Caracterización de células del Tumor mediante un alambre de médico para la captura de circulación de las células del Tumor: un enfoque 3D basada en la inmunofluorescencia y DNA FISH

CTC representa un paso clave de la difusión de células de cáncer¹. Su presencia en la sangre periférica de pacientes se asocia con (metastásico) recaída y la enfermedad progresión^2,3. CTC aislamiento y caracterización de la sangre de pacientes con cáncer es un tipo de biopsia no invasiva del líquido. En los últimos años se ha vuelto cada vez más evidente que la progresión y la respuesta de los tumores a diferentes tratamientos utilizando este tipo de análisis proporciona importante información clínica^4,5. La biopsia líquida es aún más útil cuando la cirugía no es factible o cuando el tejido del tumor primario no está disponible, es decir, para las lesiones no biopsiable. Por lo tanto, este enfoque es prometedor en configuraciones de cáncer específico como CPCNP metastásico, donde la presencia de CTC ha demostrado tener un papel pronóstico negativo⁶. NSCLC es un tumor que se beneficia especialmente de enfoques terapéuticos específicos^7,8,9 diseñado para actuar sobre determinadas moléculas (dianas moleculares) conocidas por estar involucrado en el crecimiento, la progresión, y propagación de la enfermedad. Por lo tanto, es necesaria la detección de objetivos específicos durante la progresión de la enfermedad. Investigación del CTC es un acercamiento muy interesante de diagnóstico para detectar y monitorear objetivos de medicamentos sin la necesidad de los tejidos primarios o metastásicos. Por ejemplo, la detección de translocaciones de gene ALK en células de CPCNP se asocia con sensibilidad a crizotinib, una terapia dirigida específica¹⁰. Sin embargo, en la actualidad, la detección de translocaciones ALK se ejecuta solamente en aspirados de aguja fina o pequeñas biopsias; en consecuencia, sin un tumor tejido análisis ALK no es posible. CTC es una alternativa potencial al tumor investigaciones basadas en tejidos y representa un acercamiento de diagnóstico altamente prometedor compañero.

A pesar de su importancia potencial, CTC es todavía un tema de gran debate entre la investigación, principalmente debido a su rareza (1-10 células/mL de sangre periférica¹¹). Métodos de biopsia líquida actual usan una cantidad limitada de sangre (es decir, 1-30 mL)^12,13, pero esto crea una situación subóptima sensibilidad para la detección de CTCs. por lo tanto, investigación está garantizada para encontrar enfoques y dispositivos en desarrollo para llevar a cabo biopsias líquidas orientada por CTC en un volumen mayor de sangre periférica.

Un dispositivo alternativo, un alambre médico funcionalizado (véase Tabla de materiales), se ha desarrollado para superar limitaciones del muestreo de sangre y obtener un análisis más representativo de la CTC. Este cable funcionalizado es un dispositivo médico CE aprobado que captura CTC directamente en el torrente sanguíneo de los pacientes de cáncer¹. Se compone de un alambre de acero inoxidable de 16 cm de largo (Figura 1a) con una punta funcionalizada de 2 cm de largo recubierta con una capa de 0,2 μm de espesor de oro. La capa a su vez está cubierta por un estrato de 1 a 5 μm de espesor policarboxilato hidrogel covalente juntado con anticuerpos dirigidos contra el EpCAM, uno de los antígenos más ampliamente expresados en la superficie de CTC¹⁴. La punta funcionalizada del alambre se introduce en una vena del brazo del paciente y permanece en posición durante al menos 30 minutos. Este enfoque permite aislamiento de CTC en vivo, directamente en la sangre periférica y pantalla de 1.5-3.0 L de sangre (aproximadamente 300-fold más que el volumen utilizado para enfoques alternativos)¹.

