Artículo de método

Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales

DOI:

10.3791/56932

⸱

6 de mayo de 2018

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inyección directa de vesículas extracelulares derivadas de cáncer (EVs) conduce a la reprogramación de la médula ósea apoyando la progresión del tumor; sin embargo, está claro que las células median este efecto. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar EV-mediada de células madre tumorales mesenquimales (MSC) interacciones en vivo, revelando un papel crucial para MSCs EV-educado en metástasis.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el microambiente tumoral, residentes o a las células madre mesenquimales (MSCs) contribuyen a la progresión maligna en varios tipos de cáncer. Bajo la influencia de señales ambientales específicas, estas células madre adultas pueden liberar mediadores paracrinos conduce a crecimiento acelerado del tumor y metástasis. Definición de la diafonía entre tumor y MSCs es de vital importancia para entender los mecanismos subyacentes a la progresión del cáncer y para identificar nuevas dianas para la intervención terapéutica.

Las células cancerosas producen altas cantidades de vesículas extracelulares (EVs), que pueden afectar profundamente el comportamiento de las células Diana en el microambiente del tumor o en sitios distantes. Tumor EVs incluyen biomoléculas funcionales, incluyendo inflamatorios RNAs y proteínas (onco), que pueden educar a células estromales para mejorar el comportamiento metastático de las células cancerosas o para participar en la formación de nichos previamente metastásico. En este artículo, describimos el desarrollo de un modelo de ratón de cáncer preclínico que permite la evaluación específica de la diafonía EV-mediada entre el tumor y las células madre mesenquimales. En primer lugar, describimos la purificación y caracterización de EVs secretada por el tumor y la evaluación de la internalización de EV por MSCs. Entonces hacemos uso de un inmunoensayo multiplex basados en grano para evaluar la alteración del perfil de expresión de citoquinas MSC inducida por cáncer EVs. Por último, ilustramos la generación de un modelo de ratón de xenoinjerto de orthotopic bioluminiscente de osteosarcoma que recapitula la interacción tumor-MSC y mostrar la contribución de la educación EV MSCs a formación crecimiento y metástasis del tumor.

Nuestro modelo ofrece la oportunidad de definir cómo cáncer EVs forma un entorno de apoyo al tumor y para evaluar si el bloqueo de la comunicación mediada por EV entre tumor y MSCs previene la progresión del cáncer.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El microambiente tumoral participa activamente en la mayoría, si no todos, los aspectos de la progresión de la tumorigénesis y cáncer, incluyendo la formación de metástasis y el desarrollo de la resistencia a la terapéutica1. Esto subraya la necesidad de modelos de ratón de cáncer preclínico orthotopic que permite la disección de las interacciones del tumor-estroma complejo que ocurre en el lugar del tumor.

Entre los muchos componentes celulares del microambiente tumoral, las células madre mesenquimales (MSCs) fuertemente contribuir a la progresión del cáncer en varios tipos de cáncer como el cáncer de mama, cáncer de próstata, tumores cerebrales, mieloma múltiple y osteosarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs son células multipotentes que residen en varios tejidos adultos y fetales, incluyendo médula ósea, tejido adiposo, placenta, cordón umbilical y otros8,9. En respuesta a señales inflamatorias generadas por cáncer, MSCs migran hacia sitios de tumor, incorporan en el microambiente del tumor y finalmente se diferencian en células de apoyo de cáncer10. Estas MSCs asociada con el cáncer proporcionan factores esenciales (es decir, factores de crecimiento, quimiocinas, citoquinas y mediadores inmunosupresores) para la progresión del tumor actuando sobre las células tumorales y el estroma circundante2, 3 , 11 , 12 , 13. mientras el tumor-promover efectos de MSCs asociada con el cáncer han sido investigados en numerosos modelos de cáncer, son poco conocidos los mecanismos por los cuales las células del tumor reprogramar MSCs para dar forma a un nicho de promoción de cáncer. Aquí describimos la generación de un modelo de xenoinjerto de orthotopic que permite específicamente el estudio de la interacción pro-tumorigenic entre las células de cáncer de hueso y MSCs mediante vesículas extracelulares (EVs).

