Inyección directa de vesículas extracelulares derivadas de cáncer (EVs) conduce a la reprogramación de la médula ósea apoyando la progresión del tumor; sin embargo, está claro que las células median este efecto. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar EV-mediada de células madre tumorales mesenquimales (MSC) interacciones en vivo, revelando un papel crucial para MSCs EV-educado en metástasis.
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Artículo de método
Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales
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En este artículo
Resumen
Resumen
En el microambiente tumoral, residentes o a las células madre mesenquimales (MSCs) contribuyen a la progresión maligna en varios tipos de cáncer. Bajo la influencia de señales ambientales específicas, estas células madre adultas pueden liberar mediadores paracrinos conduce a crecimiento acelerado del tumor y metástasis. Definición de la diafonía entre tumor y MSCs es de vital importancia para entender los mecanismos subyacentes a la progresión del cáncer y para identificar nuevas dianas para la intervención terapéutica.
Las células cancerosas producen altas cantidades de vesículas extracelulares (EVs), que pueden afectar profundamente el comportamiento de las células Diana en el microambiente del tumor o en sitios distantes. Tumor EVs incluyen biomoléculas funcionales, incluyendo inflamatorios RNAs y proteínas (onco), que pueden educar a células estromales para mejorar el comportamiento metastático de las células cancerosas o para participar en la formación de nichos previamente metastásico. En este artículo, describimos el desarrollo de un modelo de ratón de cáncer preclínico que permite la evaluación específica de la diafonía EV-mediada entre el tumor y las células madre mesenquimales. En primer lugar, describimos la purificación y caracterización de EVs secretada por el tumor y la evaluación de la internalización de EV por MSCs. Entonces hacemos uso de un inmunoensayo multiplex basados en grano para evaluar la alteración del perfil de expresión de citoquinas MSC inducida por cáncer EVs. Por último, ilustramos la generación de un modelo de ratón de xenoinjerto de orthotopic bioluminiscente de osteosarcoma que recapitula la interacción tumor-MSC y mostrar la contribución de la educación EV MSCs a formación crecimiento y metástasis del tumor.
Nuestro modelo ofrece la oportunidad de definir cómo cáncer EVs forma un entorno de apoyo al tumor y para evaluar si el bloqueo de la comunicación mediada por EV entre tumor y MSCs previene la progresión del cáncer.
Introducción
El microambiente tumoral participa activamente en la mayoría, si no todos, los aspectos de la progresión de la tumorigénesis y cáncer, incluyendo la formación de metástasis y el desarrollo de la resistencia a la terapéutica1. Esto subraya la necesidad de modelos de ratón de cáncer preclínico orthotopic que permite la disección de las interacciones del tumor-estroma complejo que ocurre en el lugar del tumor.
Entre los muchos componentes celulares del microambiente tumoral, las células madre mesenquimales (MSCs) fuertemente contribuir a la progresión del cáncer en varios tipos de cáncer como el cáncer de mama, cáncer d....
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Protocolo
Tejidos adiposos humanos para aislamiento de células madre mesenquimales fueron obtenidos del Departamento de cirugía plástica del Hospital de Tergooi (Hilversum, Holanda) después de la aprobación por el Comité institucional de ética y consentimiento informado por escrito. MSCs adiposos GFP-positivas fueron obtenidos del Departamento de medicina y Ciencias quirúrgicas para niños y adultos (Universidad de Modena y Reggio Emilia).
Los experimentos con animales se realizaron conforme a la Ley holandesa sobre experimentación animal, y el protocolo fue aprobado por la Comisión de experimentación animal del centro médico universitario VU, Ámsterd....
