Artículo de método

Medición automatizada de la cápsula de polisacárido de Cryptococcus especies y cuerpo de la célula

7.4K vistas

⸱

DOI:

10.3791/56957

⸱

11 de enero de 2018

 , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

En este artículo

Resumen

Esta técnica describe un procesador de imágenes por lotes automatizado diseñado para medir radios de cuerpo y cápsula de polisacárido. Si bien inicialmente diseñado para las mediciones cápsulas Cryptococcus neoformans , que el procesador de imagen automatizado puede aplicarse también a otros detección de contraste basado de objetos circulares.

Resumen

El propósito de esta técnica es proporcionar un proceso manejable, preciso y consistente de un gran número de mediciones de cápsula de polisacárido.

En primer lugar, se genera una imagen de umbral basado en valores de intensidad única calculados para cada imagen. Entonces, círculos son detectados basados en el contraste entre el objeto y el fondo usando el algoritmo de transformación de Hough de círculo (CHT) bien establecido. Finalmente, las cápsulas detectado células y órganos se corresponden según el centro de coordenadas y el tamaño de radio, y los datos se exportan al usuario en una hoja de cálculo manejable.

Las ventajas de esta técnica son simples pero significativos. Primero, porque estos cálculos son realizados por un algoritmo en lugar de un humano se aumentan la precisión y fiabilidad. No hay ninguna disminución de la exactitud o confiabilidad independientemente de cuántas muestras se analizan. En segundo lugar, este enfoque establece un potencial procedimiento de funcionamiento estándar para el campo de Cryptococcus en lugar de la situación actual donde medida cápsula varía según el laboratorio. En tercer lugar, dado que las mediciones cápsulas manual lento y monótono, automatización permite realizar mediciones rápidas en gran número de células de levadura que a su vez facilita el análisis de datos de alto rendimiento y estadísticas cada vez más potentes.

Las principales limitaciones de esta técnica provienen de cómo las funciones del algoritmo. En primer lugar, el algoritmo generará sólo círculos. Mientras que las células de Cryptococcus y sus cápsulas en una morfología circular, sería difícil aplicar esta técnica para detección de objetos no circular. En segundo lugar, debido a cómo se detectan los círculos el algoritmo CHT puede detectar enormes círculos pseudo basados en los bordes exteriores de varios círculos agrupados. Sin embargo, cualquier tergiversados cuerpos celulares dentro del círculo pseudo fácilmente detectados y eliminados de los conjuntos de datos resultantes.

Esta técnica se significa para medir las cápsulas circular polisacárido de Cryptococcus especie basado en microscopía de campo brillante de tinta de la India; Aunque se podría aplicar a otros contraste realiza las mediciones del objeto circular.

Introducción

Cryptococcus neoformans es una levadura patógena encontrada ubicuo alrededor del mundo que se asocia a enfermedad humana, sobre todo en las poblaciones de inmunodeprimidos. C. neoformans en particular representa una causa significativa del total de muertes anual en el África subsahariana debido a enfermedades infecciosas1. La principal manifestación clínica de la infección cryptococcal es meningoencefalitis, que sigue la invasión del sistema nervioso central por transporte en macrófagos infectados (forma de caballo de Troya) o cruce directo de la barrera blood - brain. C. neoformans expresa varios factores de virulencia, incluyendo la capacidad de replicar en la temperatura del cuerpo humano, actividad de la ureasa, melanization y formación de una cápsula de polisacárido2. La cápsula de polisacárido se compone de glucuronoxylomannan y polímeros glucoronoxylomannangalactan y funciones de repetición como una barrera protectora contra factores de estrés ambiental como anfitrión inmunorespuestas2.

Aunque el tamaño del tamaño de la cápsula de polisacárido de Cryptococcus no siempre se ha asociado con virulencia, hay evidencia de que es un factor en la patogenesia2,3,4,5, 6,7. Tamaño de la cápsula se asocia a meningitis patología6puede afectar la capacidad del macrófago para control de infección por Cryptococcus 5y puede resultar en la pérdida de virulencia si ausente8. Por lo tanto, las mediciones de tamaño de la cápsula son comunes en la investigación de Cryptococcus, pero no hay fieldwide estándar para un método de medición de cápsulas.