EVs son mediadores cruciales de la comunicación intercelular entre el tumor y las células stromal14. EVs llevar biomoléculas funcionales de la célula de origen, incluyendo proteínas, lípidos y RNAs reguladoras. Una vez liberado en el espacio extracelular, estas vesículas pueden ser tomadas por las células circundantes o llevaron a sitios distantes por medio de la sangre o la circulación linfática y profundamente pueden influir el comportamiento de la célula blanco. 15 , 16 , 17 por ejemplo, absorción de cáncer EVs por fibroblastos del estromales puede resultar en miofibroblastos diferenciación apoyo angiogénesis y acelerar el tumor crecimiento en vivo18,19, internalización por endotelial las células pueden estimular la angiogénesis tumoral y aumentar la permeabilidad vascular16,20, y la interacción con las células inmunes podría conducir a la supresión de la respuesta inmune antitumoral21.

Recientemente demostramos, usando un modelo de ratón de xenoinjerto bioluminiscente orthotopic del osteosarcoma, que las células tumorales liberan gran cantidad de EVs que MSCs para adquirir un fenotipo pro-tumorigenic y pro-metastásico. Este efecto es debido a un cambio drástico en el perfil de expresión de citoquinas MSC (denominado "Educación MSC") y puede prevenirse mediante la administración de un anticuerpo de terapéutica del receptor de la interleucina 6 (IL-6R)7. Nuestro trabajo demostró que el cáncer EVs son moduladores cruciales del comportamiento MSC, así proporcionando un análisis razonado para enfoques dirigidos a microambiente detener la progresión de osteosarcoma. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar la MSC de tumor EV-mediada interacción en vivo. Este modelo se pretende: 1) específicamente definir las alteraciones de cáncer EV-inducido del comportamiento MSC en el microambiente tumoral, 2) evaluar cómo esta interacción contribuye a crecimiento de tumor de hueso y formación de metástasis y 3) estudio si interferir con la interferencia mediada por EV en vivo previene la progresión del cáncer.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tejidos adiposos humanos para aislamiento de células madre mesenquimales fueron obtenidos del Departamento de cirugía plástica del Hospital de Tergooi (Hilversum, Holanda) después de la aprobación por el Comité institucional de ética y consentimiento informado por escrito. MSCs adiposos GFP-positivas fueron obtenidos del Departamento de medicina y Ciencias quirúrgicas para niños y adultos (Universidad de Modena y Reggio Emilia).

Los experimentos con animales se realizaron conforme a la Ley holandesa sobre experimentación animal, y el protocolo fue aprobado por la Comisión de experimentación animal del centro médico universitario VU, Ámsterdam, Países Bajos.

1. aislamiento de las vesículas extracelulares secretadas por el Tumor.

