Artículo de método

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

DOI:

10.3791/56953

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10 de enero de 2018

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1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

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Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.

Resumen

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Determinación de la estructura integral del factor de ensamblaje del ribosoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es un reto debido a la desordenada y proteasa lábil c-término de la proteína. Este manuscrito describe los métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análisis estructural por cristalografía de rayos x y SAXS. Cristalografía de rayos x fue utilizado para resolver la estructura del dominio N-terminal WD40 ordenado de Nsa1, y luego SAXS se utilizó para resolver la estructura de la terminal C de Nsa1 en solución. Se recopilaron datos de dispersión de solución de larga duración Nsa1 en solución. Las amplitudes de la dispersión teórica se calcularon a partir de la estructura cristalina de alta resolución de dominio WD40, y luego una combinación de cuerpos rígidos y modelado ab initio reveló el c-término de Nsa1. A través de este enfoque híbrido fue reconstruida la estructura cuaternaria de la proteína entera. Los métodos presentados aquí deben ser generalmente aplicables para la determinación estructural híbrido de otras proteínas compuesto por una mezcla de dominios estructurados y no estructurados.

Introducción

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Los ribosomas son máquinas grandes ribonucleoproteína que llevan a cabo el papel esencial de la traducción de mRNA en las proteínas en todas las células vivas. Los ribosomas están compuestos de dos subunidades que se fabrican en un proceso complejo llamado ribosoma biogénesis1,2,3,4. Ensamblaje del ribosoma eucariotas se basa en la ayuda de cientos de Asamblea ribosomal esenciales factores2,3,5. Nsa1 (Nop7 asociado 1) es un factor de ensamblaje ribosoma eucariota que es específicamente necesario para la producción de la subunidad ribosomal grande6, y es conocido como WD-repetición que contiene 74 (WDR74) en los organismos superiores7. WDR74 se ha demostrado que se requiere para la formación de blastocistos en ratones8y el promotor de WDR74 es frecuentemente mutado en cáncer células9. Sin embargo, la función y mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 conjunto de ribosomas siguen siendo en gran parte desconocidos. Para comenzar a descubrir el papel de Nsa1/WDR74 durante la maduración de los ribosomas eucarióticos, se realizaron múltiples análisis estructurales, incluyendo la cristalografía de rayos x y ángulo pequeño (SAXS) la dispersión de rayos x10.

Cristalografía de rayos x, resonancia magnética nuclear (NMR) espectroscopia, microscopia electrónica y SAXS son técnicas importantes para el estudio de la estructura macromolecular. Tamaño, forma, la disponibilidad y estabilidad de las influencias de macromoléculas adecuado el método de la biología estructural que una macromolécula particular será mejor, sin embargo la combinación de múltiples técnicas a través de un enfoque llamado "híbrido" se está convirtiendo en un cada vez más beneficiosa herramienta11. En particular la cristalografía de rayos x y SAXS son métodos potentes y complementarios para la determinación estructural de macromoléculas12.

Cristalografía provee alta resolución estructuras atómicas que van desde moléculas pequeñas hasta grandes máquinas celulares como los ribosomas y ha conducido a numerosos avances en la comprensión de las funciones biológicas de las proteínas y otras macromoléculas13. Además, el diseño de fármacos basado en estructura aprovecha el poder de las estructuras cristalinas de acoplamiento molecular por métodos computacionales, añadiendo una dimensión crítica a drug discovery y desarrollo14. A pesar de su amplia aplicabilidad, sistemas flexibles y desordenados son difíciles de evaluar por cristalografía como embalaje de cristal puede ser obstaculizado o mapas de densidad de electrones pueden ser incompletas o de mala calidad. Por el contrario, SAXS es un enfoque estructural basado en la solución y baja resolución, capaz de describir sistemas flexibles que van desde bucles desordenados y termini a proteínas intrínsicamente desordenadas12,15,16. Teniendo en cuenta que es compatible con una amplia gama de tamaños de partícula12, SAXS puede trabajar sinérgicamente con Cristalografía para ampliar la gama de cuestiones biológicas que pueden ser abordadas por los estudios estructurales.

Nsa1 es adecuado para un enfoque estructural híbrido ya que contiene un dominio WD40 bien estructurado seguido de una funcional pero flexible C-terminal que no es sensible a los métodos de Cristalografía de rayos x. Siguiente es un protocolo para la clonación, expresión y purificación de Nsa1 S. cerevisiae para la determinación estructural híbrido por cristalografía de rayos x y SAXS. Este protocolo puede ser adaptado para estudiar las estructuras de otras proteínas que constan de una combinación de regiones ordenadas y desordenadas.