Pantel et al. demostrado la eficacia de este enfoque en aislar CTCs directamente en las venas del brazo del pulmón cáncer pacientes¹⁵. Se realiza inmunofluorescencia alambre tinción para identificar CTCs utilizando anticuerpos convencionales dirigidos contra EpCAM y cacerola-cytokeratin y CD45 para la detección de leucocitos. El cable fue examinado bajo un microscopio óptico fluorescencia del¹⁵. Los autores demostraron que el dispositivo fue capaz de aislar CTCs, pero no investigar cualquier objetivos relacionados con la terapia, como desplazamientos de ALK.

El método presentado tiene como objetivo identificar supuestos CTCs en líneas celulares NSCLC en base a parámetros fenotípicas, por ejemplo, EpCAM positividad y la presencia de biomarcadores moleculares, por ejemplo el estado alcalino (Figura 1b). Este procedimiento 3-día-largo combina un alambre funcionalizado y la inmunofluorescencia que manchaba con la fluorescencia de ADNin situ-nombre de hibridación (FISH DNA), inmuno-DNA-FISH. Dado que los CTC es entidades raras, la ventaja de este protocolo es que CTC puede caracterizarse en el cable del mismo en términos de características immunophenotypic y reordenamientos de ADN.

1. inmuno-DNA FISH en un cubreobjetos 2D

1. Cubreobjetos preparación y adherente de sembrador de la célula
   Nota: Realice los siguientes pasos bajo una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
   1. Sumerja el cubreobjetos en etanol al 100% para desinfectarlos.
      Nota: Usamos 12 mm × 12 mm admite silicona cuadrado cubreobjetos (todos los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales).
   2. Coloque el cubreobjetos en caja Petri (100 mm de diámetro). Usando obligó a flujo de aire durante 5 minutos.
   3. Lave la placa de Petri con fosfato de 15 mL estéril 1 × Dulbecco tamponada con solución salina (PBS).
   4. Lave la placa de Petri con 10 mL de medio completo (ver tabla 1).
   5. Las células adherentes de la semilla (aproximadamente 1.650.000 células en 10 mL de medio, contada por análisis FACS) dejando caer suavemente la suspensión celular en la caja Petri para obtener placas de célula uniforme (aproximadamente 30.000 células/cm²).
      Nota: De ~ 70% confluencia, adherente se deben cultivar las células sobre cubreobjetos por menos de 48 h.
2. Fijación y permeabilización
   PRECAUCIÓN: La acetona es un inflamable e irritante sustancia volátil. Utilice sólo resistente a la acetona plásticos o envases de vidrio (sin PVC o PVDF).
   Nota: Realice estos pasos bajo una campana de vapores químicos.
   1. Retire el medio de cultivo utilizando una pipeta de aspiración desechable.
   2. Lave la placa de Petri con 1 x PBS.
   3. Con unas pinzas, lavar los cubreobjetos por inmersión en un vaso de vidrio que contiene 5 mL de 1 x PBS.
   4. Seque el cubreobjetos sobre papel secante.
   5. Fije las células sobre cubreobjetos sumergiéndolo en una solución de acetona 100% por 10 min a temperatura ambiente (RT).
   6. Quite el cubreobjetos por pinzas. Seco el cubreobjetos con un flujo de aire forzado durante 5 minutos.
      Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto. El cubreobjetos debe almacenarse a-20 ° C.
3. La inmunofluorescencia día 1
   Nota: Esta etapa consiste en una incubación (O/N) durante la noche (~ 16 h).
   1. Lavar los cubreobjetos 1 x PBS dos veces.
   2. 100 μl de tampón de dilución del anticuerpo de la gota (ver tabla 1 para más detalles) sobre el cubreobjetos e incubar 30 min a TA.
      Nota: El volumen de la solución debe ajustarse sobre la base de la superficie del cubreobjetos para cubrir todo cubreobjetos y evitar el riesgo de desbordamiento.
   3. Preparar la mezcla de anticuerpos (tabla 1) con un 1:20 dilución del anticuerpo primario monoclonal conjugado con fluorocromo y el tampón de dilución, tal como se especifica en la hoja de datos proporcionada por el fabricante.
