Artículo de método

Fabricación y caracterización de tejido óptico fantasmas que contiene macroestructura

DOI:

10.3791/57031

⸱

12 de febrero de 2018

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1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University, 2Deparment of Molecular Pathogenesis and Immunology, Texas A&M College of Medicine

En este artículo

Resumen

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Fantasmas de tejido óptico son herramientas esenciales para la calibración y caracterización de sistemas de proyección de imagen ópticos y validación de modelos teóricos. Este artículo detalla un método para la fabricación de fantasma que incluye replicación de propiedades ópticas del tejido y estructura tridimensional del tejido.

Resumen

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El rápido desarrollo de nuevas técnicas de imagen ópticas depende de la disponibilidad de estándares de bajo costo, personalizables y fácilmente reproducibles. Al replicar el entorno de imagen, pueden eludirse costosos experimentos con animales para validar una técnica. Predecir y optimizar el rendimiento de en vivo y ex vivo , técnicas de imagen requieren pruebas en muestras que son ópticamente similares a los tejidos de interés. Fantasmas ópticos imitan tejido proporcionan un estándar para la evaluación, caracterización y calibración de un sistema óptico. Fantasmas de polímero homogéneo tejido óptico son ampliamente utilizados para imitar las propiedades ópticas de un tipo de tejido específico dentro de un rango espectral estrecho. Capas de tejidos, como la epidermis y la dermis, pueden mímico simplemente apilando estos fantasmas de losa homogénea. Sin embargo, muchos en vivo las técnicas de imagen se aplican a más del tejido espacial complejo donde tres estructuras dimensionales, tales como vasos sanguíneos, vías respiratorias o defectos de tejido, pueden afectar al rendimiento del sistema de proyección de imagen.

Este protocolo describe la fabricación de un fantasma imitando tejido que incorpora complejidad estructural tridimensional usando un material de propiedades ópticas del tejido. Tablas de consulta proporcionan recetas de tinta de la India y dióxido de titanio para objetivos de dispersión y absorción óptica. Se describen los métodos para caracterizar y ajustar las propiedades ópticas del material. El fantasma fabricación detallada en este artículo tiene un vacío interno de falsa vía aérea ramificación; sin embargo, la técnica puede aplicarse ampliamente a otras estructuras de tejido u órgano.

Introducción

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Fantasmas de tejido se utilizan ampliamente para la caracterización del sistema y la calibración de instrumentos ópticos de proyección de imagen y espectroscopia, incluyendo sistemas multimodalidad con ultrasonido o modalidades nucleares1,2,3 ,4. Fantasmas proporcionan un control entorno óptico para la caracterización del sistema y control de calidad de múltiples técnicas de imagen biológicas. Tejido imitando los fantasmas son útiles en predecir el rendimiento del sistema y optimizar el diseño del sistema para la tarea fisiológica; por ejemplo predecir la profundidad que sondaba de sensores espectroscópicos para evaluar tumor márgenes de5. Propiedades ópticas y diseño estructural de los fantasmas pueden ser afinadas para imitar el entorno fisiológico específico en el cual se utilizará el instrumento, permitiendo, por tanto, para estudios de factibilidad y de verificación del sistema de rendimiento3, 6,7. Verificación del rendimiento del sistema con fantasmas ópticos realista antes de entrar en los ensayos preclínicos o clínicos de imagen reduce el riesgo de mal funcionamiento o la adquisición de datos inutilizables durante estudios en vivo . La reproducibilidad y estabilidad de fantasmas ópticos hacen estándares de calibración personalizables de técnicas ópticas controlar la variabilidad de intra y inter instrument, particularmente en ensayos clínicos multicéntricos con diferentes instrumentos, operadores y condiciones ambientales8,9.

