Artículo de método

Evaluación de la citotóxica y efectos inmunomoduladores de sustancias en lonchas de pulmón humano de precisión de corte

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DOI:

10.3791/57042

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9 de mayo de 2018

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1Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine (ITEM), German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), Member of REBIRTH Cluster of Excellence, 2Institute for Pathology, Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 3Division of Thoracic and Vascular Surgery, Klinikum Region Hannover (KRH), 4Department of Cardiothoracic, Transplantation and Vascular Surgery (HTTG), Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 5Institute of Pharmacology and Toxicology, RWTH Aachen University, 6Institute for Immunology, Hannover Medical School

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Teniendo en cuenta el principio 3R, están evolucionando los modelos respiratorios como alternativas a los estudios en animales. Especialmente para la evaluación del riesgo de las sustancias respiratorias, existe una falta de ensayos adecuados. Aquí, describimos el uso de cortes de pulmón humano de precisión de corte para la evaluación de sustancias aerotransportadas.

Resumen

Enfermedades respiratorias en su amplia diversidad necesitan sistemas de modelo adecuado para entender los mecanismos subyacentes y permitir el desarrollo de nuevas terapias. Además, registro de nuevas sustancias requiere una evaluación apropiada del riesgo con sistemas de prueba adecuados para evitar el riesgo de los individuos siendo perjudicados, por ejemplo, en el ambiente de trabajo. Esas evaluaciones del riesgo se llevan a cabo generalmente en estudios con animales. Teniendo en cuenta el principio de 3Rs y el escepticismo público contra los experimentos con animales, humanos métodos alternativos, como lonchas de pulmón de precisión de corte (PCLS), han ido evolucionando. El presente trabajo describe la técnica ex vivo de PCLS humana para estudiar el potencial inmunomodulador de sustancias de bajo peso molecular, como el hexachloroplatinate del amonio (HClPt). Puntos finales medidos incluyen viabilidad y local inflamación respiratoria, caracterizada por la secreción alterada de citoquinas y quimioquinas. Citoquinas proinflamatorias, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la interleuquina 1 alfa (IL-1α) se incrementaron significativamente en PCLS humana después de la exposición a una concentración del tóxica de HClPt. Aunque la técnica del PCLS se ha optimizado considerablemente en las últimas décadas, su aplicabilidad para la prueba de inmunomodulación está todavía en desarrollo. Por lo tanto, los resultados aquí presentados son preliminares, a pesar de mostrar el potencial del PCLS humano como una valiosa herramienta en la investigación respiratoria.

Introducción

Enfermedades respiratorias tales como asma alérgica, asma ocupacional, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema y las infecciones de las vías respiratorias superiores e inferiores están en aumento y representan una carga de salud en todo el mundo1,2. Sistemas de prueba adecuados se requiere, con el fin de identificar algunos de los mecanismos básicos subyacentes a estas enfermedades, además del desarrollo y la prueba de sustancias apropiadas. Investigación básica y desarrollo preclínico de fármacos se centra en resultados en pruebas en vitro o en vivo . Estos ensayos, sin embargo, tienen sus limitaciones3. En primer lugar, en vitro ensayos utilizan células humanas que fueron aisladas y extraídas de tejidos adyacentes u órganos y por lo tanto ya no son capaces de interactuar con o ser protegidos por otras células3. En segundo lugar, los modelos animales a menudo no son traducibles a los seres humanos debido a diferencias en la fisiología y bioquímica divergencias4. Para minimizar estas limitaciones y en el contexto de las 3Rs (reemplazo, reducción y refinamiento) el principio5, nuevos modelos alternativos están en constante evolución.

Modelos de tejido 3D humano alternativo, como PCLS, son un enlace entre basado en humanos en vitro y modelos complejos animales en vivo . PCLS reflejan la heterogeneidad funcional con todos los tipos de células relevantes presentes en el tracto respiratorio6. Además, la técnica PCLS tiene la ventaja de la preparación reproducible de varias láminas de espesor exacto de un donante único tejido animal o humano. Esto permite un control interno, así como diferentes concentraciones o drogas para probar.