      Nota: Se recomienda utilizar anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo termoestable. Si se utiliza un fluorocromo no termoestable, la temperatura utilizada durante los pasos de la DNA-FISH del Protocolo puede dañar el fluorocromo y apagar las emisiones fluorescentes. En este protocolo, optamos por un anticuerpo EpCAM-FITC (1:20 dilución), que no presentó ningún problema importante con la temperatura utilizada.
   4. Enjuague el cubreobjetos dos veces en 1 x PBS.
   5. Coloque el lado del cubreobjetos celular hasta en un húmedo cámara y colocar 100 μl de la mezcla de anticuerpos en el cubreobjetos.
      Nota: El volumen de la solución debe ajustarse sobre la base de la superficie del cubreobjetos para cubrir el cubreobjetos todo y disminuir el riesgo de desbordamiento.
   6. Incubar O/N (~ 16 h) en la oscuridad a 4 ° C.
4. La inmunofluorescencia día 2
   1. Bloque de incubación del anticuerpo por lavar los cubreobjetos 1 x PBS dos veces.
      Nota: Tienda el cubreobjetos inmerso en 100 μl de 1 x PBS a 4 ° C en una cámara con ambiente húmedo constante en la oscuridad hasta que se realice el ensayo de pescado.
5. Día 2.o DNA-FISH 2
   PRECAUCIÓN: Debe prestarse especial atención a la alta temperatura de los instrumentos y la cámara húmeda.
   1. Horno de hibridación e horno de calor seco (~ 3 h antes de iniciar el protocolo de la DNA-FISH). Programar el horno de hibridación a 75 ° C, ajustar el horno de calor seco a 37 ° C y enfriar la solución de 0,4 x SSC (pH = 7.0 ± 0.1) (receta de SSC ver tabla 1) a 4 ° C.
      Nota: estado de la pH de búferes de pescado es fundamental: pH = 7,0 ± 0,1.
   2. Lave el cubreobjetos tres veces con solución SSC de × 0,4 helada.
   3. Seque el cubreobjetos bajo una campana de vapores químicos durante 10 min en la oscuridad.
   4. Vortex durante 10 s y realizar un giro rápido hacia abajo (a velocidad máxima) de la sonda de la pared del tubo de la sonda.
   5. Coloque el cubreobjetos celular-lado abajo en una gota de 5 μl de sonda de pesca en una diapositiva y sello todos los bordes del cubreobjetos con pegamento de caucho.
      PRECAUCIÓN: Los dos pasos siguientes implican altas temperaturas. Utilice guantes de protección.
   6. Colocar la corredera en una oscura cámara húmeda en el horno de hibridación durante 8 min a 75 ° C para la desnaturalización completa de ADN.
   7. Mover la cámara húmeda en el horno de calor seco a 37 ° C O/N.
6. DNA-FISH 2D día 3
   1. Configurar el baño de agua a 72 ° C y colocar una jarra de tinción de portaobjetos con tampón de SSC × 0,4 en (tabla 1). Después de 30 min, comprobar la temperatura del buffer 0.4 × SSC, que debe ser a 72 ± 1 ° C.
   2. Prepare dos vasos de cristal: uno con 2 x SSC + 0.05% Tween buffer (pH = 7.0 ± 0.1) (tabla 1) y un segundo con agua destilada.
   3. Sacar la cámara húmeda del horno, con cuidado quitar el pegamento de goma de la diapositiva y separar el cubreobjetos con la pinza.
   4. Lavar lo cubreobjetos sumergiendo en 0,4 x SSC por 2 min a 72 ° C.
   5. Lavar lo cubreobjetos sumergiendo en 2 x SSC + 0.05% Tween buffer durante 30 s.
   6. Enjuague el cubreobjetos en agua destilada.
   7. Seque el cubreobjetos bajo una campana de vapores químicos durante 10 min en la oscuridad.
   8. Coloque el cubreobjetos en medio líquido de montaje con 1.5 μg/mL de 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para contratinción ADN total. Coloque el cubreobjetos celular-lado abajo en una gota de 5 μl de medio de montaje en un portaobjetos, pulse la pinza sobre el cubreobjetos para obtener el aire hacia fuera y sellado con esmalte de uñas.
      Nota: Volumen medio de montaje debe ajustarse basándose en el tamaño de la superficie del cubreobjetos.
7. Análisis y observación microscopio 2D
   Nota: Imágenes pueden ser adquiridas con los sistemas del microscopio diferentes.