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Resultados
En este estudio, se analizó la capacidad de osteosarcoma secretada EVs para educar MSCs hacia un fenotipo pro-tumorigenic y pro-metastásico. Demostramos que las células de osteosarcoma liberan exosomas como EVs que se internalizan por MSCs. Mide la alteración del perfil de expresión de citoquinas MSC inducida por cáncer EVs y se evaluó el efecto de las MSCs EV-educado en crecimiento del tumor y la formación de metástasis. La representación general del diseño de estudio se ilustra en la
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Discusión
Vesículas extracelulares secretadas por el tumor (EVs) pueden alterar la fisiología de las células mesenquimales locales y distantes para generar un ambiente propicio para el tumor. Aquí se describe la generación de un modelo de ratón preclínica de osteosarcoma que permite la disección de las interacciones mediadas por EV entre células tumorales y células madre mesenquimal (MSCs) en vivo. Nos muestran que la inyección sistémica de tumor humano educado EV MSCs en ratones fuertemente xenoinjertos de osteosarcoma p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
S.R. Baglio fue apoyado por una beca por la Associazione Italiana por la Ricerca sul Cancro (AIRC) cofinanciado por la Unión Europea. Además, este proyecto ha recibido no financiación del programa de investigación e innovación de horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Convenio de subvención de Marie Sklodowska-Curie 660200 (a S.R. Baglio).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Ultra Centrifugadora | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referido en el manuscrito como rotor de cangilón ultra-oscilante |
| Microscopio electrónico de transmisión | Zeiss | EM109 | O similar TEM |
| Cámara digital | Nikon | DMX 1200F | O una cámara similar |
| Software de imagen TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Microscopio de fluorescencia | Zeiss | Imager.D2 | O similar Microscopio de fluorescencia |
| Software de imagen FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrífuga | Hettick | ROTANTA 460R-80 | |
| Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | O citómetro de flujo similar |
| Taladro | Ferm | FCT-300 | Con taladro de 0,8 mm |
| HSS micro brocas helicoidales, 0,8 mm | Proxxon | 28 852 | Taladro de 0,8 mm |
| Cámara IVIS | Xenogen | Ivis Lumina | Referida en el manuscrito como cámara de bioluminiscencia. Xenogen ahora es parte de Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen ahora es parte de Perkin Elmer |
| 10 µ L Jeringa | Hamilton | Neuros Modelo 1701 Aguja RN | |
| : Hamilton RN Aguja para Jeringa, Calibre 26, Pointstyle AS, longitud personalizada 2 cm | Hamilton | n.a.Calibrador | |
| Mitutoyo | G08004463 | ||
| Autoclave | Astell | n.a.Lámpara | |
| calor | Philips | n.a. | |
| Medios de cultivo | |||
| Suero Fetal Bovino | Hypclona | RYG35912 | |
| Lisado de plaquetas | n.a.n.a.IMDM | ||
| medio Lonza | BE12-722F | ||
| medio alfa-MEM | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medio | Lonza | BE12-614F | |
| pluma/estreptococo/glutamina | GIBCO | 10378-016 | |
| heparina | LEO | 012866-08 | |
| Tripsina/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| fuertes | |||
| adiposo fuertes. MSCs deriverd | n.a.n.a.MSCs | GFP-positivas | |
| humanos | n.a.n.a | . | |
| Células 143B | ATCC | CRL-8303 | |
| Células FLUC-143B | ATCC | CRL-8303 | Matraces de cultivo transducidos |
| desechables | |||
| 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL Tubos | Greiner bio-one | 210261 | |
| Thermoscientific | 377224 | ||
| Tubos ultra-transparentes | Beckman 344058 | Referidos en el manuscrito como tubos ultra-centrífugos | |
| 0,22 µ m filtro | Millex | SLGV033RS | |
| 200 malla Rejillas de níquel recubiertas de carbono | EMS (Ciencias de la Microscopía Electrónica) | ||
| Jeringas de insulina de 0,5 mL con aguja 29G | Terumo | U-100 | |
| Placa de Petri | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Papel de filtro | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reactivos / kitsparaformaldehído fuerte Alfa Aeser 43368.9M PBS Braun 220/12257974/110 glutaraldehído EMS (Ciencias de la Microscopía Electrónica)16300 oxalato >de | |||
| Ciencias) | 22510 | ||
| acetato de urania | EMS (Ciencias de Microscopía Electrónica) | 22400 | |
| metilcelulosa | EMS (Ciencias de Microscopía Electrónica) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referido en el manuscrito como GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - kit de citocinas inflamatorias humanas | BD | 551811 | |
| Formaldehído 37% | VWR | 104003100 | |
| Acero al carbono Cuchillas quirúrgicas | Swann-Morton | 206 | Referido en el manuscrito como bisturí quirúrgico |
| anti-humano anti-humano vimentina anticuerpo | Santa Cruz | sc-6260 | Clon V9 |
| Diluyente de anticuerpos | DAKO | S0809 | |
| Marcado con HRP anti ratón Anticuerpo IgG Life | Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxilina | Sigma | GHS232 | |
| tampón EDTA | n.a.n.a.tampón | ||
| citrato | n.a.n.a.anticuerpo | ||
| policlonal anti-GFP | de conejo Abcam | n.a.Ab290 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, jarabe de 120 mg / 5 ml | Bayer | n.a.Sinaspril | , solución de paracetamol para niños |
| Isoflurano 1000 mg/g | Farmacia Vumc | n.a.Clorhidrato | |
| buprenofina, 0,3 mg/ml | Indivior UK Limited | ||
| 2% | Farmacia Vumc | n.a.70 | |
| % etanol | VWR | 93003.1006 | |
| Pegamento para tejidos | Derma+Flex, cianoacrilato médico formulado | Vygon | |
| LB604060 Colirios: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a.D-luciferina | |
| , sal de potasio | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Portaobjetos de vidrio | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Bucles de acero inoxidable | n.a.n.a | . | |
| Ratones > | |||
| , Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, hembra, 6 semanas a la llegada, estado bacteriano conforme FELASA | ENVIGO | n.a.Pulpa | |
| de papel hogar inteligente (enriquecimiento de jaulas) | Bio Services | n.a.Material | |
| de cama Alpha-dri | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Alimento para ratones: Teklad global 18% protein roedent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Suturas | Ethicon | V926H | |
| Tijeras | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (o similar) |
| Pinzas | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (o similar) |
Referencias
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. ....
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Reimpresiones y permisos