Desde la primera introducción de lonchas de pulmón humano lleno de agar en 1994 por Fisher et al. 7 la técnica de corte y cultivo de tejido pulmonar ha mejorado sustancialmente. Christian Martin et al. han mejorado esta técnica para más aplicaciones químicas y farmacológicas8. Nuestro grupo fue introducido a esta técnica por Christian Martin en 2007. Desde entonces, ha ampliado la aplicación de PCLS en la investigación de las pruebas de respuestas funcionales, tales como vía aérea9,10 y vasoconstricción11, a inmunológicas, farmacológicas12,13, y toxicológicas7 pruebas en diversas especies en varios laboratorios. Por ejemplo, Schlepütz et al. 14 investigó las respuestas de las vías respiratorias para las diferencias de especies y en comparación con la activación de la neurona periférica estimulación de campo eléctrico (EFS) o capsaicina en ratones, ratas, cuyes, ovejas, monos tití y los seres humanos. Encontraron varias especies a diferentes pero diferentes patrones de broncoconstricción mediada por el nervio y llegó a la conclusión que los animales de laboratorio utilizados (ratones y ratas) no siempre refleja la respuesta humana. Para las pruebas de toxicidad pulmonar y reducir el número de animales en este contexto, Hess et al. 15 previamente validado rata PCLS como alternativa ex vivo para estudios de toxicidad de inhalación. Este estudio multicéntrico de pre-validación dio lugar al desarrollo de dos modelos de predicción mediante PCLS con resultados prometedores.

Por otra parte, en la investigación básica, PCLS han utilizado para aclarar calcio señalización16, de las respuestas alérgicas tempranos17e infección viral respuestas18,19. Progreso técnico está en curso y se están estudiando nuevos avances. Por ejemplo, el campo está aumentando el beneficio de tejido humano por el almacenamiento y reutilización de tejido congelado. Rosner et al describieron una técnica de congelación y descongelación PCLS murino que conserva la capacidad de las vías respiratorias de contrato sobre el estímulo: por lo tanto, la técnica prolonga la ventana de tiempo limitado dentro del cual los tejidos permanecen viables y por lo tanto más análisis se pueden aplicar en el tiempo al mismo donante20. Además de estos avances de la investigación, Lauenstein et al. 21 recientemente investigaron la evaluación de riesgos de productos químicos diversos que pueden actuar como activadores potenciales de asma ocupacional en humanos PCLS.

Asma ocupacional, cuyos síntomas son la obstrucción del flujo de aire y el hyperresponsiveness de la vía aérea, similar al asma alérgico, es inducida por exposición a alto peso molecular (HMW)22 o de bajo peso molecular (LMW) sustancias23 (p. ej. , compuestos de platino) en el ambiente de trabajo. Agentes LMW tienen una alto potencial de sensibilización al formar haptenos y enlazar a portador proteínas21. Registro de nuevos productos químicos de APM o BPM requiere evaluación del riesgo in vitro e in vivo con respecto a su supuesta potencial de sensibilización (e.g., OCDE directriz 429)24. Las pruebas utilizadas para determinar la supuesta sensibilización potencial, sin embargo, originalmente no fueron diseñadas para la evaluación del riesgo de sensibilizadores respiratorios, sino por sensibilizadores de contacto, aunque parece haber cierta congruencia para un pequeño subconjunto de sustancias25 . La obra de Lauenstein et al. fue diseñada como parte del Unión Europea proyecto Sens-ti-iv, para desarrollar estrategias alternativas de pruebas para evaluar los riesgos de contacto supuesta o pulmón sensibilizadores21. Para este proyecto, nos enfocamos en la prueba de la usabilidad de PCLS humana como una herramienta de prueba alternativa. Por lo tanto, un conjunto de inmunomoduladores extremos (por ejemplo, la viabilidad y citoquinas secreción) fue seleccionado para determinar el potencial irritativo o inflamatorio de los productos químicos, tales como los compuestos de platino de LMW. Lauenstein et al no encontraron ningún patrón general que podría aplicarse a los sensibilizantes respiratorios; sin embargo, su trabajo proporcionó la Fundación para protocolos recientemente publicado26.

En Resumen, el protocolo que presentamos para la preparación y posterior exposición de PCLS humana proporciona un método útil para la evaluación del potencial tóxico del pulmón o sustancias inmunomoduladoras que podrían estar involucradas en el desarrollo de vías respiratorias enfermedades, como asma ocupacional.