Fantasmas de tejido imitando también sirven como modelos físicos armoniosas y reproducibles para la validación de los modelos teóricos de ópticos. Simulaciones de ayuda en el diseño y optimización de en vivo los instrumentos ópticos, mientras que reduce la necesidad de animal experimentos10,11. El desarrollo y validación de las simulaciones ópticas para representar fielmente el ambiente en vivo pueden ser estorbadas por la complejidad de la estructura del tejido, el contenido bioquímico y la localización de la blanco o el tejido dentro del cuerpo. Variabilidad entre sujetos hace validación de modelos teóricos difíciles utilizando mediciones de animales o humanas. Fantasmas de tejido óptico del polímero permiten validación de modelos teóricos proporcionando un entorno óptico conocido y reproducible en la que para el estudio del fotón migración12,13,14,15.

Con el fin de la calibración del sistema, fantasmas ópticos sólidos pueden consistir en una sola losa homogénea de polímero curado con la dispersión óptica, absorción o fluorescencia para las longitudes de onda de interés. Capas de polímero fantasmas se utilizan con frecuencia para simular la variación de la profundidad de las propiedades ópticas del tejido en el tejido epitelial modelos16,17. Estas estructuras fantasmas son suficientes para la proyección de imagen epitelial y modelado, porque la estructura del tejido es bastante homogénea a través de cada capa. Sin embargo, la escala más grande y estructuras más complejas afectan transporte radiativo en otros órganos. Métodos para crear fantasmas más complejos se han desarrollado para simular el entorno óptico de vasos subcutáneos18,19 y órganos aun enteros, como el de vejiga20. Modelado de transporte ligero en los pulmones proporciona un problema singular debido a la estructura ramificada de la interfaz de aire tejido; un fantasma sólido no es probable que replicar transporte radiativo en el órgano exactamente21. Para describir un método para incorporar un fantasma óptico de estructura compleja, se describe un método para crear un árbol fractal interna, reproducible vacío que representa la estructura macroscópica de tridimensional (3D) de la vía aérea (figura 1).

En las últimas décadas, impresión 3D se ha convertido en un método predominante para la creación rápida de prototipos de dispositivos médicos y modelos22y fantasmas de tejido óptico no son la excepción. Impresión 3D se ha utilizado como una herramienta de fabricación aditiva para la fabricación de ópticos fantasmas con canales23, vaso sanguíneo redes24y modelos animales pequeños de cuerpo entero25. Estos métodos utilizan uno o dos materiales de impresión con características ópticas únicas. Métodos también se han desarrollado para afinar las propiedades ópticas del material de impresión para imitar el tejido biológico general, turbio25,26. Sin embargo, la gama de propiedades ópticas alcanzables están limitados por el material de la impresión, generalmente un polímero como el acrilonitrilo butadieno estireno (ABS)26, por lo que este método no es adecuado para todos los tejidos biológicos. Polidimetilsiloxano (PDMS) es un polímero ópticamente transparente que puede ser fácilmente mezclado con dispersión y absorción de partículas con un alto nivel de afinabilidad27,28. PDMS también se ha utilizado para moldear los fantasmas con modelos de aneurisma para el despliegue de dispositivos embolic29,30. Estos fantasmas también utilizan una parte impresa 3D soluble, pero siendo ópticamente transparente para visualizar el despliegue del dispositivo. Aquí, se combina este método con afinabilidad de las propiedades ópticas de PDMS con dispersión y absorción de partículas para la fabricación de un modelo preliminar del tejido y las vías respiratorias de los pulmones murinos.