1. Adquisición de imágenes mediante una cámara digital de 12 bits y 20 × / 0.50 NA y objetivo de 40 x/0.65 NA con filtros adecuados para el rojo (excitación: 599 nm, emisión: 588 nm), verde (excitación: 509, emisión: 524) y azul (excitación: 367 nm, emisión: 452 nm) sondas.
2. Analizar imágenes usando la herramienta de elección.
   Nota: Para evaluar la tinción de inmunofluorescencia y la localización de la sonda de ALK, utilizamos ImageJ. Diapositivas pueden almacenarse a-20 ° C en la oscuridad durante un máximo de 3 semanas. Para un almacenamiento prolongado, nosotros sugerimos utilizar medio de montaje específico para el almacenamiento a largo plazo.

2. inmuno-DNA FISH en alambre

1. De la célula línea spike en alambre (soporte 3D)
   Nota: Configuración preliminar implica una precisa selección de adherente líneas basadas en EpCAM-positividad de las células. El alambre es funcionalizado con anticuerpos anti-EpCAM para que sólo EpCAM positivos células se tiñen.
   Nota: No toque la parte funcionalizada del cable para evitar daños.
   Nota: Todos los pasos deben llevarse a cabo bajo una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
   1. Resuspender el contenido de un frasco de T75 (confluencia del 80%) en un vial de 5 mL con 4 mL de medio completo; para un solo punto, las células aproximadamente 2.000.000 se recomiendan para maximizar la adherencia de las células al alambre.
   2. Quite el cable de su envase de vidrio.
   3. Sumerja la parte de oro funcionalizada del hilo en el frasco, asegurándose de que el tapón de alambre es un ajuste hermético para el vial. Sello con la película de laboratorio.
      Nota: Se recomienda el uso de tubo de 5 mL para permitir un correcto partido entre el tapón de alambre y el frasco.
   4. Incubar por 30 min a temperatura ambiente en un agitador de tubo (0-120 ángulo).
   5. Enjuague el hilo tres veces 1 x PBS solución 3 diferentes frascos limpios.
2. Fijación y permeabilización
   PRECAUCIÓN: La acetona es una sustancia inflamable que puede irritar las vías respiratorias. Sólo uso resistente a la acetona plásticos o envases de vidrio (sin PVC o PVDF).
   Nota: Realice estos pasos bajo una campana de vapores químicos.
   1. Deje secar al aire el hilo.
   2. Fijar las células sumergiendo el alambre en la solución de acetona 100% durante 10 minutos a RT. uso un tubo de 5 mL.
      Nota: El tapón de alambre no debe entrar en contacto con el fijador.
   3. Seque el cable durante 5 min a TA.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. El alambre debe almacenarse a-20 ° C. Al embalar el alambre para almacenamiento a largo plazo, coloque el tapón de alambre junto a la punta funcionalizado y cuidadosamente Inserte el cable en el tubo de vidrio de almacenamiento, teniendo cuidado de no para dañar la punta funcionalizada. Cerrar el vaso de almacenamiento y guardar (vertical u horizontalmente) a-20 ° C.
3. La inmunofluorescencia día 1
   Nota: Esta etapa consiste en una incubación de O/N (~ 16 h).
   1. Lavar dos veces en 1 x solución de PBS con tubo de 5 mL.
   2. Incubar el hilo del tampón de dilución de anticuerpo por 30 min a temperatura ambiente utilizando tubo de 5 mL.