Protocolo

Experimentos con humanos PCLS se efectuarán según El código de ética de la Asociación Médica Mundial , aprobados por el Comité de ética local (los experimentos PCLS ejemplares se muestra a continuación fueron aprobados por el Comité de ética local de la Hannover La escuela de medicina; número 2701-2015). Consentimiento informado para el uso de material de pulmón humano se requiere de todos los pacientes donantes o sus familiares. Los resultados descritos en este manuscrito se obtuvieron con las rebanadas de tejido de donantes de diferentes edades, géneros, historia clínica y causa de la resección, aunque la mayoría de los tejidos recibidos fue de pacientes que sufren de cáncer de pulmón. Solamente libres de tumor tejido fue utilizado para los experimentos.

1. general preparación de PCLS humana y posterior exposición a productos químicos

Nota: Se requieren dos personas para llenar un pulmón. Se recomienda un registro de vacunación actualizado para hepatitis A y B. Pacientes son evaluados rutinariamente para VIH y VHC antes del trasplante del pulmón. Si una infección con Mycobacterium tuberculosis activa es diagnosticada o sospechada, el pulmón debe ser rechazado. Sin embargo, todos los tejido pulmonar humano fresco y muestras derivadas de ella deben tratarse como potencialmente infecciosas y correspondientes medidas de protección deben tomarse (máscaras de filtro de partículas (FFP2), gafas protectoras, guantes) para garantizar la seguridad de la personal. El procedimiento dura 60-90 min.