Mientras que el fantasma que se presenta aquí es específico a los pulmones, el proceso puede aplicarse a una variedad de otros órganos. Impresión 3D de la estructura interna del fantasma permite el diseño para ser personalizables para cualquier propósito y escala para imprimir, ya sea sangre o red de vasos linfáticos, médula ósea o incluso las cuatro cámaras estructura del corazón31. Porque estamos interesados en la proyección de imagen óptica y modelado del pulmón32,33,34, se ha optado para usar un árbol de cuatro generación fractal como la estructura interna para replicar en el polímero fantasma. Esta estructura fue diseñada para aproximar la estructura de ramificación de la vía aérea y ruptura de apoyo material para el proceso de impresión 3D. Una vía aérea más anatómicamente correcta podría ser impreso si el material de apoyo de ruptura no es necesario. Aunque este modelo en particular representa una vía aérea, la estructura interna del fantasma no tiene que permanecer un vacío material. Una vez que el polímero circundante se cura y se disuelve la parte impresa 3D, la estructura interna puede utilizarse como una vía de flujo o como un molde secundario para un material con características de dispersión y absorción única. Por ejemplo, si la estructura interna de este protocolo fue diseñada como un hueso digital en lugar de una vía aérea, la estructura ósea podría ser 3D impreso moldeado con PDMS con propiedades ópticas de los dedos y entonces disuelto fuera el fantasma. El vacío puede ser rellenado con una mezcla PDMS con propiedades ópticas diferentes. Además, cada molde no se limita a una sola parte soluble. Un fantasma del dedo podría crearse para incluir huesos, venas, arterias y una capa general de tejido blando, cada uno con sus propias propiedades ópticas únicas.

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Protocolo

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1. selección y verificación de las propiedades del Material matriz

  1. Antes de iniciar el proceso de fabricación fantasma (figura 1), encuentra la absorción y los coeficientes de dispersión reducida de los tejidos biológicos de interés en la proyección de imagen wavelength(s). Las estimaciones preliminares pueden encontrarse en las referencias35,36. Sin embargo, la validación de los coeficientes ópticos puede ser necesario.
  2. Utilizando las tablas de consulta para el coeficiente de absorción μunay coeficiente de dispersión reducida, μs', en el 488, 535, 632 y 775 nm las longitudes de onda (tablas 1 y 4 y figuras 2– 3), seleccionar las concentraciones de tinta de la India y dióxido de titanio (TiO2) que se aproximan a las propiedades ópticas deseadas. Estas recetas son específicas fantasmas fabricados con PDMS. Como estas tablas proporcionan datos experimentales en longitudes de onda discretas, optimización de la receta puede ser necesario para la aplicación específica.
  3. Fabricar una losa de polidimetilsiloxano (PDMS) de la receta seleccionada para la confirmación de características ópticas.
    1. Utilizando una proporción 10:1 en peso de resina PDMS para agente de curado, vierta los ingredientes en la taza de mezcla en el siguiente orden: resina de PDMS, TiO2, tinta de la India, PDMS agente endurecedor.
      Nota: Aquí, probamos dos recetas: 1) 2 mg TiO2 + tinta de la India de 3,5 μl / g PDMS y 2) 1 mg TiO2 + tinta de la India de 10 μl / g PDMS. Para cada receta, resina PDMS de 4.5 g y el agente endurecedor de PDMS de 0.45 g se utilizan con los correspondientes importes de partículas ópticos.
    2. Mezclar en un mezclador de velocidad (véase Tabla de materiales) para 60 s. Si TiO2 partículas se pegan a la mezcla de la taza (probable con altas concentraciones de TiO2) mezclar a mano para quitar las partículas de la base de la Copa y mezclar en la mezcladora para otro 30 s.
    3. Vierta la mezcla en pocillos o platos de Petri para hacer finas (0.1-1 mm) las losas de la mezcla.
    4. Degas las losas por 10 min, colocando en una cámara de presión de aire muy negativo, entonces lugar en un horno previamente calentado a 80 ° C durante 30-60 minutos sacar del horno y dejaron enfriar.
    5. Retire la placa de refrescado polímero de su envase. Recortar los bordes para dejar una losa plana y uniforme. Medir el espesor de la losa utilizando pinzas.
  4. Medir la transmitancia (T) y reflectancia (R) de slab(s) través de una. Instrucciones y detalles adicionales pueden encontrarse en el manual de duplicación adición inversa (IAD)37.
    1. Encienda la fuente de luz y espectrómetro de la integración de la configuración de la esfera. Verifique la alineación del sistema para un pequeño, haz colimado se centra en los puertos de entrada y salida de la esfera integradora.
    2. Calibrar el sistema de esfera integradora.
      1. Apague la fuente, la tapa la abertura de salida de la esfera de integración y grabar tres espectros oscuros.
      2. Vuelva a encender la fuente para obtener la referencia de transmisión con el puerto de salida tope y el puerto de entrada vacíelo. Grabar tres espectros.
      3. Obtener mediciones de referencia de reflectancia usando estándares de reflectancia. Coloque cada estándar en el puerto de salida de la esfera. Grabar tres espectros para cada estándar de reflectancia.
    3. Medir la transmitancia de la losa. Con la tapa en el puerto de salida, coloque la placa en el puerto de entrada de la esfera integradora para medición de la transmisión. Grabar tres espectros.
    4. Medida de la reflectividad de la losa. Quite la tapa del puerto de salida y colocar la losa en el puerto de salida para la medición de reflectancia. Grabar tres espectros.
  5. Determinar propiedades ópticas utilizando el software de IAD. Un completo tutorial sobre el software puede encontrarse en el manual de dia con el software descargar37,38.
    1. Promedio de los tres espectros adquiridos para cada medición.
    2. Utilizando las ecuaciones en el manual del dia37, convertir estas medidas a valores de R y T. Si es necesario, condensar los archivos mediante la reducción de la tasa de muestreo a lo largo del espectro.
    3. Preparar el archivo de entrada .rxt (1 de Material suplementario) por dia con longitudes de onda, reflectancia, transmitancia y espesor de la muestra como se describe en el manual del dia37. Utilizando el símbolo del sistema (sistema operativo Windows) o terminal (Mac OS), desplácese hasta la ruta correcta. Tipo "iad ' entrada nombre de archivo'" al ejecutar dia. El software generará un archivo de texto de salida con las propiedades ópticas estimados.
  6. Si las propiedades ópticas no están dentro de un rango aceptable (~ 15%) de los valores deseados, modificar en consecuencia la receta y repita los pasos 1.3 – 1.5.