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Protocolo

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1. producción de proteínas recombinantes y purificación de Nsa 1

  1. Diseño de plásmido de expresión Nsa1 y clonación
    1. Obtener o comprar ADN genómico de S. cerevisiae .
    2. PCR amplificación de las secuencias diana de Nsa1 (Nsa1FL, residuos 1-463) y c-terminal truncado Nsa1 (Nsa1ΔC, residuos 1-434) con adecuados primers usando ADN genómico aislado de S. cerevisiae y una temperatura de fusión 60 ° C aproximadamente con un tiempo de extensión de 1-2 min. Se utilizaron los siguientes iniciadores para amplificar Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Subclone Nsa1 en la expresión de Escherichia coli (e. coli) vector pHMBP que contiene un N-terminal 6 etiqueta histidina X seguida de la proteína maltosa vinculante (MBP) y un sitio de proteasa de tabaco Etch Virus (TEV) usando técnicas de clonación estándar17 .
    4. Utilice la secuencia de la DNA para verificar que Nsa1 fue clonado en marco con la etiqueta de su MBP del N-terminal.
  2. Expresión de la proteína Nsa1
    1. Transformar la expresión plasmid(s) en un adecuado e. coli cepa de expresión con un sistema de basado en el promotor de T7. Transformantes en placas de agar LB con ampicilina 100 de μg/mL de la placa e incubar la placa invertida durante la noche a 37 ° C.
    2. Sembrar una cultura de 50 mL de LB con ampicilina 100 de μg/mL de la placa de transformación y crecer durante la noche con agitación a 200 rpm a 37 ° C.
    3. Inocular 3 x 1000 mL de LB en matraces Fernbach con 100 ampicilina μg/mL con 15 mL del cultivo durante la noche y crecer con agitación a 200 rpm a 37 ° C.
      Nota: Para la solución de la estructura de la proteína, selenomethionyl (SeMet) incorporación se puede alcanzar por las células de crecimiento en medio mínimo M9 que se complementa con SeMet y una mezcla de aminoácidos para inhibir la producción de metionina antes de la inducción, en contraposición a LB medios 18.
    4. Inducen la expresión de Nsa1 cuando el OD600 alcanza ~0.8 por adición de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM seguida de incubación a 25 ° C durante la noche con agitación a 200 rpm.
    5. Recoger las células por centrifugación a 4 ° C por 15 min a 5.050 x g.
      Nota: Las células pueden almacenadas a largo plazo a-80 ° C o utiliza inmediatamente para la purificación de la proteína.
  3. Purificación de proteínas Nsa1
    1. Resuspender las células en 25 mL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10% glicerol, 10 mM de MgCl2) previamente enfriada a 4 ° C con un libre de EDTA proteasa inhibidor de la tableta.
    2. Lyse las células por sonicación a 4 ° C (tiempo 7 minutos, 2 s en el ciclo, 2 s ciclo; amplitud: 70%).
    3. Aclarar lisado por centrifugación a 26.900 x g por 45 min a 4 ° C.
    4. Aplicar aclaró lisado a una columna de flujo de gravedad cargada con 10 mL de resina de afinidad inmovilizado cobalto, previamente equilibrada con el tampón de lisis.
    5. Permiten el sobrenadante sobre la resina de flujo por gravedad a 4 ° C y lavar la resina dos veces con 100 mL de tampón de lisis.
    6. Eluir Nsa1 con 20 mL de tampón de elución (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM de MgCl2, 5% de glicerol e imidazol de 200 mM).
    7. Tomar 15 μL de eluido y ejecutarlo en un gel de SDS-PAGE 4-15% para verificar que la proteína es eluida de la resina de afinidad (figura 1A).
    8. Quite la etiqueta MBP por digestión de proteasa TEV. Añadir 1 mL de TEV proteasa19 (stock de 1 mg/mL) a la elución de la resina de afinidad Nsa1 e incubar a 4 ° C durante la noche.
    9. Concentrado de MBP troceados Nsa1 a ~ cortan de 5 mL mediante un filtro centrífugo con un peso molecular de 10 kDa.
    10. Nsa1 MBP-hendida se aplican a una columna de gel filtración, previamente equilibrada en tampón (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% de glicerol y 1 mM β-mercaptoetanol) (figura 1B).
    11. Análisis de fracciones de la columna de gel filtración para verificar que el MBP es hendida y separado de Nsa1 ejecutando 15 muestras μL en un gel de SDS-PAGE 4-15% (figura 1B).
    12. Combinar fracciones que contengan Nsa1 y concentrar a 8 mg/mL usando un filtro centrífugo con un peso molecular que se cortan de 10 kDa.
    13. Determinar la concentración de proteína mediante la medición de la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro usando la extinción coeficiente 42530 M–1cm–1. Use inmediatamente proteína proteolítica ensayos de cribado y la cristalización.