  1. Confirmar la integridad del lóbulo de pulmón humano.
    Nota: Un desgarro en la pleura evita el llenado homogéneo de los tejidos. Material de pulmón humano debe ser desde el día de la resección. Períodos de almacenamiento de aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente (RT) antes de llenar con agarosa sobre hielo son tolerados. El tejido que utilizamos en este protocolo se obtiene de pacientes sometidos a resección. No es de pacientes fallecidos. Si el tejido se ha almacenado en hielo, caliente previamente a RT antes de llenarlo, de lo contrario la agarosa se polimerizará inmediatamente y no llenado homogéneo será posible.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de que todas las personas en contacto con el material humano nativo ponen ropa protectora que consiste en una bata, dos pares de guantes, gorro, mascarilla y un par de gafas de seguridad. Material humano es potencialmente infecciosa.
  2. Pesa 7,5 g de agarosa baja gelificante y añadir a 250 mL de agua bidestilada. Hervir la agarosa en un microondas hasta que la agarosa se disuelva. Enfriar a 40 ° C aproximadamente, dependiendo del punto de fusión y gelificación de la agarosa.
    Nota: Varios frascos son necesarios, dependiendo del tamaño del lóbulo.
  3. Precalentar y mantener el medio de cultivo (Tabla de materiales) a 37 ° C.
    Nota: Si la agarosa está demasiado caliente, vitaminas en el medio de cultivo pierde eficacia y se dañarán las células. Si la temperatura de la solución de agarosa/medio está por debajo de 37 ° C, el proceso de gelificación comenzará y dañar relleno homogéneo del pulmón. Se recomienda sólo un rango de temperatura de 37 ° C a 39 ° C.
  4. Coloque todos los materiales a su alcance antes de empezar: 5-10 abrazaderas, catéter flexible de aproximadamente 1 m de longitud, una jeringuilla adecuada (p. ej., 50 mL) montaje de la conexión para el catéter y una nevera llena de hielo.
  5. Canule el bronquio tráquea Meno insertando el tubo de silicona y fijación con una grapa orientado paralelo al tubo, para que la pinza aprieta el tejido juntos junto con el tubo de silicona sin pellizcar apagado. Verifique que el tubo de silicona es fijado dentro y no resbale hacia fuera durante el procedimiento de llenado. Cerrar todos los otros bronquios, vasos sanguíneos y lesiones con abrazaderas, de manera que no agarosa puede escaparse hacia fuera durante el procedimiento de llenado.
  6. Mezclar un volumen equivalente de agarosa de gelificación baja de 3% con medio de cultivo en un vaso de precipitados. Infundir la mezcla en el pulmón mediante una jeringa de 50 mL. Antes de volver a llenar la jeringa con medio, abrazadera de cierre la sonda con los dedos o una pinza para evitar burbujas de aire y el reflujo de la agarosa. Llenar el lóbulo del pulmón hasta que está completamente inflada. Toque con cuidado la pleura del pulmón del lado; la pleura debe ser uniforme y duro.
    Nota: Dependiendo del tamaño del lóbulo del pulmón, hasta 2 o 3 L de solución de agarosa/media puede requerir.
  7. Repita los pasos 1.5-1.6 para cada bronquio en el caso de varios bronquios dentro de una sola muestra.
  8. Puesto el pulmón en el hielo para la polimerización de la agarosa gelificarse durante 20-40 min, dependiendo de la cantidad de agarosa inculcada. Toque con cuidado la pleura en varios lados para ver si es dura y fría, indicando que la polimerización es completa, de lo contrario siguen esperando. Deje que los patólogos se cortar el pulmón, tomar sus muestras y almacenar el material de pulmón en el hielo para el transporte.
  9. Cortar el tejido de pulmón humano en losas de 3-5 cm con un cuchillo afilado.
    Nota: Use una cuchilla nueva para cada pulmón para asegurar la nitidez.
  10. Llene la máquina de cortar tejido con solución salina balanceada de Earle helada 400 mL (EBSS). Inmediatamente cortar núcleos de tejido cilíndrico de las losas de pulmón con un destornillador semiautomático con una herramienta de perforación del diámetro recomendado: (p. ej., 8 mm, 10 mm).
    Nota: Este diámetro debe ser equivalente al diámetro del soporte del tejido dentro de la máquina.
  11. Ajuste el grosor de las lonchas de pulmón en el valor del espesor deseado.
    Nota: Aproximadamente 250 μm de espesor se utiliza comúnmente en experimentos PCLS. El fabricante de la máquina de cortar tejido recomienda su medidor de espesor de rebanada de tejido para la verificación del espesor de rebanada. Alternativamente, puede utilizarse tinción combinada con microscopía confocal de montaje conjunto para determinar el grosor de corte según lo descrito por Brismar et al. 27
  12. Transferencia de los núcleos de tejido en el soporte de tejido de la máquina de cortar tejido. Poner el peso (parte del portapapel higiénico) sobre la base del tejido. Establece la velocidad del brazo y la velocidad de la hoja en 6 en la máquina de cortar tejido. Empezar a cortar la base del tejido en PCLS.
  13. Completar a 500 mL de comercialmente disponibles de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM): mezcla de nutrientes F-12 DMEM/F12 (1:1) con 5 mL de la penicilina (10.000 unidades/mL) y estreptomicina (10.000 μg/mL). Almacenar el medio de cultivo durante varios días en condiciones estériles en un refrigerador. Caliente previamente solamente el volumen requerido de medio.
    Nota: Penicilina se inactiva si se mantiene a 37 ° C por períodos más largos. Utilizar medio de cultivo libre de suero y sin teñir, como composición del suero varía de lote a lote y colorantes como el rojo de fenol, pueden interferir con los ensayos.
  14. Llenar un plato de Petri (100 x 15 mm) con medio de cultivo helada de 25 mL. Medio debe vaciarse de la cortadora de tejido en un vaso de precipitados con la apertura de la abrazadera del cilindro de vidrio. Transferir las rebanadas de un vaso de precipitados en la caja Petri con medio de cultivo utilizando un aplicador (por ejemplo, asa de inoculación). Coloque la placa de Petri en una incubadora (37 ° C, 5% CO2, 100% de humedad). Permitir que el medio a calentar antes de pasos de lavado.
    Nota: Los pasos se realizan en condiciones estériles.
  15. Coloque un colador celular en la caja Petri para lavar la PCLS. Completamente eliminar el medio de cultivo con una pipeta serológica de 10 mL a través de la coladera de la célula y añadir 25 mL de medio fresco precalentado de 37 ° C. Repetir este paso 3 - 4 veces cada 30 minutos.
    Nota: El colador de la célula impide que las rebanadas se aspira con la pipeta, para evitar daños a las rebanadas.
  16. Transferir las lonchas de pulmón cuidadosamente a una placa de 24 pocillos cultura con un mínimo de 500 μl de medio de cultivo para dos rebanadas por pozo. Exponer el tejido pulmonar a sustancias (véanse los pasos 3.1-3.4), p. ej., para 24 h a 37 ° C, 5% CO2.
    Nota: Para la transferencia, preferiblemente utilizar un asa de inoculación y deje que el flotador de rebanadas en el bucle para prevenir daño a los tejidos. No más separación de las láminas es necesario, como sólo la escasez de suficiente medio fresco se induce la muerte celular en rebanadas del tejido. Rebanadas pueden superponerse o toquen en el pozo: esto no tiene ninguna influencia sobre la viabilidad del tejido.
  17. Poner todo el material residual de humano en un frasco de plástico con un fijador (p. ej., formaldehído al 10% tamponado) durante al menos 24 h y arder esto en el proceso de eliminación.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico, realizar este paso debajo de una campana.