  1. Preparar EV-agotado fetales de bovino suero (FBS) por centrifugación FBS a 70.000 x g durante la noche (16 horas), sin freno, a 4 ° C utilizando un rotor cubo ultra que hace pivotar (esperar 1 h para la desaceleración). Recoger cuidadosamente el sobrenadante (EV-agotado FBS) sin perturbar el pellet. Filtro de la FBS EV-agotado con un filtro de 0,22 μm.
  2. Preparar medio de cultivo EV-agotado por suplir medio (IMDM modificado Dulbecco de Iscove) con 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, glutamina 2 mM (1 x P/S/G) y 5% FBS EV-agotado.
  3. 3 x 106 143B células en2 frascos de 175 cm de la semilla y de la cultura en EV-agotado el medio de cultivo en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Cuando las células confluentes de 80-90% (normalmente después de 36 h a 48 h), recoger el sobrenadante de 8 x 175 cm2 frascos (28 mL/frasco) para el aislamiento de EV.
  4. Pre-eliminar el sobrenadante de células para eliminar las células y restos celulares por centrifugación diferencial (centrifugación el sobrenadante de la vuelta anterior cada vez) según el siguiente protocolo:
    1. Centrifugar el sobrenadante dos veces a 500 x g por 10 min.
    2. Centrifugar el sobrenadante dos veces a 2000 x g durante 15 minutos.
    3. Centrifugar el sobrenadante dos veces a 10.000 x g por 30 min.
    4. Realizar todos los centrifugados a 4 ° C con máxima aceleración y desaceleración velocidad ajustes. Después de cada paso, recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene el EV, dejando alrededor de 1 mL. Proceder inmediatamente al paso 1.5 o tienda previamente despejado acondicionado medio a-80 ° C hasta aislamiento de EV.
  5. Aislar EVs por centrifugación el medio condicionado previamente despejado una vez a 70.000 x g durante 1 h, lento freno, a 4 ° C en tubos de centrífuga de ultra (volumen final 38.5 mL/tubo) usando un rotor de cubo ultra que hace pivotar.
  6. Cuidadosamente Quite el sobrenadante, dejando alrededor de 1 mL detrás, resuspender los pellets que contiene EV en el volumen restante, piscina todo en un tubo de ultracentrífuga y agregar solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta tubo completa (volumen final mL 38,5).
  7. Centrifugar nuevamente a 70.000 x g durante 1 h a 4 ° C, sin freno (esperar 1 h para la desaceleración). Cuidadosamente Quite el sobrenadante sin perturbar el sedimento y dejar 100-200 μl.
  8. Resuspender el precipitado de EV y ajustar el volumen final a 200 μL con PBS (estandarizado para todo EV-aislamientos). Utilice la preparación EV inmediatamente o almacenar a-80 ° C hasta uso22.
    Nota: EVs puede ser almacenado 6 meses a-80 ° C.

2. EV caracterización.

EVs purificadas pueden visualizarse por microscopía electrónica (TEM) de transmisión23.

  1. Prepara mezcla EV con un volumen igual de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato.
  2. Capa 200 malla rejillas de níquel TEM Formvar recubiertas de carbón con 5 μl de la suspensión de la EV por 20 min a temperatura ambiente.
  3. Para fijar las muestras EV en rejillas TEM con glutaraldehído al 1% en tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7.0), contraste con oxalato de uranilo (pH 7.0) e integrar en una mezcla de 4% uranilo acetato y 2% metil celulosa en una proporción de 1:9 en el hielo.
  4. Quitar las rejillas con aros de acero inoxidable y secar el exceso de líquido con papel de filtro para garantizar un adecuado espesor de la película de celulosa de metilo.
  5. Después del secado, examinar las rejillas con un microscopio electrónico de transmisión y captura imágenes con una cámara digital juntada con el correspondiente software de imagen.

3. Educación de MSCs por tumor derivado de la EVs.

  1. Preparar medio de cultivo MSC por suplir medio esencial mínimo de alfa (alfa-MEM) con 4% EV-agotado humano lisado plaquetario (hPL)24, heparina (10 U/mL) y 1 x P/S/G.
    Nota: EV-agotado hPL se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en el punto 1.1.
  2. Semillas 1.4 x 106 origen adiposo MSCs cada frasco de 75 cm2 y cultura EV-agotado MSC-medio de cultivo en un incubador a 37 ° C y 5% de CO2.
  3. Cuando las células alcanzan confluencia de 70%, añadir 143B osteosarcoma - o control de fibroblastos humanos (hf)-EVs, 10 μl EV preparación/cm2 del frasco de cultivo. Incubar durante 24 horas y agregar la misma cantidad de EVs para 6 horas adicionales. Nota: Fibroblastos humanos se cultivan en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) 10% FBS y EVs están aislado como se describe en la sección 1.
  4. Recoger el sobrenadante MSC, Centrifugue 1 x a 500 x g durante 5 min a 4 ° C (con máxima aceleración y ajustes de la velocidad de desaceleración), transferir a un tubo nuevo y guarde el sobrenadante despejado a-80 ° C para permitir el análisis del futuro del cytokine (sección 5).
  5. In vivo experimentos (sección 6), educar GFP-positivas MSCs25 descrito en las secciones 3.1 a 3.3, recoger las células y les vuelva a suspender en PBS a una concentración final de 106 células por 100 μl. mantener las células en hielo hasta la inyección.

