Artículo de método

Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

DOI:

10.3791/56973

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8 de mayo de 2018

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1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos la metodología para el análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario de ratón. Combinación de índice de clasificación de las células de la región aorta-gónada-mesonefros embrionaria con cocultivo de células endoteliales y trasplante para caracterizar las propiedades fenotípicas y el potencial de engraftment de precursores hematopoyéticos individuales.

Resumen

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La capacidad de estudiar la génesis de células madre hematopoyéticas (HSC) durante el desarrollo embrionario ha sido limitada por la rareza de los precursores HSC en el embrión y la falta de ensayos que identifican funcionalmente el potencial a largo plazo del engraftment del multilineage de los supuestos precursores HSC. Aquí, describimos la metodología que permite el aislamiento y caracterización de precursores HSC funcionalmente validados a nivel unicelular. En primer lugar, utilizamos índice de clasificación para catalogar el parámetro fenotípico precisa de cada célula individualmente seleccionada, utilizando una combinación de marcadores fenotípicos para enriquecer de precursores HSC con marcadores adicionales para análisis experimental. En segundo lugar, cada célula ordenadas de índice es co cultivada con estroma nicho vascular de la región de aorta-gónada-mesonefros (AGM), que apoya la maduración de los precursores de HSC no engrafting funcional HSC con el engraftment del multilineage, a largo plazo potencial en ensayos de trasplante. Esta metodología permite la correlación de propiedades fenotípicas de precursores hemogenic clonal con su potencial de funcional engraftment u otras propiedades como perfil transcripcional, proporcionar un medio para el análisis detallado del precursor HSC desarrollo a nivel unicelular.

Introducción

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Estudios clonales han revelado heterogeneidad en las propiedades a largo plazo del engraftment de adultos HSCs, proporcionar la nueva penetración en subtipos de HSC y cambios en el comportamiento HSC durante envejecimiento1. Sin embargo, estudios similares de HSCs embrionarias y sus precursores han sido más difícil. Durante el desarrollo embrionario temprano, HSCs surgen de una población de precursores conocido como endotelio hemogenic en un proceso transitorio que se refiere como endoteliales hematopoyético transición2. El primer HSC, definido por su capacidad para proporcionar engraftment del multilineage robusto, a largo plazo después del trasplante en recipientes adultos condicionados, no se detectan hasta después del día embrionario 10.5 (E10.5) en el embrión murino, en muy baja frecuencia3 . Durante su desarrollo, precursores de HSC (pre-HSC) derivados de endotelio hemogenic deben sufrir maduración antes de adquirir las propiedades de HSC adultos que permiten la eficiente injerto en trasplante ensayos4,5 , 6. oscurecimiento el estudio del origen HSC rara, una multitud de progenitores hematopoyéticos con eritroides, potencial mieloide y linfoide ya se detectan antes de la aparición de HSC de pre-HSC7,8. Así, la distinción pre-HSC de otros progenitores hematopoyéticos exige métodos clonally aislar células y les proporcione las señales suficientes para su maduración a HSC, para detectar sus propiedades engraftment en los ensayos de trasplante.

Ha descrito una serie de enfoques que permiten la detección de pre-HSC por maduración en vivo o ex vivo a HSC. Métodos ex vivo han dependido de la cultura de los tejidos embrionarios, como la región AGM, donde el primer HSC se detectan en el desarrollo9. Basándose en estos métodos, protocolos que incorporan la disociación, clasificación y la agregación de tejidos AGM han permitido la caracterización de poblaciones ordenadas que contienen precursores HSC durante el desarrollo de E9.5 en E11.5 en los para-aórticos Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regiones4,5,10; sin embargo, estos planteamientos no son susceptibles de análisis de alto rendimiento de precursores a nivel unicelular para análisis clonal. Del mismo modo, en vivo la maduración de transplante en ratones recién nacidos, donde el microambiente se presume que es más conveniente para el apoyo de las anteriores etapas de precursores HSC, ha permitido estudios de poblaciones ordenadas desde el saco vitelino y AGM / P-Sp (P-Sp es la región del precursor a la AGM) con características de pre-HSC, pero estos métodos también proporcionan una sólida plataforma para el solo, no de la célula análisis11,12.