2. histológico análisis de PCLS

  1. Preparar casetes de biopsia con dos esponjas empapadas en fijador (e.g., 4% tamponada formaldehído). Lugar las PCLS entre las almohadillas de espuma en el cassette de biopsia e inmediatamente transferir el tejido en solución fijadora. Fijar el tejido durante la noche en el 4% había tamponada formaldehído.
  2. Procesamiento del tejido para parafina inclusión por deshidratación de las muestras en etanol (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%) durante 1 hora cada uno, seguido de lavados en xileno (3 x 1 h) y parafina líquida (3 x 1 h) según protocolos estándar de la histopatología.
  3. Transferir la PCLS en un molde de incrustación. Uso de un asa de inoculación. Incrustar el tejido PCLS en parafina líquida. Asegúrese de colocar el tejido uniformemente en el molde cuando el bloque de parafina.
  4. Corte el bloque de tejido que contiene la PCLS con un micrótomo rotatorio hasta que tenga una superficie plana y uniforme. Tomar secciones seriadas del espesor deseado (por ej., 4 μm), colocarlos individualmente en numerada consecutivamente portaobjetos recubiertos (generalmente 25-30 secciones pueden tomarse) hasta la PCLS todo ha sido procesada.
  5. Mancha de portaobjetos de vidrio individuales (cada 8-10 secciones) con tinción de hematoxilina y eosina (H & E) para la orientación. Seleccione las secciones para el experimento basado en las guías de orientación (las primeras y la últimas 8 secciones son generalmente incompletas).
    Nota: (Opcional) para un almacenamiento prolongado, diapositivas se pueden sumergir en parafina líquida para la preservación.

3. preparación de soluciones para las sustancias

Nota: Preparar soluciones de trabajo y control inmediatamente antes de su uso.

PRECAUCIÓN: Manipule sustancias según las instrucciones de seguridad o, si es desconocido, como potencialmente dañinos y las precauciones de seguridad.

  1. Disolver sustancias solubles en agua directamente en el medio de cultivo. Productos químicos insolubles o poco solubles, en primer lugar disolver la sustancia en los solventes apropiados dependiendo de la solubilidad de la sustancia. Las sustancias con solubilidad de agua limitado (< 0.1 mg/mL) se puede disolver, por ejemplo, en DMSO o etanol. Concentraciones de solvente no tóxico deben determinarse por titulación previamente. Asegúrese de que las sustancias no precipitan de la solución cuando se diluye en medio.
    Nota: HClPt Sodio Lauril sulfato (SLS) soluciones están preparadas.
  2. Sustancia de preparar soluciones madre en 100-fold de la concentración más alta en el medio de cultivo o solvente. Pesan 12,5 mg HClPt y 34,4 mg SLS y prepare soluciones disolviendo los productos químicos en el medio de cultivo de 1 mL.
    Nota: No es necesario para estos productos químicos.
  3. Preparar una dilución final de 1: 100 en precalentado. En caso de uso previo de solvente, este enfoque da lugar a la misma concentración de solvente final para todas las concentraciones de la sustancia.
  4. Utilizar la concentración de solvente final (por ejemplo, 1% como se describe en el paso 3.3) para el tratamiento de referencia de PCLS. Ningún control solvente fue requerido para los productos químicos mencionados en la sección de resultados.

4. referencias positivas y negativas para los ensayos de citotoxicidad

  1. Para todos los ensayos de viabilidad, preparar los siguientes controles positivos y negativos:
    1. Control de tejido: incubar PCLS en medio de cultivo sólo como una referencia para PCLS sin tratar durante 24 h en condiciones de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2, 100% de humedad).
    2. Control del vehículo (si es necesario): incubar PCLS con la concentración de solvente final como referencia para PCLS tratados con vehículo solamente (vea el paso 3.4) durante 24 h en condiciones de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2, 100% de humedad).
    3. Control positivo: incubar PCLS con detergente al 1% en tampón durante 1 h a 4 ° C.
      Nota: Si PCLS queda descoloridos, el tejido está muerto. Total L-lactato deshidrogenasa (LDH) se determinó en el sobrenadante, con una absorción de aproximadamente 1.9-2.3 (ver pasos 6.1-6.4). El tejido se utiliza para el ensayo WST-1 (ver pasos 5.1-5.5), con una absorción de aproximadamente 0.