4. EV internalización ensayo.

Para visualizar la absorción EV por MSCs, EVs con un tinte verde fluorescente vinculador (GFLD) (comercialmente disponible) siguiendo el protocolo del fabricante de la etiqueta:

  1. Brevemente, añadir 180 μl de diluyente a la preparación de EV de 200 μl. Diluya 1 μl de colorante GFLD en 50 μl de diluyente y añadir 20 μl de colorante diluido a la preparación EV diluida.
  2. Suavemente mezclar mediante pipeteo e incubar 3 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Añadir 5 mL de 0.1% de BSA en PBS, transferencia a tubos de centrífuga de ultra y llenar el tubo con PBS (volumen final 38.5 mL/tubo).
  4. Centrifugar 1 x 70.000 x g durante 1 h a 4 ° C, sin freno (esperar 1 h para la desaceleración). Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de EV etiquetado en un volumen final de 200 μl (ajustar volumen con PBS).
  5. Añadir el etiqueta EVs a la cultura MSC o almacenar a-80 ° C. Después de la incubación durante la noche, evaluar la interiorización de la vesícula por microscopía de fluorescencia y flujo cytometry7.

5. evaluación del perfil de expresión de citoquinas MSC.

  1. Para la cuantificación múltiplex de Interleucina-8 (IL-8), interleucina-1β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), factor de necrosis tumoral (TNF) y los niveles de la proteína interleucina - 12p 70 (IL - 12p 70) en el MSC acondicionado medio (ver paso 3.4), utilizar un matriz de grano cytometric comercialmente disponibles (CBA) de las citoquinas inflamatorias humanas siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Brevemente, el conjugado de anticuerpo de captura los granos de la mezcla y añadir a todos los tubos de ensayo. Añadir las diluciones estándar de citocinas o las muestras de medio condicionadas a los tubos.
  3. Añadir el reactivo de detección e incubar 3 horas a TA.
  4. Lavar los granos con la solución de lavado suministrado. Medir las muestras usando un citómetro de flujo y analizar los datos según las instrucciones del fabricante.

6. generación de un modelo de ratón de Orthotopic xenoinjerto de Osteosarcoma.