Estudios de Rafii et al demostraron que estroma Akt activa la célula endotelial (CE) puede proporcionar un substrato de nicho para el apoyo de adultos HSC auto-renovación en vitro13,14,15. Recientemente se determinó que Akt activa CE derivada de la región AGM (AGM-CE) proporciona un nicho adecuado en vitro para la maduración de precursores hemogenic, aislado desde E9 en desarrollo, a HSC engrafting adulto, así como la posterior auto renovación de HSC generado16. Dado que este sistema emplea una simple cultura de CO 2-dimensional, es fácilmente adaptable para análisis clonal del potencial HSC de precursores hemogenic individualmente aislados.

Recientemente hemos reportado un acercamiento al análisis del potencial HSC de precursores hemogenic clonal combinando índice clasificación de individuales hemogenic precursores de embriones murinos con cocultivo AGM-CE y posterior análisis funcional en el trasplante ensayos de17. Índice de clasificación es un modo de activar la fluorescencia de la célula clasificación (FACS) que registra (índices) todos parámetros fenotípicos (es decir, parámetros de fluorescencia de forward scatter (FSC-A), lado scatter (SSC-A),) de cada célula individual ordenado tal que estos características pueden correlacionarse retrospectivo para posterior análisis funcional tras la clasificación. Software de FACS registra tanto información fenotípica cada celda y la posición/de la placa de 96 pozos en que se colocó. Esta técnica se ha utilizado anteriormente con elegancia para identificar heterogeneidad en HSC adultos, determinar parámetros fenotípicos que más enriquecen para el subconjunto engrafting a largo plazo de HSC y correlacionan los parámetros fenotípicos de HSC con transcripcional propiedades a la sola célula nivel18,19. Aquí, ofrecemos una metodología detallada de este enfoque que permite la identificación de parámetros fenotípicos únicos y las contribuciones de linaje de pre-HSC durante etapas tempranas del desarrollo embrionario.

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Protocolo

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) del Fred Hutchinson Cancer Research Center.

1. preparación de monocapas de AGM-EC para el cocultivo

  1. 24 h antes de la disección de la AGM y tipo, hacer medios de cultivo EC AGM y filtro de esterilización.
  2. Agregar 0.1% de gelatina en agua (100 μL/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 15 min aspirar la gelatina y dejar la placa en una campana de cultivo de tejidos con la tapa quitada hasta que los pozos están secos.
  3. Disociar las monocapas de AGM-CE y placa para placas de 96 pocillos.
    Nota: Mantenga el AGM-EC, preparado como se describió anteriormente16, en medios de cultivo de AGM-CE. Para consistencia, líneas celulares de AGM-CE deben congeladas tan pronto como un número suficiente se obtiene (generalmente 1-3 de paso) y usadas en un número de paso definido (generalmente paso 5-12) para los experimentos de la cultura. Líneas celulares de AGM-CE derivan de C57BL/6J (CD45.2) AGM. Vea la Tabla de materiales para todas las composiciones de los medios de comunicación.
    1. Aspire los medios de comunicación de la cultura de AGM-CE en un matraz de2 75 cm y añadir 5 mL de PBS. Aspire PBS y añadir 3 mL de solución de tripsina (véase Tabla de materiales).
    2. Incubar a 37 ° C durante 2-4 minutos hasta que la mayoría de las células está levantando la placa. Agregar 7 mL de medios de cultivo EC AGM y pipeta de 8 - 10 veces con una pipeta de 10 mL para preparar la suspensión de células individuales y transferir a un tubo de 15 mL.
    3. Centrifugado a 300 x g durante 5 minutos, quite el sobrenadante, resuspender en medios de cultivo de 10 mL AGM-CE y estimar el número de células con un hemocitómetro. Diluir las células a una concentración de 1 x 105 células/mL en medios de cultivo de AGM-CE.
  4. Añadir 100 μl AGM-CE suspensión de la célula (1 x 104 células) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos gelatinizada. Lugar a 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultivo de tejidos durante la noche para permitir que el AGM-EC conectar y formar una monocapa confluente.
    Nota: Distribuir uniformemente el AGM-CE las células del estroma hay proliferación limitada o célula de aglutinación para el cocultivo óptima.
  5. Preparar la monocapa de AGM-EC para el cocultivo AGM.
    1. A la mañana siguiente, preparar los medios de comunicación AGM libre de suero.
    2. Usando una pipeta multicanal de 12 pozos, retire los medios de cultivo EC AGM AGM-CE y agregar 200 μL/pocillo de AGM libre de suero los medios de comunicación sin citoquinas para lavar cualquier material residual que contiene el suero.
    3. Retirar los medios de comunicación y añadir 200 μL/pocillo de medios libres de suero AGM con citoquinas. Trabajar con rapidez al retirar y añadir los medios de comunicación para que no se comprometa la capa endotelial; por ejemplo, quite y vuelva a agregar una fila de medios a la vez. Coloque las placas de 96 pozos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C hasta que están listas para la clasificación de las células embrionarias.

