Contorneamos un protocolo para detectar la expresión simultánea de marcadores de células madre de leucemia en las células de la leucemia mieloide aguda primaria por citometría de flujo. Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos.
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Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta
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Resumen
Resumen
Leucemia mieloide aguda (AML) es heterogénea y si no se trata, la enfermedad fatal. Es la causa más común de mortalidad asociada a la leucemia en adultos. Inicialmente, la LMA es una enfermedad de las células madre hematopoyéticas (HSC) caracterizado por la detención de la diferenciación, la posterior acumulación de células de la ráfaga de la leucemia y la producción de elementos hematopoyéticos funcionales. Heterogeneidad se extiende a la presencia de células de la leucemia (LSC), con esta dinámica celular compartimiento evolucionando para superar distintas presiones de selección impuestas durante el tratamiento y la progresión de la leucemia. Para definir la población de la LSC, la adición de CD90 y CD45RA permite la discriminación de HSCs normales y progenitores multipotentes dentro del compartimiento de células CD34 + CD38. Aquí, describimos un protocolo para detectar la expresión simultánea de varios marcadores LSC putativos (CD34, CD38, CD45RA, CD90) en las células primarias de la ráfaga de AML humana mediante citometría de flujo multiparamétrico. Además, mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos. Este método de detección y cuantificación de LSC putativo pueden usarse para el seguimiento clínico de la respuesta de la quimioterapia (ej., enfermedad residual mínima), como LSC residual puede causar recaída AML.
Introducción
Leucemia mieloide aguda (AML) es la causa más común de mortalidad asociada a la leucemia. Inicialmente, la LMA es una enfermedad clonal de las células madre hematopoyéticas (HSC) caracterizado por la detención de la diferenciación, la posterior acumulación de células de la ráfaga y la producción de elementos hematopoyéticos funcionales. Recientemente, heterogeneidad clonal de la población de células de la ráfaga se ha establecido básicamente utilizando estrategias de secuenciación (NGS) de próxima generación y que muestra la existencia de la evolución intra clonal del tumor las células1.
Heterogeneidad se extiende a ....
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Protocolo
Seguimos las normas europeas para el uso de animales para fines científicos. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética local (#3097-2015120414583482v3).
1. preparación de la muestra
- Recoger de la médula (2 mL) de novo de AML en tubos que contienen el ácido etilendiaminotetracético anticoagulante (EDTA) en una concentración de 1,8 mg / mL de médula ósea.
- Realizar separación de Ficoll, una separación del gradiente de densidad para aislar las células mononucleares de eritrocitos y granulocitos, como sigue. Diluir la médula ósea en 3 volúmenes de solución salina buffer fosfato (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, N....
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Resultados
Aquí presentamos un método para determinar las poblaciones progenitoras en muestras de médula ósea de humanos normales y malignas. Recogió la médula ósea y el bazo de un éxito PDX y realizar citometría de flujo multiparamétrico, como se describe anteriormente. Se compararon varias subpoblaciones de células de la ráfaga entre la muestra del paciente diagnóstico y PDX correspondiente y particularmente, el compartimiento del progenitor de CD34 + CD38, notablemente enriquecidas en LSC putativo. Hemos encontrado que la fracci.......
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Discusión
Una evaluación precisa y reproducible de membrana o marcadores citoplasmáticos por citometría de flujo requiere que opciones se verifican cada día para la alineación óptica, buen funcionamiento del sistema neumático, sensibilidad óptica y normalización con perlas de calibración.
Detección de poblaciones celulares de la ráfaga en AML mediante análisis de citometría de flujo multi-paramétricos CD90 y CD45RA es un método relativamente simple y confiable. Un paso fundamental en este análisis es un.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por el francés Asociación Laurette Fugain, LigueContre le cáncer (centro norte), Fondation de France (Comité de leucemia), Oncolille SIRIC e Instituto Nacional del cáncer francés.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8,29 g de NH4Cl + 0,037 g de Na2EDTA en 100 mL de solución estéril de H2O y RBC Lysis B: 1 g de KHCO3 en 100 mL de H2 |
| O NOD/SCID/IL2R&gamma estéril; cnull (NSG) ratones | JACKSON LABORATORY | Nº de inventario: 005557 | |
| PBS | Gibco de life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – Tampón de separación | MACS Tampón MACS Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clon FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clon D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clon 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clon J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clon 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clon HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clon LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clon J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD BD | Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| Kit de selección de PE humano EasySep | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep imán | Tecnologías de células madre | 18551 |
Referencias
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One.
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Reimpresiones y permisos