5. medición de la citotoxicidad inducida químicamente en PCLS humana por ensayo WST-1

Nota: El ensayo WST-1 se realiza en una placa de 24 pocillos con dos PCLS por pozo. Preferiblemente, usar duplicados para cada parámetro y los resultados de estos duplicados de la piscina después de la medida.

  1. Preparar la solución de trabajo diluyendo el reactivo WST-1 en medio inmediatamente antes de comenzar. La cantidad necesaria de solución de trabajo es 250 μL/pocillo de una placa de 24 pocillos. Por lo tanto, mezclar 25 μl del reactivo con 225 μL de medio de cultivo para un pozo.
  2. Después de la incubación del PCLS paso 1.16, desechar o utilizar el sobrenadante para citoquinas medidas u otras pruebas como el análisis LDH. El tejido restante se utiliza para el siguiente paso.
  3. Pipetear 250 μl de la concentración de trabajo del reactivo WST-1 por bien e incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO2 por 1 h. Asegúrese de que la PCLS están completamente cubiertas por el reactivo WST-1 durante la incubación.
  4. Colocar la placa sobre un agitador orbital (200 rpm) y agitar cuidadosamente durante 30 s para asegurar una mezcla completa del reactivo WST-1. Tomar una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano y Pipetee 100 μl de duplicados a partir del sobrenadante de cada pozo de la placa de 24 pocillos.
  5. Medir la absorción de cada pocillo a 450 nm (referencia: 630 nm) usando un lector de microplacas. Restar la absorción a 630 nm de 450 nm. Estos valores se utilizarán para el cálculo en el paso 5.6).
    Nota: Datos confiables para la evaluación de la citotoxicidad pueden obtenerse solamente de tejido viable. Por lo tanto, estos criterios de aceptación publicados por Hess et al. 15 deberá cumplirse en cada experimento. Si no se cumplen estos criterios, se debe repetir el experimento.
  6. Absorción del medio control sin tratar debe estar por encima de 0.6, de lo contrario que se debe repetir el experimento. Si los datos cumplen este requisito, establezca el valor de absorción del tejido control a 100% y calcular la WST-1 reducción de las muestras tratadas en relación con el control del tejido.

6. LDH ensayo

Nota: El ensayo LDH se realiza en una placa de 96 pocillos con 100 cultura de μl de sobrenadante en total después de la incubación posterior.

  1. Después de la incubación de la PCLS con o sin los agentes de prueba, tomar 50 μl de sobrenadante del paso 1.16 y transferir por duplicado en una nueva placa de 96 pocillos. Esto genera duplicados de cada tratado de una placa de 24 pozos.
  2. Preparar la solución de trabajo reactivo LDH inmediatamente antes del ensayo. La solución consiste en la solución de catalizador (liofilizado disuelto en 1 mL de agua bidestilada) y solución suministrada por el fabricante del tinte. Para una placa de 96 pocillos, mezclar bien 125 μl de solución de catalizador con 6,25 mL de solución de tinte.
    PRECAUCIÓN: No exponga la solución para la luz.
  3. Extraiga con pipeta 50 μl de la solución de trabajo en cada uno bueno ya que contiene 50 μl del sobrenadante e Incube la placa por 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. No es necesario.
  4. Medir la absorción de cada pozo a 492 nm (referencia: 630 nm) usando un lector de microplacas. Restar la absorción a 630 nm de 492 nm. Estos valores se utilizarán para el cálculo en el paso 6.5.
    Nota: Datos confiables para la evaluación de la citotoxicidad pueden obtenerse solamente de tejido viable. Absorción del control tratados con detergente debe ser más de 1.
  5. Para el análisis, establecer el valor de absorción del control positivo del paso 4.1% 100 y calcular la liberación LDH en muestras tratadas en relación con el control positivo (es decir, máxima liberación LDH).

7. microscópico análisis de viabilidad con microscopio de escaneo de láser Confocal (cLSM)

Nota: Para el análisis de viabilidad microscópico, dos de los PCLS normal de 250 μm de espesor se tiñen en 250 μL/pocillo de una placa de 24 pocillos. Como cada rebanada se desliza por separado, duplicados más no se requieren.