Actualmente, C. neoformans polisacárido cápsula medición se basa en mediciones manuales de imágenes de microscopia y los métodos exactos de imagen y medición adquisiciones varían de laboratorios9,10, 11. Una preocupación inmediata para este método es que algunos estudios requieren la adquisición de miles de mediciones individuales, lo que dificulta mantener precisión y fiabilidad. Además, incluso cuando los resultados se publican, a menudo hay insuficiente Descripción de los métodos de medición. Muchas publicaciones no explican cómo obtuvieron sus mediciones, qué plano focal fue utilizado, cómo determina el umbral para la identificación de la cápsula, si usaron radio o diámetro, si se utiliza una medición o un promedio de varios, o de otro detalles. Algunas publicaciones sólo estado su método como programa que se utilizó, por ejemplo, "Adobe Photoshop CS3 se utilizó para medir las células"11. Esta falta de estandarización y presentación de informes detalle puede hacer reproducibilidad difícil si no imposible. Diferencias en la vista humana, brillo de la computadora, configuración del microscopio, deslice la iluminación y otros factores pueden variar no sólo entre individuos sino entre las muestras, mientras que cálculos basados en relaciones de los valores de intensidad del píxel permanece constantes y aplicable entre muestras. Esta técnica fue generada en el contexto de proporcionar una técnica estandarizada, precisa, rápida y simple para medir tamaños de cápsulas para un campo en el que hubo antes.

Como se mencionó anteriormente, el algoritmo de la CHT es larga, y se han escrito scripts para que detecte automáticamente círculos antes. Este método mejora en dos áreas donde otros scripts le quedan cortos. En primer lugar, detectar simplemente círculos no es suficiente, porque con las células de Cryptococcus deben detectarse dos círculos distintos en relación con cada uno otro. Este método específicamente detecta cuerpos celulares dentro de cápsulas, discrimina entre los dos y realiza cálculos sólo en los correspondientes pares de cápsula de cuerpo. En segundo lugar, incluso cuando siguiendo el mismo protocolo, diferentes investigadores acabará con diferentes adquirió imágenes. Permitiendo el control del investigador sobre cada parámetro del algoritmo, esta herramienta se puede ajustar para que coincida con una amplia gama de métodos de adquisición. No hay necesidad para un alcance estándar, objetivo, filtro y así sucesivamente.

Esta técnica se puede aplicar fácilmente a cualquier situación en la que el investigador necesita detectar círculos dentro de una imagen que contrasta con su fondo. Ambos círculos más claros y más oscuros que su fondo puede ser detectada, contados y medidos con esta técnica.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. preparación de portaobjetos de tinta de la India

  1. Pipetear 10 μl de muestra cryptococcal en un portaobjetos. Cualquier cepa de levadura circular funcionará pero para este experimento H99 era la única tensión que utiliza.
    Nota: Si la muestra es directamente en medios de cultivo, diluir 1:2 con PBS o agua puede ayudar a evitar que la tinta de la India de agrupar.
  2. Pipetear 2 μl de mancha de tinta de la India sobre la muestra y mezclar físicamente empujando la punta de la pipeta a la muestra y moviéndose en un movimiento circular hasta que la tinta de la India aparece distribuido uniformemente.
  3. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra, mantenga el borde izquierdo del cubreobjetos sobre la superficie de la diapositiva, entonces suavemente y uniformemente bajando el lado opuesto del cubreobjetos sobre la muestra.
  4. Seque el portaobjetos al aire durante 5 minutos.
  5. Aplique suavemente una ligera capa de esmalte de uñas a frontera de cubreobjetos para formar un sello y preservar la mancha de tinta de la India.

2. proyección de imagen de diapositiva

  1. Coloque los portaobjetos en un microscopio de campo brillante con un accesorio de cámara y conversión de píxeles a micrón conocido. Ajustar contraste, filtros y objetivos lo que cell cápsulas son claros y cuerpos celulares son bandas concentrados, oscuros.
    Nota: Varios filtros objetivos y ajustes de contraste funcionará pero se recomienda una de 20 x objetivo, filtro Ph1, 2 x 2 binning.
  2. Asegúrese de que el campo de visión es denso pero no superpoblado con las células de Cryptococcus, con contraste claro entre la cápsula de la célula y el fondo y bien centrada con el cuerpo de la célula visualizado como una banda oscura.
    Nota: El número exacto de las células para una imagen óptima variará dependiendo de la muestra y el objetivo se utiliza. Los aspectos importantes para las células no son agrupados o superpuestos, que los planos focales de células no varían significativamente, y que hay tinta India significativa manchan visible en el fondo (al menos el 25% del campo).
  3. Guardar imágenes en un solo directorio con títulos claros, como el algoritmo de medición se ejecutará en imágenes en un solo directorio y los datos de salida se organizarán según los nombres de los archivos de imagen.