2. preparación de la suspensión de la célula de tejidos embrionarios murinos

  1. Diseccionar el AGM de apareamientos cronometrado.
    1. Establecer cruzamientos programado para la generación de tejidos embrionarios de la edad deseada.
    2. Cosecha los embriones de las hembras embarazadas en 9.5 a 11.5 días post coitum (dpc), dependiendo de la etapa de pre-HSC a analizar.
      Nota: Los tejidos embrionarios se cosechan de ratones C57BL/6J (CD45.2) como descrito anteriormente y justamente escenificada somite basado en cuenta16. Nos hemos centrado en el análisis de las poblaciones de la región embrionaria de la AGM y su precursor, el P-Sp, entre E9.5 en E11.5, basado en la puesta en escena somite.
    3. Diseccionar el AGM de los embriones de20.
      Nota: Protocolos detallados para la disección de la AGM de embriones murinos han sido publicados por otros20. Por otra parte, saco vitelino u otros tejidos pretendidas tener pre-HSC actividad podrían también analizarse por este método.
  2. Disociar los tejidos embrionarios disecados.
    1. Recoger los tejidos disecados en un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de PBS con 10% FBS en el hielo. Asentarse los tejidos, aspirar el PBS/FBS y luego inmediatamente añada 1 mL de colagenasa 0,25% y el lugar en un baño de agua de 37 ° C durante 25 minutos.
    2. Añadir 1 mL de SBF PBS/10% y pipeta unos 20 - 30 veces con una pipeta de 1 mL para obtener una suspensión unicelular. Agregar un adicional 8 mL de SBF PBS/10% y centrifugar las células a 300 x g por 5 min descarte el sobrenadante.

3. anticuerpo tinción de las células embrionarias murinas

  1. Preparar la solución amortiguadora de bloqueo para la tinción de anticuerpo.
    1. Añadir 10 μg/mL contra ratón CD16/CD32 (Fc bloque del receptor (FcR)) y DAPI (stock de 1 mg/mL de H2O) de 1 μg/mL a 1 mL de PBS con 10% FBS.
    2. Elaborar en una jeringa de 3 mL y pasar por un filtro de jeringa 0,22 μm esterilizar. Resuspenda el precipitado de células de los tejidos embrionarios murinos disociados (del paso 2.2.2) en 500 μl de bloqueo tampón e incubar en hielo durante 5 minutos.
  2. Preparar la mezcla de anticuerpos17.
    1. Añadir bloque de FcR de 10 μg/mL a 1 mL de PBS con 10% FBS y 10 μl de cada anticuerpo de anti-VE-cadherina conjugado con fluorocromo (CD144, ver la Tabla de materiales) y anticuerpos anti-EPCR conjugado con fluorocromo (CD201, ver la Tabla de materiales). Utilizar una dilución final de 1: 100 de anticuerpos a menos que se indique lo contrario en base a las recomendaciones del fabricante o de acuerdo con valoraciones.
      Nota: Esta combinación de anticuerpo se utiliza para la definición de puertas para la clasificación, como se describe a continuación (paso 4.2). Clasificación basada en la expresión conjunta de VE-cadherina y EPCR permite enriquecimiento importante para la parte de las células derivadas de AGM con actividad del precursor HSC, como se describió anteriormente17.
    2. Añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo adicionales para su posterior análisis fenotípico de precursores individuales ordenados por índice.
      Nota: Estos anticuerpos no necesariamente sirven para la definición de puertas para la clasificación. En este protocolo de muestra, incluimos conjugado con PE anti-CD41 y el anticuerpo anti-CD45 conjugado con FITC para analizar la expresión relativa de estos marcadores hematopoyéticos, que evolucionan durante la aparición de pre-HSC de endotelio hemogenic4 ,5,16,17. Otros marcadores de interés pueden ser incluidos como deseado. Muestras teñidas con controles de anticuerpos de isotipo conjugado con fluorocromo se utilizan para definir puertas negativas y positivas para el análisis.
    3. Elaborar la mezcla de anticuerpos en una jeringa de 3 mL y pasar por un filtro de jeringa 0,22 μm esterilizar. Añadir 500 μl de la mezcla de anticuerpos a la suspensión de células en solución amortiguadora de bloqueo, pipeta para mezclar e incubar en hielo durante al menos 15-20 min.
  3. Lavar las células.
    1. Añadir 8 mL PBS/10% FBS. Centrifugar las células a 300 x g por 5 min, aspirado y vuelva a suspender la célula pellet con 1 mL PBS/10% FBS.
    2. Quitar grupos de célula por pipetear la suspensión de células a través de una tapa de filtro de célula 35 μm en un tubo de 5 mL. Lave el filtro de la celda con un adicional 3 mL PBS/10% FBS. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos, aspirar, vuelva a suspender en 500 μl PBS/10% FBS y coloque en hielo hasta el FACS.