  1. Después de la incubación del PCLS con o sin elementos de prueba, eliminar el sobrenadante o utilizar para mediciones de citoquinas u otras pruebas como el análisis LDH. Utilice el tejido restante para el procedimiento descrito aquí.
  2. Preparar la dilución de trabajo del homodímero calceína-AM y etidio 1 (EthD-1) con una concentración de trabajo de ambos reactivos de 4 μm en medio de cultivo. Para ello, añadir 1 μl de calceína-AM (4 mM) y 2 μl de EthD-1 (2 mM) a 997 μl de medio de cultivo. Este volumen es necesaria a la mancha de 4 pozos con dos PCLS.
    Nota: Evite la exposición de los reactivos a la luz.
  3. Pipetear 250 μl de la dilución de trabajo en cada bien e incubar la placa de 24 pocillos por 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Colocar la placa sobre un agitador orbital a 150 rpm durante la incubación para asegurar la mejor exposición del tejido a la solución de tinción.
  4. Después de 45 minutos, eliminar la solución de tinción y lavar la PCLS con 1 mL de solución tampón a través de la agitación a 150 rpm durante 3-5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Repita este paso dos veces.
  5. Aplicar 500 μl de solución tampón a cada pocillo que contenga la PCLS manchado para evitar la autofluorescencia de medio de cultivo. Para la evaluación microscópica, realizar al menos dos pilas aleatoriamente distribuidas de z con un cLSM.
  6. Haga clic en la pestaña Ocular para elegir 10 X / 0.3 objetivo y haga clic en línea con el cLSM como un microscopio de luz estándar para encontrar la superficie del PCLS. Haga clic en Offline para salir de la posición ocular.
  7. Haga clic en la ficha de adquisición y encienda el láser adecuado para los fluoróforos.
    Nota: Se utilizó un láser de argón con una longitud de onda de 488 nm para la celulosa de polyanionic tinte calceína (longitud de onda de excitación de 495 nm) y un láser de HeNe con una longitud de onda de 543 nm para la detección del complejo ADN EthD-1 (longitud de onda de excitación de 533 nm). El láser de argón debe ejecutar generalmente en 30-50% de la corriente máxima para permitir una corriente de tubo de alrededor de 5,7 A, ya que esto prolonga la vida útil del láser significativamente.
  8. Haga clic en Ruta de la luz en la ficha de adquisición y establecer los filtros necesarios y espejos para el experimento.
    Nota: En el presente estudio, un sistema de filtro se utilizó con un divisor de viga principal dicroico (e.g., HFT 488/543) separando la luz de excitación y emisión. A través de un espejo que refleja que esta luz se dirige al divisor de haz dicroicos secundaria (p. ej., NFT 545) a más separadas la luz emitida por la muestra en dos canales.
  9. Configurar banda pasar filtros (p. ej., BP 505-530 para la señal de calceína y BP 560-615 para la señal compleja de ADN EthD-1) que transmiten sólo una cierta gama de longitudes de onda y asignan la calceína señal a canal 2 y la señal complejo de ADN EthD-1 canal 3.
  10. La casilla Z-pilas para establecer los límites superiores e inferiores para el volumen microscópico. Presione el botón directo para ver una vista en vivo de la capa correspondiente en la pantalla. Mover el enfoque hacia arriba o hacia abajo para encontrar la superficie de la PCLS con una señal fuerte.
  11. Haga clic en el apartado de canales y marque la casilla Mostrar todo. Bloquear la tabla pulsando en el botón del canal correspondiente debajo de la imagen en directo y activar el color del canal.
    Nota: En la imagen viva de un color azul indicará que no hay señal, mientras que una señal de alta aparecerá en blanco y una señal sobreexpuesta aparecerá en rojo.
  12. El poro del canal EthD-1 rojo 1 unidad aireado para el mejor compromiso entre la eficiencia de colección light y seccionamiento óptico y ajuste el canal de calceína en consecuencia. Aumentar la señal detectada de la ganancia que parece blanco pero no en rojo en la imagen en directo con la tabla de bloqueo de color canal activado.
    Nota: La ganancia principal no debe exceder de 600 unidades.
  13. Aumentar o disminuir el offset digital para ajustar el fondo que aparece en azul en la imagen en directo con la tabla de bloqueo de color canal activado.
  14. Haga clic en la ficha de Z-Stack en adquisición Multidimensional y utilizar el foco para cambiar a una capa z de interés. Pulsa el Primer Set para guardar esta posición para la adquisición de más adelante. Lentamente cambiar de puesto el foco hacia arriba o hacia abajo hasta una gama de 30 μm ha sido alcanzada y pulsa el Último Set para guardar.
  15. Haga clic en Live una vez más para desactivar la imagen en directo y pulse en Iniciar el experimento para iniciar la proyección de imagen.
    Nota: Tejido Viable se detecta por fluorescencia de la celulosa de polyanionic tinte calceína. Las células muertas son discriminadas por formación de complejos de ácidos nucleicos y EthD-1.