2. cristalización y proteolítica proyección de Nsa 1

  1. Proyección de cristal matriz escasa de Nsa1
    1. Centrifugar 500 μL del stock de 8 mg/mL de Nsa1 a 16.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
    2. Ensayos de cristalización con un robot de cristalización y escasa matriz cristal pantallas de configuración. Llene el depósito de 96 bandejas bien con 30 μl de los reactivos de la pantalla de cristal individuales de las pantallas de matriz escasa cristalización. Configuración de sesión gotas con el robot mezclando 250 nL de la solución bien con 250 nL de la solución de proteína.
    3. Las placas de cristalización con la cinta del sello e incubar a 25 ° C.
    4. Inspeccione las placas cada dos días durante las primeras 2-3 semanas con un estereomicroscopio.
    5. Compruebe que potenciales hits cristales contienen proteínas con un microscopio de rayos UV.
      Nota: Para dos formas de cristal diferentes Nsa1 (cúbicas y ortorrómbico, figura 2A) se obtuvieron dentro de 1 semana a partir de las siguientes pantallas: JCSG + condición B11 (1,6 M de citrato de sodio tribásico deshidratar, pH 6,5) y asistente de precipitante sinergia pantalla bloque 2 condición C11 (20.1%(v/v) PEG 1500 13.4%(v/v) PEG 400, hidróxido de sodio HEPES Tris de 0,1 M, pH 7,5).
  2. Proyección proteolítica
    Nota: Durante la optimización de la cristalización, se descubrió que los cristales ortorrómbico de Nsa1 surgieron como consecuencia del clivaje proteolítico y no se podrían duplicar los cristales utilizando la proteína completa. Usando una combinación de proteólisis limitada acoplada con espectrometría de masas, se determinó que el C-terminal de Nsa1 era sensible a la proteolisis y eliminación de la cola del c-terminal se requiere para la posterior reproducción del (de forma cristalina ortorrómbica Nsa1ΔC).
    1. Preparar 1 mg/mL soluciones proteasa de las siguientes proteasas α-quimotripsina, tripsina, elastasa, papaína, especifidad y endoproteinasas Glu-C.
    2. Crear 1:10, 1: 100 y diluciones de 1: 1000 de cada acción de la proteasa de 1 mg/mL con tampón de dilución (10 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM cloruro sódico).
    3. Pipetear 1 μL de la acción de la proteasa (1:10, 1: 100 y 1: 1000) en 9 partes alícuotas μL de proteínas (1 mg/mL) para cada proteasa ser proyectada.
    4. Incubar la solución a 37 ° C durante 1 hora.
    5. Detener la reacción añadiendo 10 μL de tampón de muestra de SDS-PAGE de x 2 y el calor de la reacción a 95 ° C por 5 min.
    6. Análisis de los resúmenes por correr en un gel de SDS-PAGE 4-15% (figura 2B).
    7. Identificar los dominios resistente a la proteasa de la proteína diana por análisis de espectrometría de masas en gel.
    8. Retire las regiones lábiles a la proteasa de la proteína diana creando construcciones expresión truncada y siguiendo el protocolo de clonación, expresión y purificación descritos anteriormente.
  3. Optimización de cristalización