4. Índice de clasificación de precursores Hemogenic solo a 96-pocillos con estroma AGM-CE para el cocultivo

  1. Preparar la máquina de FACS para modo de placa y alinear para clasificar a las placas de 96 pocillos según las instrucciones del fabricante. Seleccione modo unicelular y el índice de clasificación el modo en el software para la configuración de máscara de pureza máxima y permitir la adquisición de parámetros de índice para cada celda seleccionada.
  2. Tomar una muestra de células del anticuerpo teñido muestras para establecer puertas para la clasificación.
    1. Carga la muestra de células teñidas en la máquina de FACS y adquirir las células en el caudal más bajo. Trama de la FSC-A versos SSC-A y seleccionados una puerta que incluye células de tamaño variable (figura 1B) (que se basa en la observación que actividad de pre-HSC se identifica en las células de los perfiles de diferentes tamaños en la AGM17). Trama de la FSC-A versos W de FSC y SSC-A versos SSC-W y seleccione puertas excluir dobletes. Luego trama de la FSC-A versos DAPI a células vivas (negativas para DAPI) la puerta (figura 1B).
    2. Parcela PECy7 (o el fluorocromo correspondiente para la mancha VE-cadherina) versus PerCP (o el fluorocromo correspondiente para la mancha EPCR). Células de la puerta que son positivas para el VE-cadherina (que incluye una población mixta de células endoteliales así como progenitores hematopoyéticos y pre-HSC de la AGM) y que tiene alta expresión de EPCR (que enriquece para pre-HSC de P-Sp/AGM17). Esta es la puerta final que se utilizará al índice tipo las células en el paso 4.3 (figura 1B).
    3. Parcela fluorocromos más utilizados para la tinción.
      Nota: Dependiendo de la subpoblación a analizar, puertas adicionales pueden establecerse basándose en la detección de otros marcadores incluidos para la tinción de las células. Sin embargo, el índice de clasificación permite la grabación de los parámetros fluorescentes para cada celda seleccionada tal que estos parámetros se pueden analizar retrospectivamente. Así, ningún control adicional es necesario en este punto. Para todas las configuraciones de FACS, muestras teñidas con anticuerpos solo deben utilizarse para ajustar la compensación, para tener en cuenta para el derrame en la emisión de superposición fluorocromos con anticuerpos de control de isotipo, cuenta para tinción de fondo y determinar puertas de positivo/negativo.
  3. Índice de ordenar las celdas AGM.
    1. Coloque una placa de 96 pocillos con el estroma AGM-CE en medios sin suero AGM con citoquinas (del paso 1.5.3) en el bloque de la placa de la máquina de clasificación de FACs. Carga de la muestra y comenzar la adquisición de la muestra. Seleccionar el modo de índice individual clasificación celular y comenzar las células sortingsingle a 96-pocillos individuales. Utilice la tasa más baja de la flujo para minimizar el estrés de cizalla sobre las células embrionarias.
    2. Asegúrese de que todos los eventos se registran durante la clasificación del índice. Esto permitirá la enumeración del número total de células analizadas en la puerta de clasificación comparada con el actuales número clasificados individual 96 pozos, como no todos los eventos registrados se ordenarán a los pozos.
    3. Una vez que las células han sido ordenadas a una toda placa de 96 pocillos, colocar la placa en una incubadora a 37 ° C en 5% CO2de cultivo de tejidos. Repita para las placas adicionales requeridas por el experimento.
    4. Células en cultivo Co clasificado individualmente en los pozos de 96 que contienen AGM-CE (de paso 4.3) durante 7 días (5 días para las células ordenadas de embriones E11-11.5, 6 días a partir de embriones E10-10.5, 7 días a partir de embriones E9-9.5). Visualizar colonias hematopoyéticas de diferentes tamaños y morfologías con un microscopio invertido con 100 aumentos (figura 2B) después del período de la cultura.
      Nota: Los medios de comunicación no necesitan ser cambiado durante el período de la cultura. Clasificados hemogenic precursores pueden integrar inicialmente en la capa de AGM-CE con una morfología similar a CE y no pueden distinguirse inicialmente estroma AGM-CE (figura 2A). Sin embargo, siguiente 24-48 h en cocultivo, pequeña, redondeadas de células hematopoyéticas o racimos de células pueden detectarse. Al final de la cultura (5-7 días), se pueden visualizar colonias individuales de células hematopoyéticas en el subconjunto de 96-pozos que recibió de una célula ordenada con potencial hematopoyético clonal. Si visualmente inspeccionados pocillos contienen más de una colonia distinta, entonces en este ejemplo se excluye de análisis aguas abajo para excluir las muestras que han sido más de una célula ordenada por pozo.