2. preparación de soluble 3D impreso estructura interna

  1. Estructura interna diseño mediante ordenador asistido por software de diseño (CAD). Convertir el modelo sólido de estructura a un archivo de la estereolitografía para la fabricación de una impresora 3D. Si disponible, una TC segmentada también se puede convertir en un archivo de la estereolitografía en lugar de dibujar un modelo sólido de la estructura interna.
    Nota: El archivo de CAD de la estructura de árbol fractal utilizada aquí se proporciona en 2 Material suplementario. La impresora utilizada en este trabajo es una impresora de extrudado, por lo que la parte fue diseñada para tener material de apoyo de ruptura.
  2. Seleccione un material soluble para la impresión, como el alcohol de polivinilo (PVA) o poliestireno de alto impacto (HIPS) (véase Tabla de materiales). Imprimir el modelo sólido en este material soluble.
  3. Cuando las partes impresas se enfrían suficientemente, romper, disolver o el material de apoyo de la parte impresa de la máquina. Archivo o la arena de cualquier imperfección grande.
  4. Vapor de pulir la parte impresa para reducir la aspereza superficial.
    1. Con la parte impresa en un tornillo de banco, perfore un agujero a través con espacio para un alambre fino de acero o de nitinol en la base de la pieza impresa.
    2. Hilo de acero inoxidable o alambre de nitinol a través del orificio. Doblar los extremos del cable y gancho juntos. Esto permitirá que la parte que se sumerge totalmente en vapor de acetona en el vaso. Conjunto alambre y parte a un lado.
    3. Llenar un vaso de precipitados grande aproximadamente 10% de acetona. Coloque el vaso en un plato caliente y calentamiento a 100 ° C. PRECAUCIÓN: Realice este paso en una campana de humos para evitar la inhalación de vapor de acetona.
    4. Cuando acetona vapor condensación alcanza sobre a medio camino encima de la pared del vaso, colgar el alambre enrollado con la vía aérea simulada en un segundo alambre y suspender en vapor de la acetona por 15 – 30 s. Asegúrese impreso piezas no toquen el vaso de paredes o cada otro (si vapor pulido varias piezas a la vez).
    5. Extraer parte impresa y suspender el vacío vaso de precipitados o recipiente. Deje que parte se seque durante al menos 4 h.
  5. Verificar que las dimensiones de la estructura interna están dentro de tolerancia para el diseño CAD, según sea necesario. Dependiendo de los requisitos de precisión, pinzas o un escáner láser 3D puede utilizarse para medir la estructura.