    1. Preparar u obtener soluciones de los siguientes reactivos de cristalización inicial: 1,6 M de citrato de sodio tribásico deshidratar pH 6.5 100%(v/v) PEG 400, 50%(v/v) PEG 1500, hidróxido de sodio HEPES de 1 M, pH 7,5.
    2. Preparar una solución stock de Nsa1FL y Nsa1ΔC 8 mg/ml como se describe anteriormente.
    3. Optimizar los cristales cúbicos Nsa1 (Nsa1FL).
      1. Preparar una pantalla de rejilla de 24 pocillos con pozos que contienen 500 μl con una inclinación de 1-1.6 M de citrato de sodio con pH 6,5 de una solución madre de 1.6 M de citrato de sodio tribásico con pH 6.5.
      2. Mezclar 1 μl de proteína con 1 μl de solución bien y coloque la mezcla en una diapositiva de cubierta siliconado. Cuidadosamente invertir la diapositiva de cubierta encima de la previamente engrasado bien y asegurarse de que está bien sellado, pero tenga cuidado de no disturbar la gota o romper la diapositiva de cubierta. Repita este proceso hasta que la bandeja esté llena y luego almacenar a 25 ° C.
        Nota: Deben aparecer pequeños cristales cúbicos en 2-7 días.
      3. Preparar un stock de microseed de los cristales cúbicos. Utilizar un lazo de nylon montados para transferir pequeños cristales cúbicos de ~ 10 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene una pequeña cantidad y 50 μl de pH de 1.6 M citrato de sodio tribásico ingenio 6,5.
      4. Vórtice el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a alta velocidad (~ 3000 rpm) durante 1 minuto.
      5. Realizar una serie de diluciones seriadas 10 veces de la semilla con 1.6 M de citrato de sodio tribásico y agitar la mezcla durante 5 s.
      6. Llene cada uno bien de una cuadrícula de 24 pocillos, pantalla con 500 μl de 1.6 M citrato de sodio tribásico pH 6,5.
      7. Optimizar las condiciones de microseeding configuración de gotas con diferentes proporciones de proteína con las soluciones de la semilla (Figura 3A). Grandes cristales cúbicos de calidad alta difracción deben aparecer en 2-5 días (figura 3).
    4. Optimizar los cristales ortorrómbico (Nsa1ΔC)
      1. Preparar una pantalla de la rejilla con 500 μL en cada pocillo con 24 diferentes condiciones (figura 3B) de las soluciones madre de 50%(v/v) PEG 1500 y PEG 400 de 100%(v/v). Además de los gradientes de PEG 1500 y PEG 400, cada uno bien también debe contener 0.1 M pH de hidróxido de sodio HEPES 7.5.
      2. Mezclar 1 μl de solución de proteína con 1 μl de solución bien en una diapositiva de cubierta siliconado. Con cuidado, invertir la diapositiva de cubierta encima de la previamente engrasado bien y asegurarse de que está bien sellado. Repita este proceso hasta que la bandeja entera se ha llenado. Almacenar las bandejas a 25 ° C.
        Nota: Deben aparecer cristales ortorrómbica Nsa1 en 2-7 días.
      3. Optimizar aún más los cristales ortorrómbico por microseeding como se describe para los cristales cúbicos (pasos 2.3.3.3 a 2.3.3.7) con 500 μl de 20.1%(v/v) PEG 1500, 13.4%(v/v) PEG 400 y 0.1 M pH de hidróxido de sodio HEPES 7.5 como la solución bien.
        Nota: Cristales Nsa1 SeMet deben optimizarse análogo a los cristales nativos.