5. Análisis de progenie hematopoyética Clonal tras cultura Co

  1. Cosecha de clones de cada uno de 96 pocillos para el análisis FACS.
    1. Vigorosamente la pipeta para disociar las células hematopoyéticas de las capas endoteliales utilizando una pipeta multicanal con puntas de pipeta de 200 μl. Trate de no disociar la capa endotelial. Saque 100 μl (~ 50% de la muestra) para el análisis fenotípico de progenie hematopoyética por FACS.
    2. Transferencia a una placa de 96 pocillos fondo V y centrifugar a 300 x g durante 2 minutos para que sedimenten las células. Quitar los medios de comunicación por sacudiendo los medios de comunicación de la placa con un solo movimiento rápido mientras que se invierte la placa (placa de la película).
    3. Colocar las células μl 100 restantes en la placa de 96 pocillos original en un uso de incubatorfor de 37 ° C en el ensayo de engraftment posterior (paso 6).
  2. Incubar las células con los anticuerpos adecuados para análisis hematopoyético.
    1. Vuelva a suspender los pellets de células en cada pozo un 96-well V-fondo con 50 μl de FBS PBS/2% que contiene el bloque de FcR de 10 μg/mL y 1 μg/mL DAPI. Incubar la placa a 4 ° C durante 5 minutos.
    2. Añadir 50 μl de FBS PBS/2% que contiene 10 μg/mL FcR bloque y una mezcla de anticuerpos para el análisis HSC que contienen conjugado con PE-Cyanine7 anti-VE-cadherina, conjugado con PerCP anti-CD45 conjugado con PE anti-EPCR, conjugado con APC anti-Sca1 y conjugado con FITC anti-Gr1 y anti-F4/80 (cada anticuerpo a dilución final de 1: 100 salvo indicación en contrario basada en las recomendaciones del fabricante o según valoraciones). Incubar la placa a 4 ° C durante al menos 20 minutos.
  3. Retirar el anticuerpo no unido con diluciones secuenciales y analizar las células.
    1. Agregar 200 μL/pocillo PBS/2% FBS y centrifugar a 300 x g durante 2 minutos para que sedimenten las células. A continuación, parpadeará placa para descartar el sobrenadante y añadir 200 μL PBS/2% FBS a cada pellet celular y centrifugar a 300 x g durante 2 minutos para que sedimenten las células.
    2. Placa para descartar el sobrenadante y añadir 50 μL/pocillo PBS/2% FBS para el análisis de la película. Proceder a analizar las células por FACS usando un citómetro de flujo equipado con un lector de placas.
      Nota: Adquirir un volumen fijo de células (por ejemplo, 35 μl de la total 50 μl utilizados para re-suspensión) para enumerar los subconjuntos de progenie hematopoyética.
  4. Analizar los datos FACS para cada pocillo que contenga progenie hematopoyética a pantalla para las colonias que contienen HSC potenciales (figura 3).
    1. Puerta en primer lugar la población de CD45 positivo negativo para los marcadores mieloides Gr1 y F480. No de la puerta hacia fuera de las células que todavía expresan bajos niveles de VE-cadherina. Las células de la capa de AGM-CE que se interrumpen durante la cosecha de colonias hematopoyéticas son CD45 negativo y positivo de VE-cadherina.
    2. Puerta de CD45+VE-Cad- / bajoGr1 células de F4/80– –más lejos en el subconjunto que expresan altos niveles de EPCR y Sca1 (Figura 3A -C).
      Nota: en estudios anteriores, las colonias que carecen de células CD45+VE-Cad- / bajoGr1––de F4/80 Sca1HolaEPCRHola fenotipo (figura 3D) reproducible no detectable engraftment del multilineage de sangre periférica de ratones receptores irradiados17 (datos no mostrados); así, estas colonias no necesitan ser incluidas en el análisis subsecuente del trasplante en el paso 6.