   3. Preparar 150 μL de la mezcla de anticuerpos con una dilución del anticuerpo primario monoclonal conjugado con fluorocromo en tampón de dilución del anticuerpo, como se especifica en la hoja de datos. Por ejemplo, anticuerpo EpCAM-FITC se utilizó con un 1:20 dilución.
   4. Utilice una punta de p200 para realizar la incubación, como sigue: Extraiga el cable de alambre-tapón e inserte suavemente el cable a través del orificio más grande de la punta. Introducir primero el lado unfunctionalized y lentamente tire del cable a través del orificio más pequeño hasta que el oro es más allá del agujero más grande.
   5. Suavemente la gota 150 μL de la mezcla de anticuerpos (por ejemplo anti EpCAM_FITC anticuerpos 1:20 diluido) en la punta. Para evitar el riesgo de formación de burbujas, agitar suavemente el alambre hasta que la parte funcionalizada es completamente sumergida.
   6. Sello hasta el orificio de la punta. Envuelve la película de laboratorio alrededor del agujero puede ayudar.
   7. Incubar verticalmente O/N (~ 16 h) en la oscuridad a 4 ° C.
4. Día de inmunofluorescencia 2
   1. Bloque de incubación del anticuerpo por lavar el hilo dos veces en 1 x PBS.
   2. Vuelva a insertar el cable en su tapón de alambre.
      Nota: Tienda de 1 X PBS a 4 ° C de 5 mL frasco hasta que se realice el ensayo de pescado.
5. DNA-FISH 3D día 2
   PRECAUCIÓN: Debe prestarse atención especial a la alta temperatura de los instrumentos y cámara húmeda.
   1. Horno de hibridación e horno de calor seco (~ 3 h antes de iniciar el protocolo de la DNA-FISH). Programar el horno de hibridación a 75 ° C, ajustar el horno de calor seco a 37 ° C y enfriar la solución de 0,4 x SSC (pH = 7.0 ± 0.1) a 4 ° C.
      Nota: El estado de la pH de búferes de peces es fundamental y debe ser 7.0 ± 0.1.
   2. Lave el alambre 3 veces en solución SSC de × 0,4 helada.
      Nota: Mantenga el cable en la oscuridad para evitar el fluorocromo fotoblanqueo durante los siguientes procedimientos.
   3. Seco durante 10 min en la oscuridad bajo la vitrina.
   4. Mezclar y hacer girar la sonda para 5 s.
   5. Coloque 10 μl de la sonda en microtubos theglass. Cubra con película de laboratorio.
   6. Los microtubos de la vuelta como sigue: envolver el microtubo en seco absorbente, papel puesto en un tubo de 50 mL y centrifugar brevemente.
   7. Con cuidado coloque el cable seco en el microtubo e Inserte el tapón de alambre. Selle con pegamento de caucho.
      PRECAUCIÓN: Los dos pasos siguientes implican altas temperaturas.

Utilizando el procedimiento descrito anteriormente es posible realizar un ensayo inmuno-DNA FISH en CTC (u otras células equivalentes) enriquecido por el alambre funcionalizado. Antes de configurar este protocolo, la compatibilidad de las dos técnicas fue determinada (inmuno-fluorescencia con pescado) sobre soportes 2D estándar. Se seleccionaron dos diferentes NSCLC líneas celulares expresan EpCAM (necesaria para adherirse al cable juntado con los anticuerpos contra EpCAM). Tienen un diverso estado ALK, que es útil para probar diferentes condiciones iniciales. La primera, NCI-H1975, tienen genes ALK de tipo salvaje (WT), mientras que el segundo, NCI-H3122, se caracteriza por desplazamientos de ALK.

