Ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser

Resumen

Herir la membrana de la célula a través de dos fotones láser es un método ampliamente utilizado para evaluar la capacidad mismo-resellado de la membrana y se puede aplicar a múltiples tipos de células. Aquí, describimos un protocolo en vitro en vivo imágenes de cierre de membrana en células de pacientes dysferlinopathy después de la ablación láser de dos fotones.

Resumen

Numerosos insultos fisiopatológicos pueden causar daño a las membranas celulares y, cuando está juntado con defectos naturales en la reparación de la membrana de la célula o integridad, pueden resultar en enfermedad. Comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes que rodean la reparación de la membrana de la célula es, por tanto, un objetivo importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para enfermedades asociadas a la membrana celular disfuncional dinámica. Muchos estudios in vitro e in vivo para entender el cierre de membrana de la célula en diversos contextos de la enfermedad utilizan la ablación del laser de dos fotones como un estándar para la determinación de los resultados funcionales después de tratamientos experimentales. En este ensayo, las membranas celulares son sometidas a heridas con un láser de dos fotones, que hace que la membrana de la célula a la ruptura y el colorante fluorescente para infiltrarse en la célula. La intensidad de fluorescencia dentro de la célula puede controlarse entonces para cuantificar la capacidad de la célula para sellar a sí mismo. Existen varios métodos alternativos para evaluar la respuesta de membrana de la célula a la lesión, así como gran variación en el láser de dos fotones hiriendo a enfoque sí mismo, por lo tanto, un modelo de célula herir unificada beneficioso serviría para disminuir el variación entre estas metodologías. En este artículo, describiremos un láser simple de dos fotones hiriendo a protocolo para la evaluación de membrana celular reparación en vitro en ambos sanos dysferlinopathy paciente fibroblastos y las células transfected con o sin un plásmido de cuerpo entero del dysferlin.

Introducción

La membrana celular de las células eucariotas consiste en una doble capa de fosfolípidos proteína tachonada, que define el entorno intra/extracelular de la célula y es esencial para mantener la homeostasis celular, supervivencia celular. Lesiones de la membrana de la célula derivados de insultos mecánicos o químicos son comunes en varios tipos de células de mamífero, incluyendo esquelético y músculo cardiaco, estómago y pulmón células^1,2,3,4. Además de lesiones consiguientes a función fisiológica diaria, las membranas celulares también puede....

Protocolo

Las células de fibroblastos humanos utilizadas en este estudio fueron utilizadas con la aprobación del Comité de ética humana de la Facultad de medicina y Odontología de la Universidad de Alberta.

1. transfección de células con el plásmido DYSF integral

1. Células fibroblastos en cultivo en un matraz T225 que contiene 40 mL de medio de crecimiento - 36 mL Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), 4 mL de suero bovino fetal (FBS) y 20 μl de penicilina/estreptomicina (P/S) - en un incubador de CO₂ a 37 ° C.
   Nota: Las células deben ser cultivadas a aproximadamente 70-80% de confluencia y no debe ser completamente confluen....

Resultados

Fibroblastos humanos saludables, fibroblastos de pacientes no tratados dysferlinopathy y fibroblastos pacientes transfectados con un plásmido que contiene la secuencia completa del dysferlin fueron sometidos a dos fotones láser hiriendo a evaluar la capacidad de cierre de membrana en tiempo real. Las células de fibroblastos humanos sanos muestran bajos niveles de activación de la fluorescencia de FM 4-64 después de heridas de láser y fibroblastos de pacientes no tratados exhiben un alto g.......

Discusión

Dos fotones láser herir de la membrana celular es una técnica precisa y versátil para la evaluación de la dinámica de la membrana de cierre in vitro. En este artículo, describe un protocolo para determinar la membrana de la célula resellado capacidad en dysferlinopathy paciente células usando el laser de dos fotones hiriendo a ensayo. Nuestros resultados muestran que las células pacientes dysferlinopathy son defectos de cierre de la membrana de la célula, que es consistente con hallazgos de otros investigadores .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Suero Fetal Bovino	Sigma-Aldrich	F1051
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Trypsin-EDTA (0,05%), rojo fenol	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	D8537
Platos con fondo de vidrio recubiertos de colágeno de 35 mm	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Medios privados de suero	Thermo Fisher	31985070
Reactivo de transfección	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Dye	Invitrogen	T13320
Tyrode' s Solución de sales	Sigma-Aldrich	T2397
Microscopio de barrido láser confocal	Carl Zeiss	NA
Chameleon Láser de dos fotones	coherente	NA