6. Análisis de propiedades de Engraftment de Clones individuales y la correlación con las características fenotípicas aclados por índice de clasificación

  1. El día de (si es posible) o la mañana siguiente el análisis fenotípico en el paso 5, resuspendidas las restantes células de 100 μl de cada 96 pocillos que contienen colonias hematopoyéticas después de cocultivo (del paso 5.1) mediante pipeteo vigoroso utilizando una pipeta de 200 μl.
  2. Preparar y añadir las células rescate de toda la médula ósea de congenic cepa B6. SJL-PtprcunaPepcb/BoyJ (CD45.1 B6) ratones adultos16,17.
    1. Contar las células nucleadas de la médula en la solución de turcos en un hemocitómetro. Diluir hasta una concentración de 5 x 105 nucleated células/mL en PBS con 2% FBS.
    2. Añadir 100 μl de células de médula ósea de rescate (5 x 104) a cada pocillo que contenga progenie hematopoyética para análisis de trasplante y mezclar mediante pipeteo.
  3. Trasplante de progenie de clones individuales en una única letalmente irradiados congenic receptora cepa B6. SJL-PtprcunaPepcbratón adulto /BoyJ (CD45.1 B6).
    1. Letalmente irradiar la misma cantidad de ratones B6 CD45.1 como el número de clones para inyectar individualmente la progenie de una sola copia (con 1.000 cGy de una fuente de cesio).
    2. Sacar 200 μL total suspensión (esto incluye las células del clon, así como células de médula ósea de rescate 5 x 104 CD45.1 B6) en una jeringa de insulina de ½ mL con aguja 29 G 1/2 pulgada.
    3. Irradiado letalmente antes de 2-24 h recipientes adultos CD45.1 B6 inyectable.
    4. Mediante un limitador de ratón de plástico que permite el acceso de la cola, inyectar por el volumen de 200 μL de vena de cola que contiene las células de cada clon y 5 x 104 B6 CD45.1 adulto rescate las células médula ósea para ayudar en la supervivencia del receptor.
    5. Etiqueta del oído y pesan los ratones receptores y comprobar su peso y de salud a intervalos regulares (por ejemplo, 3 - 4 veces / semana post trasplante de irradiación, o por los procedimientos de operación estándar institucionales) para asegurar la buena salud.
  4. Realizar análisis del engraftment de la sangre periférica a intervalos regulares (por ejemplo, 2, 16, 24 semanas) después del trasplante.
    1. Quitar 50-100 μl de sangre por sangrado retro-orbital o cualquier otro método de dejar sangre éticamente aprobado.
    2. Añadir 3 mL de tampón de lisis (16,6 g de NH4Cl, 2 g de NaHCO3 y 74,4 mg EDTA 2 L H2O) a la sangre e incubar a temperatura ambiente durante 5 min centrifugar a 300 x g durante 5 min aspirado y resuspender el sedimento con 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
    3. Resuspender el sedimento con 150 μL PBS/2% FBS que contiene 10 μg/mL FcR bloque y 1 μg/mL DAPI y dosificación 1/3 del volumen a un bien que contiene controles de isotipo μl 50 donantes y linaje, 1/3 a un anticuerpo de 50 μl que contiene bien controles donantes e isotipo linaje y 1/3 a un pozo que contienen 50 μl anticuerpos para detectar donantes y linaje.
      Nota: Los anticuerpos para la detección del engraftment del multilineage: conjugado con APCeFluor780 anti-CD45.2, conjugado con Pe-Cyanine7 anti-CD45.1, conjugado con FITC anti-CD3, conjugado con PE anti-F4/80, conjugado con PerCP anti-Gr1 y conjugado con APC anti-CD19, o controles de isotipo correspondiente.
    4. Identificar clones con el engraftment a largo plazo mediante la evaluación de la contribución de sangre periférica por la FACS en el tiempo de CD45.2 (donante)-derivados de células hematopoyéticas mieloides (Gr1 o F4/80, positivo), células B (CD19 positivos) y células T (CD3 positivos) (Figura 4A de -B).
      Nota: Engraftment hematopoyético puede ser analizado también por CD45.2 (donante)-derivado contribución a poblaciones hematopoyéticas tejidos cosechados de médula ósea, bazo, timo y peritoneo, o después de secundaria el trasplante de células de médula ósea en B6 CD45.1 ratones para analizar propiedades de engraftment serie17.
  5. Correlacionar propiedades fenotípicas de cada clon según lo determinado por el índice inicial unicelular clasificación con las propiedades del engraftment. Usando software de análisis de flujo, cargar parámetros de clasificación para cada celda ordenadas de índice (correlacionado con los 96 pocillos que se clasificó). Mapa funcionales datos en diagramas de flujo para evaluar las propiedades fenotípicas de las células que afectan a su rendimiento funcional (por ejemplo, a largo plazo, del multilineage engraftment) (figura 4).