3. algoritmo configuración

  1. Instala Python versión 2.7 de
  2. Instalar librerías adicionales python ejecutando los comandos "pip install pillow" y "pip install openpyxl".
  3. Instalar MATLAB, siguiendo las instrucciones en
  4. Construir la biblioteca de python MATLAB, siguiendo las instrucciones en https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Descargar los tres archivos necesarios incluidos en materiales suplementarios de este manuscrito ("QCA.py", "Analysis2.m" y "TestRun.m").
    Nota: Estos archivos se pueden extraer a cualquier lugar, pero los tres deben estar en el mismo directorio.

4. el uso del algoritmo de

  1. Ejecute la aplicación haciendo doble clic en QCA.py.
    Nota: La aplicación puede tardar varios minutos para empezar. El archivo "QCA.py" contiene la estructura de programa que se llama los archivos ". m" para ejecutar el algoritmo real.
  2. Siga los pasos descritos en el programa.
    1. Entrada del tipo de extensión de los archivos de imagen precedida por un período y separados por punto y coma (ex. ". TIF;. JPEG") luego haga clic en el botón Enter .
    2. Elegir el directorio en el que se encuentran los archivos de imagen haciendo clic en el botón Seleccionar directorio y selecciona la carpeta que contiene las imágenes.
    3. Generar la lista de archivos de imagen en el directorio haciendo clic en el botón Generar lista de imágenes . Las imágenes se mostrará en el cuadro de texto a la derecha. Revisar y asegurar que la lista sea precisa y completa.
    4. Seleccione una imagen al azar de la lista para usar como una vista previa haciendo clic en el botón Seleccionar imagen al azar .
      Nota: Si la imagen es incapaz de abrir debido a un "error de modo de imagen incorrecta", el algoritmo todavía funcionará correctamente a pesar de no mostrar la imagen. Después paso 4.2.7, todavía se mostrará la imagen de prueba.
    5. Objetivo de microscopio y binning configuración de entrada. Si la configuración por defecto no coinciden con el microscopio, seleccione "Custom conversión de píxeles" y pixel-a-um la conversión para los archivos de imagen de entrada. Una vez seleccionado, haga clic en el botón de Conversión calcular y garantizar que la conversión es correcta según el cuadro de texto a la derecha.
      Nota: Imágenes representativas, que se muestra en la figura 1 se calculan con 40 aumentos y 2 x 2 binning seleccionado.
    6. Entrada de parámetros de algoritmo para la detección del círculo.
      1. De entrada el radio mínimo y máximo detectable para la detección de cápsula externa como las entradas de Min y Max cápsula de radio. Una gama más pequeña le permitirá obtener resultados más precisos.
      2. El radio mínimo y máximo detectable para la detección del cuerpo de la célula como las entradas de Min y Max cuerpo celular radio de entrada.
        Nota: Los cuatro de estas entradas deben ser números representando a sus respectivos valores en píxeles, de acuerdo a las imágenes de fuente.
      3. Mueve los deslizadores de la cápsula y la sensibilidad del cuerpo de la célula para ajustar el umbral de sensibilidad del algoritmo. Una sensibilidad baja será estricta y detección del círculo positivo falso, pero también puede detectar menos círculos reales. Por el contrario, una alta sensibilidad aumentará la tasa de detección, pero también puede resultar en falsos positivos círculos.
        Nota: Se obtuvieron resultados representativos con un radio mínimo de la cápsula de 7 radio cápsula máximo de 45, radio cuerpo mínimo de 4, radio cuerpo máximo de 30, cápsula sensibilidad de 87 y la sensibilidad del cuerpo de 87.
    7. Comprobar los parámetros de la imagen seleccionada al azar haciendo clic en el botón de Prueba funcionamiento . Los resultados se mostrarán en el centro superior del programa de sustitución de la imagen original. Si los resultados mira precisos, se recomienda para elegir una imagen aleatoria adicional para así intentar asegurar que los parámetros seleccionados caben todas las imágenes seleccionadas.
      1. Maximizar el número de cuerpos y cápsulas detectan y visualmente si los círculos parecen encajar correctamente. El número de organismos dentro de cápsulas detectados se mostrarán en el cuadro de texto a la derecha. Manipular los parámetros del algoritmo hasta que los resultados son exactos.
        Nota: Los círculos de colores gruesos son sólo para visualización. Los círculos reales generados para la medición es una curva matemática calculada por el algoritmo HCT.
    8. Ejecutar el algoritmo de detección en todo el directorio de archivos de imagen haciendo clic en el botón Iniciar análisis . Se analizará cada imagen y el programa mostrará "terminar" en el cuadro de texto a la derecha cuando se han analizado todas las imágenes.
    9. Haga clic en el botón Match y limpieza . Esto coincidirá con detectado cuerpos de la célula a las cápsulas detectados residen en y calcular el radio cápsula verdadera restando el cuerpo de la cápsula.
      Nota: Si el algoritmo se utiliza para detectar la fluorescencia u otra situación en la que es solamente un círculo detecta este paso es innecesario. En su lugar haga clic en Sólo tirar cuerpos o las Cápsulas sólo tire para recoger los datos de sólo el azul o sólo los círculos verdes, respectivamente. Es importante tener en cuenta que si sólo se recuperan los datos cápsulas el radio se refiere al radio total de la célula como el radio del cuerpo de la célula no podría restar.
    10. Localizar los datos completados en el archivo "CleanedOuput.csv" en el directorio de imágenes. Si sólo se selecciona un dato, el archivo será marcado "CleanedBodies.csv" o "CleanedCapsules.csv".