3. Nsa 1 estructura de la solución y recolección de datos de difracción de rayos x

  1. Cryo-protección de cristales y recopilación de datos de difracción de rayos x
    1. Para los cristales ortorrómbico (Nsa1ΔC), preparar una solución de crioprotector de 1 mL que contiene 22.5%(v/v) PEG 1500, 15%(v/v) PEG 400 y 0.1 M HEPES sodio hidróxido pH 7.5.
    2. Llene una espuma Dewar con nitrógeno líquido y pre-enfriar un disco de cristal. Tenga cuidado cuando trabaje con nitrógeno líquido y utilice gafas y guantes protectores.
    3. Invertir con cuidado el portaobjetos de la cubierta de la cristalización bien que contiene cristales en el escenario de un estereomicroscopio.
    4. Pipetear 2 μl de la solución de crioprotector en una nueva diapositiva de cubierta.
    5. Colocar un lazo de nylon montados del tamaño adecuado para el cristal a una varita magnética crio.
    6. Con la ayuda del estereomicroscopio, transferir rápidamente un cristal a la solución de crioprotector con el lazo de cryo montado.
    7. Dejar el cristal equilibre durante 5 min en la solución de crioprotector.
    8. Con la ayuda del estereomicroscopio, lazo rápidamente el cristal de la solución crioprotector y la penetración de congelar en nitrógeno líquido.
    9. Espere a que el nitrógeno líquido alrededor del bucle dejar hervir y luego suelte el bucle de la varilla en una ubicación específica en el disco de cristal.
    10. Nsa1 cúbicos cristales deFL no es necesario ser cryoprotected y puede ser directamente flash congelado (tras 3.1.8-3.1.9 de pasos anteriores).
    11. Sello el disco de cristal con cryo herramientas y transferir a un bastón de envío en un dewar previamente enfriada. Almacén cristales en discos/termos hasta recolección de datos.
    12. Si la recogida de datos en un sincrotrón, nave de cristales para el sincrotrón utilizando un cargador seco.
    13. Recopilar datos de difracción de rayos x después de técnicas estándar de20.
      Nota: Para Nsa1 nativo y SAD (sola longitud de onda de dispersión anómala) conjuntos de datos fueron recogidos en 100 K en las líneas de haz de SER-CAT ID-22 y 22-BM de la fuente de fotones de avanzada en el laboratorio nacional de Argonne (Chicago, IL). El conjunto de datos SAD Nsa1 recogió a λ = 0.97911 Å. Datos se graban utilizando un tiempo de exposición de 1 s y oscilaciones de 0,5 °. El mosaicity de estos cristales era típicamente alrededor de 0,3 °.
    14. Proceso y escala de las imágenes de difracción de rayos x para generar archivos de reflexión para cada conjunto de datos en el grupo apropiado.
      Nota: Los conjuntos de datos de difracción Nsa1 fueron procesados con HKL200021. Los cristales cúbicos Nsa1 fueron procesados en el espacio grupo P213 y los cristales ortorrómbico fueron procesados en el espacio grupo P212121.
  2. Nsa1 solución de estructura.
    Nota: Hay diversos paquetes de software de Cristalografía que se pueden utilizar para resolver y refinar estructuras cristalinas como Phenix y CCP422,23. Siguiente es el protocolo para Nsa1 solución la estructura con la de suite de software de Phenix22.
    1. Analizar al nativo y SAD escalan de conjuntos de datos con phenix.xtriage22.
    2. Resolver la estructura del Nsa1 con Phenix.autosol usando el pico triste reflexión archivo22,24. Para ejecutar el programa de AutoSol, de entrada el número de sitios de selenometionina (sitios = 9), el archivo de secuencia de fasta de Nsa1ΔC y la longitud de onda utilizada para la recolección de datos triste (λ = 0.97911 Å).
      Nota: Del conjunto de datos SAD Nsa1, phenix.autosol debe ser capaz de determinar las fases experimentales y construir la mayoría del modelo.
    3. Hacer ajustes manuales al modelo con focha25, seguido por el refinamiento en el phenix.refine22,26.
    4. Resolver la estructura del alta resolución nativo cristal ortorrómbico y el cristal cúbico por reemplazo molecular usando Phaser27,28.
    5. Después de la solución de estructura exitosa, inspeccione el modelo y la densidad del electrón mapa en focha25.
    6. Construir y refinar las estructuras mediante la ejecución de rondas iterativas de refinamiento phenix.refine22,26 y modelo de focha25.