  1. Permiten ratones Athymic Nude-Foxn1nu seis semanas de edad, mujer, para aclimatarse al menos una semana antes de iniciar los procedimientos experimentales.
  2. Un día antes del procedimiento quirúrgico y como analgesia perioperatoria añadir paracetamol para el agua potable. "Solución de paracetamol para niños" diluido (véase Tabla de materiales) con agua para obtener una concentración final de 2 mg/mL. Basado en un consumo promedio de agua de 150 mL/kg/día, y un peso promedio de 20 g, esta dosis es suficiente para llegar a una dosis de 6 mg/ratón/día (300 mg/kg/día).
  3. Continuar tratamiento analgésico hasta 24 horas después de la operación, o más si los animales muestran signos de dolor.
  4. En el día de la intervención quirúrgica, recoger luciferase-positivo (Fluc) 143B las células cultivadas (previamente generadas por transducción lentivirales) por centrifugación a 300 x g durante 10 min y resuspender las células a una concentración de 2 x 105 células/μl de PBS. Mantener la suspensión de células en hielo 6 horas.
  5. Equipo quirúrgico de la autoclave. Preparar y limpiar la zona de trabajo y las tijeras estériles y pinza en hojas estériles. 20 min antes del procedimiento quirúrgico (paso 6.8), se inyectan los animales por vía subcutánea con buprenorfina (0,05 mg/kg, diluido en solución salina al 0.9%) como analgésico usando jeringas de insulina 0,5 mL (aguja de calibre 29).
  6. Justo antes de anestesiar cada animal, llene una jeringa de 10 μl con al menos 1 μl de la suspensión concentrada de células (Fluc) 143B (ver paso 6.4).
  7. Anestesiar el animal con la anestesia de inhalación isoflurano (2-3% de oxígeno). Compruebe el nivel de anestesia del dedo del pie-pellizcando el animal. Cuando el animal no reacciona a pellizcos, es decir, que es profundamente anestesiado, aplicar ungüento en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
  8. Colocar el animal sobre su espalda con la cabeza en una máscara de la anestesia y con las piernas hacia el operador. Flexión de la rodilla izquierda. Limpie la piel con etanol al 70% y aplicar lidocaína (2%) con una punta de algodón 3 veces como analgésico local.
  9. Use un cuchillo quirúrgico estéril para hacer una pequeña incisión (de aproximadamente 5 mm) en la piel justo debajo de la rodilla para exponer la tibia. Perfore un agujero de alfiler en la tibia, aproximadamente 2 mm por debajo de la rodilla usando un taladro de torcedura micro 0,8 mm. Tener cuidado no a perforar ambas corticales de tibia.
  10. Inyectar la suspensión de células de 1 μl (aproximadamente 2 x 105 células) lentamente (en aproximadamente 5 segundos) en el agujero con una aguja de calibre 26. Cerrar el orificio con una gota de pegamento de tejido para evitar el contraflujo de la suspensión.
  11. Cierre la piel con suturas monofilamento y una gota de pegamento de tejido. Deje que el animal se recupera en un ambiente bien climatizado (uso de una lámpara de calor). No descuide los animales hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Sólo después de que los animales se recuperan totalmente de la anestesia, devolverlos a sus jaulas.
  12. Dos días después de la inoculación del tumor, inyectar EV educado o ingenuo GFP-positivas MSCs (106 células en 100 μl de PBS, vea paso 3.5) por vía intravenosa con una jeringa de insulina de 0,5 mL en la vena de la cola de los ratones.
  13. Seguir el crecimiento del tumor por bioluminiscencia imagen26 dos veces a la semana. Para ello, inyectar el i.p. de ratones con 150 μL de D-luciferin (30 mg/mL) con una jeringa de insulina. Diez minutos después de la inyección, la posición de los animales en la bioluminiscencia sistema de imagen y medir el flujo de fotones generado por las células tumorales.
  14. Además, mida el diámetro del tumor de hueso primario con una pinza. Calcula el volumen del tumor (en mm3) ancho x largo2 x 0.5.
  15. Nota: Criterios de valoración humanas se definición como diámetro tumoral > pérdida de 15 mm o peso > 15%.

7. evaluación del número de nódulo pulmonar

  1. Cuando uno de los animales alcanza el extremo humano definido en el paso 6.14 (en aproximadamente 3-4 semanas), terminar el experimento y recoger y analizar todos los tejidos correspondientes.
  2. Diez minutos antes euthanization, inyectar 150 μL D-luciferin (30 mg/mL) con una jeringa de insulina de 0,5 mL.
  3. Anestesiar los animales con la anestesia de inhalación isoflurano (ver paso 6.7). La profundidad de la anestesia para confirmar la ausencia de reacciones del ratón a pellizcos del dedo del pie. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical27.
  4. Recoger los pulmones, hígado, bazo y riñones con pinzas y tijeras estériles. Lave los órganos en el PBS para eliminar restos de sangre y ponerlos en una placa Petri.
  5. Coloque el plato Petri con los órganos en la bioluminiscencia sistema de imagen. Medir la señal de la bioluminiscencia en ambos lados de los órganos. Inmediatamente después de medir, sumergen a los órganos en formol al 4% para los fijar (24-72 horas, a temperatura ambiente) para futuro análisis histológico.
  6. Procesar las imágenes obtenidas con software de imagen apropiado por umbralización manual. Contar el número de nódulos pulmonares en cada fotografía. Contar el número total de nódulos pulmonares en ambos lados de los pulmones.