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Primero se obtienen las imágenes por microscopia de diapositivas, tinta de la India utilizando un microscopio de campo brillante, juntado con una cámara (figura 1A). Es importante que las células separadas y en la densidad suficientemente baja no para abrumar el campo de visión, así como utilizar suficiente mancha para crear contraste entre las células y el fondo. Como se indica en el protocolo, el número exacto de las células para una imagen...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Los pasos críticos de esta técnica son preparar el carro de tinta de la India y adquiriendo las imágenes de microscopio. Mientras que el algoritmo ha sido probado con éxito con una variedad de técnicas de imagen y diapositiva en este manuscrito se describe el protocolo recomendado. La cápsula polisacárida es detectada basado en la exclusión de partículas de tinta de la India del dominio de la cápsula de estas partículas son demasiado grandes para penetrar la red fibrilar de polisacárido. Exclusión de la tinta de la India...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer Anthony Bowen cuyas diapositivas fueron utilizados como una segunda comparación de lado a lado humana como Sabrina Nolan cuyas diapositivas fueron utilizados como un tercer humano side-by-side y segunda comparación del microscopio.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tinta chinaBecton, Dickinson y Cía.
Fisherbrand Superfrost Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-550-14325x75x1
Fisherfinest Cubierta de vidrio premiumFisher Scientific12-548-B22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Esmalte de uñasSally HansenN/A109
invisible SAB MediaSigmaS3306
Cryptotoccus neoformansATCC208821H99 cepa
Olympus AX70 MicroscopioOlympus AX70TRFDescatalogado ; Microscopio de campo claro
Qimaging Retiga 1300QimagingN/ADescatalogado ; Accesorio de microscopio para cámara
MATLABMathWorksN/A Serecomienda la versión más reciente
Lenguaje de programaciónPythonN/AVersión 2 necesaria ; 2.7 Recomendado
Microsoft ExcelMicrosoftN/A Serecomienda la versión más reciente
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)SigmaP3813
261194

Referencias

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561(2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Medici n de la c psula de CryptococcusAn lisis automatizado de la c psulaTransformaci n de Hough circularTinci n con tinta chinaDetecci n del cuerpo celularAn lisis de la c psula de polisac ridosMicroscop a de campo claroUmbralizaci n de im genesEmparejamiento del cuerpo de la c psulaMedici n de alto rendimiento

Artículos relacionados