4. SAXS recopilación, procesamiento y modelado

  1. Recopilación de datos SAXS
    Nota: Datos SAXS se registraron para larga duración S. cerevisiae Nsa1 a la fuente de luz avanzada, en la línea de SIBILAS de alto rendimiento 12.3.1 en el laboratorio nacional Lawrence Berkeley, Berkeley, CA29.
    1. Purificar Nsa1FL siguiendo el protocolo descrito anteriormente. 24 h antes de su envío de Nsa1FL a la línea, funcionamiento proteína sobre una columna de gel filtración previamente equilibrada en tampón A.
    2. Piscina de fracciones que contienen Nsa1 y determinar la concentración de proteína como se describió anteriormente.
    3. Preparar 30 μl alícuotas de una serie de concentración de Nsa1 desde 1 a 6,2 mg/mL con buffer A.
    4. Transferir 20 μl de cada serie de la concentración de Nsa1 a una microplaca bien claro falda 96 junto con controles solo almacenador intermediario A.
      Nota: Datos SAXS se recogen en soluciones diluidas utilizando varias concentraciones de muestra purificada para evitar la agregación, repulsión entre partícula y efectos de daño de la radiación.
    5. Sello de la microplaca con silicona sellado de estera y barco durante la noche a 4 ° C a la línea.
    6. Almacenar la microplaca a 4 ° C hasta la recogida de datos.
    7. Inmediatamente antes de la recolección de datos, haga girar la placa a 3200 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar los posibles agregados y burbujas de aire.
    8. Registrar los datos SAXS.
      Nota: Para Nsa1, datos SAXS se registraron para el búfer de antes y después de cada serie de la concentración de proteína. Treinta y tres análisis consecutivos de 0,3 s fueron recogidos por Nsa1FL sobre una serie de concentración (1 a 6.2 mg/mL) a 10 ° C.
    9. Realizar restas de búfer para datos SAXS.
      Nota: Para Nsa1 resta tampón se realiza automáticamente en la línea pero resta buffer se puede realizar usando software de reducción de datos tales como dispersión30 y ATSAS suite31. Resta de búfer es una parte crítica de análisis de los datos SAXS y debe tenerse cuidado para asegurarse de que el búfer utilizado para sustracción es idéntico al tampón de las proteínas.
    10. Promedio los 33 consecutivas exploraciones para crear un archivo *ave.dat para cada concentración.
      Nota: El recubrimiento el 33 fotogramas consecutivos para comparar las curvas. Cambios a las curvas de dispersión en el tiempo es a menudo indicativo de daño de la radiación. Excluir estos marcos de promedio. Promedio de los escaneos consecutivos Nsa1 se realiza automáticamente en la línea de SIBILAS.
  2. Procesamiento de datos SAXS y comparación de Series de concentración
    Nota: Hay diversos paquetes de software que pueden utilizarse para analizar los datos SAXS. Nsa1 el radio de giro y las funciones de distribución de pares distancia se determinó utilizando PRIMUS32 y Gnom33 de ATSAS 2.7.2 suite31 y comparada a través de todas las concentraciones de proteína para asegurar que no había ninguna radiación daño o dependiente de la concentración inter-partícula interacciones10.
    1. Abrir una terminal shell y vaya al directorio que contiene los datos SAXS.
    2. Lanzar el PRIMUS32 GUI desde dentro la terminal.
    3. Dentro de la GUI de PRIMUS, las curvas de dispersión de la carga (* ave.dat).
    4. Utilice AutoRg determinar el radio de giro (Rg) y la intensidad de la dispersión I(0), para cada curva de la dispersión (* ave.dat).
    5. Generar Kratky parcelas para cada curva de la dispersión (* ave.dat), para evaluar el grado de compacidad.
    6. Utilice AutoGNOM33 para calcular la función de distribución de pares (también llamado P(r)) para cada curva de la dispersión (* ave.dat). Entrar en una partida ≈máximo D 3 * Rg y optimizar el valormáximo de D para obtener una curva suave de reinicio. Durante la optimización de la Dmax, asegúrese de que el reinicio calculado función es consistente con la curva de dispersión experimental comprobando el valor de2 χ divulgado y evaluar visualmente el ajuste a la curva de dispersión en general.
    7. Calcular el peso molecular de Nsa1 de las curvas de dispersión mediante el volumen de correlación34.
    8. Comparar los parámetros estructurales para cada concentración para asegurarse de que no hay daño de la radiación ni dependiente de la concentración de efectos.
      Nota: Efectos de concentración se pueden manifestar como un aumento de R deg y Dmáxima en relación con una creciente concentración de la proteína. Dispersión hacia adelante I(0) dividida por la concentración de la muestra debe también se mantienen constante en toda la serie de la concentración de proteína.