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Resultados

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Figura 1A se muestra un esquema del diseño experimental. Una vez tejidos P-Sp/AGM son disecados, agrupados y disociados en la colagenasa, se mancharon con anticuerpos contra VE-cadherina y EPCR para clasificar el índice. Pre-HSC están enriquecidos en células ordenadas en VE-cadherina+EPCRalta (figura 1B). Otros anticuerpos conjugados con fluorocromo puede incluidas analizar retrospectivamente los parámetros ...

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Discusión

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El estudio de la génesis de la HSC durante el desarrollo embrionario requiere medios para detectar posible precursores de hemogenic aún falta la competencia para proporcionar a largo plazo del multilineage reconstitución hematopoyética en recipientes adultos trasplantados de HSC. En este protocolo, presentamos un ensayo clonal de precursores hemogenic embrionario por co-cultivo stromal vascular nicho ECs de la Junta General, que apoya la maduración de los precursores de HSC, con posterior análisis funcional en los ensayo...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a Andrew Berger, Stacey Dozono y Brian Raden en el Fred Hutchinson flujo Cytometry núcleo de asistencia con FACS. Este trabajo fue apoyado por la beca de los institutos nacionales de salud NHLBI UO1 #HL100395, auxiliares Collaborative Grant #HL099997 y NIDDK conceden #RC2DK114777. Brandon Hadland es apoyado por el Alex Lemonade Stand Foundation y Hyundai Hope sobre ruedas Fundación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medios de cultivo AGM-EC
Materiales para el cultivo de células endoteliales
TrypLE ExpressGibco12605-028Uso para disociar monocapas de AGM-EC Gelatina
0,1% en aguaStemCell Technologies7903Úselo para adherir monocapas de AGM-EC al plástico
Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillosCorning3599Úselo para cocultivar monocapas AGM-EC y clones clasificados por índice
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)Gibco14190-144Uso para disección y tinción FACS
Frascos de filtro de 500 mlFisher Scientific 9741202Uso para filtrar estériles Medios endoteliales
AGM-EC medios de cultivo (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco12440-053400 mls
Hyclone Fetal BovineSerum Fisher ScientificSH30088.03100 mls
Penicilina EstreptomicinaGibco15140-1225 mls
HeparinaSigmaH314950 mg disueltos en 10 mls
medio L-glutamina (200 mM)StemCell Technologies71005 mls
mitógeno endotelial (ECGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)Agregue 10 ml de medio para disolver y agregue
Materiales para clasificación de índice AGM
0.25%)StemCell Technologies7902Uso para la disociación de tejidos embrionarios
jeringa de 3 mlBD Biosciences309657Úselo para filtrar soluciones de anticuerpos estériles para FACS
0.22 y micro; M filtro accionado por jeringaMillipore SLGP033RSÚselo para filtrar estériles soluciones de anticuerpos para FACS
Tubo de poliestireno de 5 ml con tapón de filtro de célulasCorning352235Úselo para eliminar los grumos de células antes de FACS
DAPI (preparado como stock de 1 mg/ml en H2O)Millipore268298Úselo para excluir células muertas de la clasificación
anti-ratón CD16/CD32 (bloque FcR)BD Biosciences553141Se utiliza para bloquear la tinción inespecífica de los receptores Fc
Anticuerpos para el índice AGM Tipo
Anti-ratón CD144 PE-Cyanine7eBioscience25-1441-82Tinción de
rata IgG1 kappa Control de isotipo, PE-Cyanine7eBioscience25-4301-81 Control deisotipo para CD144 PE-Cyanine7
Anti-ratón CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80Tinción de