3. construcción de molde resistente al calor

Nota: Prepare un molde hermético, resistente al calor para formar el fantasma PDMS. Seleccione una geometría del molde para encajar el diseño final del fantasma. Aquí, se describe un molde rectangular reutilizable.

  1. Diseño de una base de modelo sólido del molde para impresión 3D. Este molde está diseñado para un fantasma con una base de 1,17 x 1,79 cm. La base del molde tiene un 1 mm de espesor y profunda hendidura de 5 mm con dimensiones internas que la base del fantasma. Esto permite que el molde a apartaderos para quitarse y el molde a desmontar y volver a utilizarse.
  2. Imprimir una base para el molde con un recuadro de anchura suficiente para garantizar los apartaderos del molde.
  3. Colocar vías en las hendiduras de la base del molde. Aquí, se utilizan hojas de gruesos del policarbonato de 1 mm como apartaderos del molde.
  4. Con cinta resistente al calor, sellar los bordes del molde. Es imperativo que todos los cantos y esquinas son suficientemente sellados con sin burbujas en la cinta para evitar cualquier fuga durante el proceso de moldeo.
  5. Coloque una placa de policarbonato base dentro del molde preparado en el paso 3.4. Esta placa base es la misma hoja de gruesos del policarbonato de 1 mm que el revestimiento del molde y da la base fantasma una superficie lisa sin la aspereza de la superficie impresa 3D de la base del molde. Pegue el vapor secado completamente pulido de la pieza a la placa base. Permitir tiempo suficiente para el pegamento se seque.

4. fabricación de polímero fantasma

Nota: Use la receta comprobada para el material a granel de matriz determinada en el paso 1 para la aplicación específica. El protocolo aquí proporciona los pasos para un tejido sano pulmón murino fantasma a 535 nm μs' de 40 cm-1 y μuna de 2 cm-1. Puede ser útil para la fabricación de un segundo fantasma sin partículas óptico para usar como referencia en el proceso de fabricación.

  1. Vierta 9,1 g de resina PDMS en una taza mezcla plástica. Añadir 20 mg de Rutilo TiO2, seguido de 35 μl de tinta de la India. Por último Añadir 0,91 g de agente a la parte superior de la mezcla de endurecedor. Seguir el protocolo mezcla en paso 1.3.2.
  2. Vierta la mezcla final del polímero en el molde resistente al calor.
  3. Vierta una pequeña cantidad de la mezcla en un recipiente separado para crear una losa de polímero para la confirmación de las propiedades ópticas del material. Asegurar que suficiente polímero se vierte para tener una losa de por lo menos 100 μm de grosor.
  4. Coloque el molde de simulacro en las vías respiratorias y la losa separada en una campana de cristal para la desgasificación. Comenzar el proceso de vacío. Si el polímero en el molde de falsa vía aérea comienza a subir, deje que el aire en la campana de cristal a las burbujas de la superficie, entonces comience a tirar otra vez de aire. Repita este proceso hasta que el polímero no aumenta significativamente. Esto le llevará entre 5-10 minutos dependiendo de cuánto aire atrapado en el paso 4.2. Una vez que el PDMS ya no se levanta, continúan degas para otros 15 minutos.
  5. Después de la desgasificación, lentamente deje que el aire hacia la cámara. Eliminar la falsa vía aérea fantasma y la losa de polímero y colocar en horno a 80 ° C por 2 h de nivel.
  6. Sacar el fantasma y la placa del horno y deje enfriar por 20 minutos a desmontar el molde de polímero con un bisturí sin cortar el polímero curado. Encaje la placa base fuera de la base de la mofa de las vías respiratorias.
  7. Coloque fantasma en un baño de base caliente (60 ° C) ~0.5 M hidróxido de sodio (NaOH) hasta que la parte interna se haya disuelto completamente. Un fantasma ópticamente clara referencia puede ayudar a determinar el tiempo de disolución de los componentes internos. Una vez que se disuelve la estructura interna, tomar fantasma fuera de la bañera y deje que se seque completamente (~ 24 h) antes de tomar cualquier medidas ópticas.