8. histológico análisis

  1. Para el análisis histológico de los tejidos pulmonares:
    1. Integrar los órganos fijados con formol en parafina y preparar los portaobjetos de tejido de 6 μm.
    2. Deparaffinate el tejido pulmonar las diapositivas y realizar recuperación de antígeno hirviéndolos durante 15 minutos en tampón de citrato de 0.01 M (pH 6).
    3. Incube los portaobjetos horizontal a temperatura ambiente con anti-humanos vimentina anticuerpo (200 μg/mL) diluido 1: 150 en anticuerpo-diluyente (disponible comercialmente) y posteriormente con el anticuerpo secundario, marcado con HRP (0.5 mg/mL, dilución 1: 500). Manchar los tejidos con 3'-diaminobenzidina (DAB) y tinción de hematoxilina contador.
    4. Observe los portaobjetos de tejido manchado usando un microscopio óptico acoplado a la cámara correspondiente y el software de imágenes.
  2. Para evaluar la presencia de GFP-positivas MSCs en tibias de ratón:
    1. Descalcifique la tibia en ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 0,24 M, pH 7.2-7.4. Actualizar tampón EDTA cada otro día hasta que los huesos se convierten en flexibles (aproximadamente 1 semana).
    2. Deshidratarse osificados e infiltrarse con parafina. Incrustar las tibias (incluyendo tejido de osteosarcoma) en bloques de parafina.
    3. Utilizar un micrótomo para preparar secciones de parafina de 6 μm. Coloque las secciones de parafina en portaobjetos de vidrio. Después de secar, almacenar diapositivas durante la noche a temperatura ambiente.
    4. Realizar recuperación de antígeno mediada por calor con tampón citrato (ver 8.1.2) y teñir los tejidos con el anticuerpo anti-GFP (antisuero entero) en una dilución de 1:900 en diluyente de anticuerpos. Contratinción los tejidos con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    5. Observe los portaobjetos de tejido con un microscopio de fluorescencia juntado al software de proyección de imagen correspondiente.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, se analizó la capacidad de osteosarcoma secretada EVs para educar MSCs hacia un fenotipo pro-tumorigenic y pro-metastásico. Demostramos que las células de osteosarcoma liberan exosomas como EVs que se internalizan por MSCs. Mide la alteración del perfil de expresión de citoquinas MSC inducida por cáncer EVs y se evaluó el efecto de las MSCs EV-educado en crecimiento del tumor y la formación de metástasis. La representación general del diseño de estudio se ilustra en la