  3. Modelado de SAXS
    Nota: Para determinar la posición de la terminal C de Nsa1FL, Nsa1 cristal estructura10 (PDB 5SUM) y las curvas de dispersión de SAXS se utilizaron para llevar a cabo una combinación de cuerpos rígidos y ab initio modelado, usando los programas de grupo 35 y método de optimización de conjunto (MOE)36 desde el ATSAS software suite31. El dominio WD40 de Nsa1 fue tratado como un cuerpo rígido, mientras que el c-término de Nsa1 junto con varios bucles desordenados del dominio WD40 se modelaron para ajustar los datos experimentales de SAXS.
    1. Generar los archivos PDB entrados. El archivo PDB se debe dividir cada vez residuos están ausentes en la cadena principal, y el archivo PDB no puede contener múltiples conformaciones, ligandos, o las moléculas de agua.
    2. Ejecute el programa Pre_BUNCH35 para preparar el archivo de PDB entrada manojo (pre_bunch.pdb). Entrada de la secuencia de la proteína diana (*.seq), el número de dominios/PDBs generada en 4.3.1, y cada uno de los archivos PDB individuales generadas por encima.
    3. Calcular las amplitudes de la dispersión para cada archivo PDB mediante el programa de CRYSOL37. Para ejecutar la entrada CRYSOL el archivo PDB y la curva de dispersión de SAXS experimental (*.dat). Esto generará un archivo de amplitudes (* .alm).
    4. Ejecute el programa ramo35 para modelar el dominio WD40 de Nsa1 contra los datos SAXS mediante un abordaje combinado de rígido cuerpo y ab initio . De entrada el archivo PDB de Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), la curva de dispersión de SAXS experimental (*.dat) y la amplitud individual (* .alm) archivos de cada archivo PDB parcial generada por CRYSOL.
    5. Comparar el valor χ2 la partida PDB (5SUM) con eso del ab initio el modelo generado por grupo utilizando los datos experimentales de SAXS.
      Nota: Un modelo exitoso de grupo debe tener un valor de2 χ significativamente menor que el modelo inicial. La dispersión teórica del modelo de grupo debe también describir bien los datos experimentales según lo juzgado por inspección visual de la superposición entre la dispersión teórica del modelo a los datos SAXS BUNCH y su χ2 (figura 4, Gasoducto de centro).
    6. Inspeccione manualmente los archivos de salida de manojo en Pymol38 superponer la estructura del cristal con el modelo generado por montón y el sobre SAXS (figura 4, tubería del centro).
    7. Ejecutar Panda 10 - 20 veces para generar modelos independientes para confirmar que los modelos son similares.
      Nota: Para Nsa1 había un rango de χ2 valores de ~ 1 a 3 de 20 carreras independientes.
    8. Conjunto modelado
      Nota: como un enfoque opcional a manojo de ejecutar Moe36 o mínima búsqueda de conjunto39 (MES). Moe y MES utilizar enfoques de conjunto, que son muy adecuados para proteínas con dominios o regiones flexibles que se encuentran en múltiples conformaciones.
      1. Ejecute el programa Moe36 utilizando el servidor online ATSAS. Para ejecutar el Moe, de entrada los archivos PDB de 4.3.1, la secuencia de la proteína diana (*.seq) y los datos experimentales de SAXS (*.dat).
      2. Compare los valores χ2 de la partida PDB (5SUM) con eso del conjunto generado por Moe utilizando los datos experimentales de SAXS.
        Nota: Un éxito conjunto de Moe debe tener un valor de2 χ significativamente menor que el modelo inicial. La dispersión teórica del conjunto debe también describir bien los datos experimentales según lo juzgado por inspección visual de la superposición entre la dispersión teórica del conjunto de los datos SAXS y su χ2 (figura 4, derecho tubería). También se deben comparar los valores χ2 de Manojo y Moe para determinar el modelo que mejor describe los datos experimentales de SAXS.
      3. Inspeccionar manualmente el Conformadores de la MOE en Pymol38 para superponer la estructura cristalina con los Conformadores de Moe (figura 4). Nota: el número total de conformadores y la fracción de ocupación para cada conformer que contribuye a la curva de dispersión. Para moléculas más rígidas, como Nsa1, el número de conformadores debe ser pequeño (1-5) (figura 4, tubería derecha)36.
      4. Vuelva a ejecutar Moe varias veces para asegurar resultados consistentes.
        Nota: Para Nsa1 el número de conformadores era típicamente 3 a 4 con valores χ2 oscilan entre 0.1 y 0.3.

