015095
solución salina tamponada Tris con tween (TBST)	tampón		: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Reactivo de detección quimioluminiscente	Cytoskeleton Inc.	CLRA/CLRB
Crecimiento celular y tratamiento
Medio del águila modificada de Dulbecco	ATCC	30-2002
Suero fetal bovino	ATLAS&	nbsp; F-0500-A
Factor de crecimiento epidérmico	Cytoskeleton Inc.	CN02-A
Placas de cultivo celular de 150 mm	Corning	430599