5. verificación de la fabricación fantasma

  1. Verificar geometría fantasma mediante imágenes por resonancia magnética de alta resolución (MRI) o proyección de imagen de tomografía micro computada (CT), si lo desea. Estos métodos proporcionan una verificación 3D de estructuras internas en material turbio con resoluciones axiales de < 400 μm39,40. Alternativamente, un fantasma ópticamente clara referencia puede ser ópticamente reflejada para la verificación de que la parte impresa se haya disuelto completamente y el vacío restante es la geometría correcta.
    Nota: Hemos verificado la geometría interna de un fantasma ópticamente opaco (2 mg de TiO2 + 3.5 μl de tinta de la India) con micro-CT en una estrella del norte la proyección de imagen (NSI) X50. El fantasma era reflejado con 20 μm de resolución en todas las dimensiones (complementaria de materiales de 3, 4).
  2. Verificar propiedades ópticas del fantasma usando la placa de polímero y la esfera integradora (descrito en pasos 1.5 – 1.6).

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Resultados

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Para demostrar la técnica de fabricación de fantasma, fantasmas de tejido de pulmón de ratón fueron fabricados para simular medidas propiedades ópticas del tejido suprimido pulmones murinos sanos e inflamados en 535 nm (tabla 5). Esta longitud de onda de interés es la longitud de onda de excitación de tdTomato proteína fluorescente utilizada en cepas recombinantes de reportero de micobacterias en anteriores estudios33. Mediciones ópticas de tejido ...

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Discusión

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Hemos demostrado un método para crear fantasmas ópticos para representar un pulmón murino con una estructura de ramificación interna para simular la interfaz de aire-tejido interno. Las propiedades ópticas del tejido pulmonar murino se logran mediante la incorporación de concentración única de ópticamente dispersando y absorbiendo partículas distribuidas homogéneamente en el polímero de matriz a granel. Estas propiedades ópticas pueden ajustarse para imitar los valores fisiológicos dentro de diversas gamas espectrales de...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la carrera de la Fundación de ciencia nacional premio no. CBET-1254767 y el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas subsidio no. AI104960 R01. Agradecemos a Patrick Griffin y Dan Tran su asistencia con las mediciones de caracterización y la Texas A & M Laboratorio de patología Cardiovascular para micro-CT en la proyección de imagen.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dow Corning Sylgard 184 Encapsulante de Silicona Transparente 0.5 kg KitAdhesivos Ellsworth184 SIL ELAST 0.5KGPolidimetilsiloxano: base polimérica para maniquíes ópticos
Polvo de dióxido de titanio rutilo blancoAtlantic Equipment EngineersTI-602Partículas dispersas para maniquíes ópticos
Pluma estilográfica Higgins Tinta chinaMichaels Craft Stores  10015483Partículas absorbentes para maniquí óptico
Cinta resistente al calorUlineS-7595Cinta resistente al calor para moldes de polímero
Impresora 3D Fortus 360mcStratasysN/ACapaz de cambiar el material de construcción y soporte con este modelo de impresora
ABS Ivory Material del modeloStratasysSDS-000001Material para imprimir piezas de moldes y/o utilizarlo como soporte para imprimir estructura interna 
SR-30 Soporte solubleStratasys400638-0001Base material de soporte soluble para impresión de estructura interna
Flacktek SpeedmixerFlacktek Inc.DAC 150.1 FVPara una mezcla eficiente de polímeros y partículas 
Esfera integradoraEdmund Optics58-585Para medir las propiedades ópticas
Placas de construcción de policarbonato (1 mm)StratasysN/ATambién se pueden utilizar placas de construcción de policarbonato usadas de la impresora Stratasys

Referencias

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