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Resultados

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Nsa1 fue PCR amplificados de la DNA genomic de S. cerevisiae y subcloned en un vector que contiene una etiqueta de afinidad 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP y un sitio de proteasa TEV. Nsa1 se transformó en células de e. coli BL21(DE3) y altos rendimientos de expresión de la proteína se obtuvieron después de la inducción con IPTG y crecimiento a 25 ° C durante la noche (figura 1A). Nsa1 fue purificados por afinidad en la resina de la ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mediante este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae se generó para estudios estructurales por cristalografía de rayos x y SAXS. Nsa1 fue bien-se comportó en solución y cristalizado en múltiples formas de cristal. Durante la optimización de estos cristales, se descubrió que el C-terminal de Nsa1 era sensible a la degradación de la proteasa. La alta resolución, forma cristalina ortorrómbica sólo podría ser duplicada con variantes de truncamiento del c-terminal de Nsa1, probablemente porque el C-terminal fl...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se recogieron datos de difracción en el equipo de acceso colaborativo Regional Sureste (SER-CAT) 22-ID y BM 22 líneas en la avanzada del fotón fuente (APS), laboratorio nacional de Argonne. Los datos SAXS se colectó en la línea de SIBILAS en avance luz fuente (ALS), laboratorio nacional Lawrence Berkeley. Nos gustaría agradecer al personal en la línea de SIBILAS por su ayuda con la recolección remota de datos y procesamiento. Agradecemos a la investigación de espectrometría de masa nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) y grupo de apoyo ayuda para determinar los límites del dominio de la proteína. Este trabajo fue apoyado por el nosotros nacional Instituto de salud intramuros programa de investigación; Los E.E.U.U. Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 a R. E. S.) y los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR, 146626 a la M.C.P). Uso de la APS fue apoyado por el Departamento de energía, oficina de ciencia, oficina de ciencias básicas de energía bajo contrato no. W-31-109-Eng-38. Uso de la fuente de luz avanzado (ALS) fue apoyado por el Director, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, del Departamento de energía estadounidense bajo contrato no. DE-AC02-05CH11231. Soporte adicional para la línea de SAXS SIBILAS viene del Instituto Nacional de salud del proyecto MINOS (R01GM105404) y una gama alta instrumentación Grant S10OD018483. Nos gustaría también agradecer a Andrea Moon y el Dr. Sara Andres por su lectura crítica de este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 vector paraleloSheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)Utilizamos una versión modificada de pMBP2 que incluía un N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomicDNA ATCC204508D-5
Primers para la clonación de Nsa1
SC_Nsa1_FLFwIDTCGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRvIDTAATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFwIDTGGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRvIDTGATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
fuerte>Producción y purificación de proteínas recombinantes Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Células estelaresInvitrogenC601003
pMBP- NSA1 y varios truncamientosLo et al., 2017
Dimensiones molecularesla selenometioninaMD12-503B
IPTG, sin dioxanoPromegaV3953
Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTASigma-Aldrich4693159001 cloruro
de sodioCaledon Laboratory Chemicals7560-1-80
Cloruro de magnesio hexahidratadoSigma-AldrichM2670
Tampón Tris, 1 M pH7.5KD MedicalRGF-3340
GlicerolInvitrogen15514-029
beta-mercaptoetanolSigmaM6250
1M Imidazol, pH 8.0TeknovaI6980-06
Talon Resina de afinidadClonetech635503
Amicon Ultra 15 mL Filtro centrífugo (MWCO 10K)MilliporeUFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Gel de grado de preparación Columna de filtraciónGE-Healthcare28989335
TEV Proteasapreparada por NIEHS Expresión de proteínasPlásmido de expresión central proporcionado por NCI (Tropea et al. Métodos Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Pantalla de cristalHampton ResearchHR2-110
Pantalla de cristal 2Hampton ResearchHR2-112
Salt RxHampton ResearchHR2-136
Pantalla de índiceHampton ResearchHR2-144
Pantalla PEG/Ion HamptonResearchHR2-139
JCSG+Dimensiones molecularesMD1-37
Wizard Precipitant SynergyDimensiones molecularesMD15-PS-T
Swissci de 96 pocillos y 3 gotas Placas de caída UVPTTP Labtech4150-05823
Cinta de sellado transparente cristalina de 3 pulgadas de anchoHampton ResearchHR4-506
Proti-AceKit Hampton ResearchHR2-429
PEG 1500DimensionesmolecularesMD2-100-6
PEG 400Dimensiones molecularesMD2-100-3
HEPES/hidróxido de sodio pH 7.5Dimensiones molecularesMD2-011-Citrato de
sodio tribásicoDimensiones molecularesMD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Portaobjetos siliconadosHampton ResearchHR3-231
Placas de 24 pocillos con sellador (Placa VDX con Sellador)Hampton ResearchHR3-172
Bucles de nylon montados de 18 mM (0,05 mm a 0,5 mM)Hampton ResearchHR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Kit de cuentas de semillasHampton ResearchHR2-320
Tapas de cristal magnéticoHampton ResearchHR4-779
Varita criogénica magnéticaHampton ResearchHR4-729
Espuma criogénica DewarHampton ResearchHR4-673
Sistema de disco de cristalMiTeGenM-CP-111-021
Faldón completo de 96 pocillos Placa transparenteVWR10011-228
AxyMat Tapete de selladoVWR10011-130
Equipment
UVEX-mJAN Scientific, Inc.
Espectrofotómetro Nanodrop LiteThermo-Fisher
Mosquito RobotTTP Labtech
Software/Sitios web
HKL2000Otwinoski y Minor, 1997
PhenixAdams et al., 2010
CootEmsley et al., 2010
ATSASPetoukhov et al., 2012https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
ScatterRambo y Tainer, 2013
PymolThe PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrö dinger, LLC.
BUNCHPetoukhov y Svergun, 2005
CRYSOLSvergun et al, 1995
PRIMUSKonarev et al, 2003
EOMTria et al, 2015
< de

Referencias

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