Se utilizó un sistema de detección rotura aparte de gene ALK para el ensayo FISH. El sistema consta de dos sondas, uno (naranja) cruza por hibridación a la región proximal dentro de ALK en 23 p 2 y (verde) hibridación distal a ALK. Soporte 2D, inmuno-DNA FISH proporciona señales bien definidas para el anticuerpo y la punta de prueba (figura 2). En particular, tanto de células demostrada la localización de membrana EpCAM bien definido. Además, las señales de la sonda aparecían brillante y aguda: las células NCI-H1975 mostraron superposición sondas naranjas y verdes, confirmando el estado de tipo salvaje del gen ALK (Figura 2a, b). Por el contrario, las células NCI-H3122 demostraron señales superpuestas y solo puntos verdes, lo que refleja una canceladura del gene de ALK (figura 2C, d). Cuando se realizó el ensayo de inmuno-DNA FISH en el 3D ayuda alambre funcionalizado, señales de la sonda y el anticuerpo eran generalmente menos definidas que en el soporte 2D. EpCAM coloración era visible. ALK sonda señales eran menos definido pero aún refleja el estado esperado de ALK (figura 3). Los resultados mostraron que tinción de inmunofluorescencia no interfirió con las señales de ADN de peces. Las sondas hibridación específicamente con sus objetivos. Línea de celular NCI-H3122 mostró un estado aberrante del gene ALK (figura 3b), en contraste con NCI-H1975, con un gene de ALK de tipo salvaje (figura 3a).

Figura 1 : Funcionalizados alambre, arreglo esquemático de ALK break-apart sondas, esquema de patrones esperados de cambio de ALK y soporte especial. (a) rojo cajas de destacan las tres partes principales del alambre: funcionalizados punta, tapón de alambre y la punta no funcionalizado. La punta funcionalizada es la parte más delicada del alambre y no debe ser tocada durante la manipulación para evitar daño o desprendimiento de la célula. (b) el verdes y rojos las puntas de prueba cada que respectivamente se unen a secuencias ascendentes y descendentes de los lugares geométricos del gene de ALK (a la izquierda). A la derecha, se muestran patrones ejemplificativo de arreglos de ALK. Señales de localización Co rojo y verde en las células normales; las señales verdes y rojas separadas indican una rotura ALK gen cromosoma (translocación del gen ALK) y la señal de una colocalización de verde-naranja (célula aberrante-1). Una señal roja y dos señales verdes que indican la pérdida de una señal roja, lo que sugiere un desplazamiento cromosómico y una canceladura (célula aberrante-2). (c) alambre de soporte; Cajas rojas destacan las áreas donde se necesita cuidado al manipular el cable durante el análisis de microscopía. El cable puede someterse a un análisis de 360 °, girando el rotor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Ensayo de inmuno-ADN FISH en soporte 2D (cubreobjetos). (a, b) NCI-H1975 células débilmente positiva para EpCAM. FITC EpCAM señales eran apreciables. Las sondas de color naranjas y verdes de ALK break-apart comprometidos, confirmando el estado de la WT de gene de ALK en línea celular de NCIH1975. Mostrar más de dos señales apareadas las células estaban presentes debido a su aneuploide. (c, d) En la alta línea de celular de NCIH3122 expresando EpCAM, inmunofluorescencia señales eran brillantes, que se acentuó en las ensambladuras de la célula. PESCADO análisis confirmadas canceladuras del gene de ALK, típico de esta línea celular. Flechas rojas indican solo verdes las puntas de prueba (sin sondas naranja correspondientes), reflejando la canceladura del gene de ALK. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Inmuno-DNA FISH ensayo utilizando el alambre funcionalizado como soporte 3D. (un) representante de imagen de las células NCI-H1975 en el cable. Aunque la forma 3D de las células en el cable son difíciles de adquirir imágenes totalmente en el enfoque, EpCAM señal es bien visible en todas las células. imagen de (b) representante de las células NCI-H3122 en el cable. Sondas ALK demostraron la canceladura del gene (flechas rojas), como se ha visto en el soporte 2D. Las señales de fondo visibles eran probablemente debido a la presencia de la capa de polímero. Sin embargo, no afectó significativamente el análisis identificación o fluorescencia de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Recetas de soluciones.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.