rata IgG2b kappa Control de isotipo, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80Control de isotipo para CD201 PerCP-eFluor710
Anti-ratón CD41 PEBD Biosciences558040Rata tintorera
IgG1 kappa Control de isotipo, PEBD Biosciences553925Control de isotipo para CD41 PE
Anti-ratón CD45 FITCeBioscience11-0451-85Tinción
rata IgG2b kappa Control de isotipo, FITCeBioscience11-4031-81Control de isotipo para CD45 FITC
AGM-medios libres de suero (10 mls)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 mls
factor de células madre murinas recombinantes (SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml de stock) Concentración final 100 ng/ml
de ligando FLT3 humano recombinante (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml de stock) Concentración final 100 ng/ml
de trombopoyetina humana recombinante (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml de stock) Concentración final 20 ng/ml
de interleucina-3 (IL3) murina recombinante)Peprotech213-132 ml (100 mg/ml de stock) Concentración final 20 ng/ml
Materiales para la tinción de células co-cultivadas
placa de pocillos de 96, fondo en VCorning3894Uso para el análisis de FACS
Anticuerpos para el análisis de clones clasificados por índice co-cultivados con células endoteliales
Anti-ratón CD45 PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-0451-82Tinción de
rata IgG2b kappa Control de isotipo, PE-Cianina5.5eBioscience35-4031-80Control de isotipo para CD45 PerCP-Cianina5.5
Anti-ratón CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82Rata tintorera
IgG2b kappa Control de isotipo, PEeBioscience12-4031-81 Control deisotipo para CD201 PE
Anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83Control
IgG2a kappa, APCeBioscience17-4321-81Control de isotipo para Ly-6A/E APC
Anti-ratón F4/80 FITCeBioscience11-4801-81Rata de tinción
IgG2a kappa Control de isotipo, FITCeBioscience11-4321-41 Control deisotipo para F4/80 FITC
Anti-ratón Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Tinción de
rata IgG2b kappa Control de isotipo, FITCBD Biosciences556923Control de isotipos para Ly-6G/C y CD3 FITC
Materiales para inyección de venas de cola para trasplante
1/2 ml con agujas de 29G 1/2"BD Biosciences309306Uso para inyección de venas de cola para trasplante
para el análisis de sangre periférica después de la tinción translante
anti-ratón Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426Rata de tinción
IgG2b kappa, PerCPBiolegend400629Control de isotipo para Ly-6G/C PerCP
Anti-ratón F4/80 PEeBioscience12-4801-82Tinción
Rata IgG2a kappa Control de isotipo, PEeBioscience12-4321-80Control de isotipo para F4/80 PE
Anti-ratón CD3 FITCBD Biosciences555274 Tinción
Anti-ratón CD19 APCBD Biosciences550992Tinción Rata
IgG2a kappa Control de isotipo, APCBD Biosciences553932Control de isotipo para CD19 APC
Anti-ratón CD45.1 (A20) PE-Cianina7eBioscience25-0453-82Control de
IgG2a kappa, PE-Cyanine7eBioscience25-4321-81 Control deisotipo para CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-ratón CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82Control de
isotipo de rata de tinción IgG2a kappa, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80 Control deisotipo para CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II con software DIVABD Biosciences
BD FACSCanto II con lector de placasBD Biosciences
HemocitómetroFisher ScientificS17040Para el recuento
de células Pipeta multicanalFisher Scientific14-559-417para células dosificadoras
software de análisis FACSFlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
( de de isotipo de rata de tinción isotipo de rata de tinción

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

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