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vesículas extracelulares secretadas por el tumor (EVs) pueden alterar la fisiología de las células mesenquimales locales y distantes para generar un ambiente propicio para el tumor. Aquí se describe la generación de un modelo de ratón preclínica de osteosarcoma que permite la disección de las interacciones mediadas por EV entre células tumorales y células madre mesenquimal (MSCs) en vivo. Nos muestran que la inyección sistémica de tumor humano educado EV MSCs en ratones fuertemente xenoinjertos de osteosarcoma p...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.R. Baglio fue apoyado por una beca por la Associazione Italiana por la Ricerca sul Cancro (AIRC) cofinanciado por la Unión Europea. Además, este proyecto ha recibido no financiación del programa de investigación e innovación de horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Convenio de subvención de Marie Sklodowska-Curie 660200 (a S.R. Baglio).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipment
Ultra CentrifugadoraBeckmanOptima L-90K
Rotor SW32TiBeckman369650Referido en el manuscrito como rotor de cangilón ultra-oscilante
Microscopio electrónico de transmisiónZeissEM109O similar TEM
Cámara digitalNikonDMX 1200FO una cámara similar
Software de imagen TEM NikonACT-1
Microscopio de fluorescenciaZeissImager.D2O similar Microscopio de fluorescencia
Software de imagen FMZeissZEN Blue
IncubatorNuaire4750E
CentrífugaHettickROTANTA 460R-80
FreezerThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScaliburO citómetro de flujo similar
TaladroFermFCT-300Con taladro de 0,8 mm
HSS micro brocas helicoidales, 0,8 mmProxxon28 852Taladro de 0,8 mm
Cámara IVISXenogenIvis LuminaReferida en el manuscrito como cámara de bioluminiscencia. Xenogen ahora es parte de Perkin Elmer
Living image software2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen ahora es parte de Perkin Elmer
10 µ L JeringaHamiltonNeuros Modelo 1701 Aguja RN
: Hamilton RN Aguja para Jeringa, Calibre 26, Pointstyle AS, longitud personalizada 2 cmHamiltonn.a.Calibrador
MitutoyoG08004463
AutoclaveAstelln.a.Lámpara
calorPhilipsn.a.
Medios de cultivo
Suero Fetal BovinoHypclonaRYG35912
Lisado de plaquetasn.a.n.a.IMDM
medio LonzaBE12-722F
medio alfa-MEMLonzaBE02-002F
DMEM medioLonzaBE12-614F
pluma/estreptococo/glutaminaGIBCO10378-016
heparinaLEO012866-08
Tripsina/EDTA (10x)GIBCO15400-054
fuertes
adiposo fuertes. MSCs deriverdn.a.n.a.MSCsGFP-positivas
humanosn.a.n.a.
Células 143BATCCCRL-8303
Células FLUC-143BATCCCRL-8303Matraces de cultivo transducidos
desechables
175 cm2CELLSTAR660175
50 mL TubosGreiner bio-one210261
Thermoscientific377224
Tubos ultra-transparentesBeckman 344058Referidos en el manuscrito como tubos ultra-centrífugos
0,22 µ m filtroMillexSLGV033RS
200 malla Rejillas de níquel recubiertas de carbonoEMS (Ciencias de la Microscopía Electrónica)
Jeringas de insulina de 0,5 mL con aguja 29GTerumoU-100 
Placa de PetriSigma - AldrichP7612
Papel de filtro Thermo fisher Scientific50363215
Reactivos / kitsparaformaldehído fuerte Alfa Aeser 43368.9M PBS Braun 220/12257974/110 glutaraldehído EMS (Ciencias de la Microscopía Electrónica)16300 oxalato >de
Ciencias)22510
acetato de uraniaEMS (Ciencias de Microscopía Electrónica)22400
metilcelulosaEMS (Ciencias de Microscopía Electrónica)1560
PKH67Sigmamini67-1ktReferido en el manuscrito como GFLD
BSASigmaA8412
CBA - kit de citocinas inflamatorias humanasBD551811
Formaldehído 37%VWR104003100
Acero al carbono Cuchillas quirúrgicasSwann-Morton206Referido en el manuscrito como bisturí quirúrgico
anti-humano anti-humano vimentina anticuerpoSanta Cruzsc-6260Clon V9
Diluyente de anticuerposDAKOS0809
Marcado con HRP anti ratón Anticuerpo IgG LifeTechnologies32230
DAB-kitDAKOK500711
hematoxilinaSigmaGHS232
tampón EDTAn.a.n.a.tampón
citraton.a.n.a.anticuerpo
policlonal anti-GFPde conejo Abcamn.a.Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
Paracetamol, jarabe de 120 mg / 5 mlBayern.a.Sinaspril, solución de paracetamol para niños
Isoflurano 1000 mg/gFarmacia Vumcn.a.Clorhidrato
buprenofina, 0,3 mg/mlIndivior UK Limited
2%Farmacia Vumcn.a.70
% etanolVWR93003.1006
Pegamento para tejidosDerma+Flex, cianoacrilato médico formuladoVygon
LB604060 Colirios: Vidisec Carbogel, 2 mg/mlBausch+Lombn.a.D-luciferina
, sal de potasioGold BiotechnologyLUCK-1
Portaobjetos de vidrioThermo scientific630-0954
Bucles de acero inoxidable n.a.n.a.
Ratones >
, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,  hembra, 6 semanas a la llegada, estado bacteriano conforme FELASAENVIGOn.a.Pulpa
de papel hogar inteligente (enriquecimiento de jaulas)Bio Servicesn.a.Material
de cama Alpha-driShepperd Speciality Papersn.a.
Alimento para ratones: Teklad global 18% protein roedent dietENVIGO2918-11416M
SuturasEthiconV926H
TijerasSigma-AldrichS3146-1EA(o similar)
PinzasSigma-AldrichF4142-1EA(o similar)
de n.a.n.a.fibroblastos de congelación uranilo EMS (Microscopía Electrónica de de n.a.lidocaína-HCL fuertes

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Secreci n de ves culas extracelularesVE tumoralespurificaci n de VExenoinjerto ortot picoimagen por bioluminiscenciaexpresi n de citocinashoming de MSCmet stasis pulmonarcaptaci n de VE

Artículos relacionados