8. imagen representación

Nota: La recomendación de computadora del software de procesamiento de imagen debe tenerse en cuenta, ya que este programa requiere el hardware apropiado.

  1. Cargue el archivo LSM de viabilidad microscópica tinción de PCLS (ver sección 7) en el software de procesamiento de imagen. Guárdelo como archivo .ims antes de proceder. Establecer todos los parámetros en el control de tejido y aplicarlos a todas las imágenes. No se permiten más cambios.
  2. Utilice el botón de volumen para la reconstrucción de la superficie de tejido viable (tinción de calceína) (complementario de la figura 1A) y el botón de puntos de núcleos de células muertas (suplementario Figura 1 H). Al representar un canal, apagar el otro canal en la ventana de ajuste de pantalla.
  3. Comenzar por representar el volumen de tejido vital: el canal de la superficie, procesar toda la imagen, establecer el factor liso 0,5 μm y utilizar absoluta intensidad umbral (complementario de la figura 1B, C). Oprima la flecha azul hacia adelante.
  4. Ajustar el umbral de intensidad absoluta del volumen reconstruido; intensidad de ruido y el fondo debe restarse. Recubrimiento superficial se muestra en gris y el de cobertura de superficie debe ser revisado (suplementario Figura 1). Después de completar el ajuste, oprima la flecha azul hacia adelante. Mayoría de las veces este paso es necesario para el cálculo de los ajustes. Si el software no es capaz de calcular el volumen, aumentar el factor de liso.
  5. En el último paso, elija un filtro. Utilice el filtro de la esfericidad (con aproximadamente 10 μm) para la representación de superficie para filtrar los macrófagos en el espacio alveolar (suplementario Figura 1E). Pulse el botón delantero verde.
  6. Ópticamente, ajustar la imagen de salida y exportar estadísticas como archivos .xls. El volumen total (suma) se utilizará para su posterior análisis (suplementario Figura 1F, G). Guardar la configuración y uso para todos los otros análisis de z-pilas tomadas el mismo día con la misma configuración de cLSM (suplementario figura 1I).
  7. Reconstruir el canal rojo (manchas) de núcleos de células muertas. Al azar, medir el tamaño de punto en μm en la ventana de surpass; tamaño de punto es aproximadamente 5 μm. marca Enable y el tamaño de punto. Comprobar si están marcados todos los puntos y cada punto se cuenta sólo una vez. Corregir manualmente si es necesario (figura suplementaria 1B, H, J). Oprima la flecha azul hacia adelante.
  8. Presione el botón de avance verde dejar que el programa calcule/contar el número total de puntos de acuerdo a los parámetros establecido y exportar el resultado como archivo de .xls (Suplementario Figura 1 K, L, M). Para el análisis gráfico o estadístico de la imagen establecer el número de núcleos celulares muertos calculados en proporción al volumen de tejido vital.

9. medición de citoquinas y quimioquinas en humanos PCLS

Nota: La respuesta inmune citoquinas y quimioquinas pueden medirse extracellularly en el sobrenadante de cultivo e intracelularmente en lisados de tejidos después del tiempo de incubación. ELISA se mide en duplicados en una placa de 96 pocillos con 100 μL/pocillo.

  1. Preparar una solución de detergente de 1% mezclando 5 mL de detergente con 495 mL de solución tampón. La solución puede almacenarse a temperatura ambiente durante varios meses.
  2. Mezcle la solución detergente al 1% con inhibidor de la proteasa (PI) en una proporción de 1: 500. La cantidad requerida depende de la placa de cultivo; por ejemplo, utilizar 500 μL/pocillo de una placa de 24 pozos. Para un pocillo, mezclar 1 μl de PI con 499 μl de solución de detergente.
  3. Preparar tubos con 1 μl de solución de PI y recoger 500 μl del sobrenadante en estos tubos de cultivo. Reemplace inmediatamente el medio de la placa de 24 pocillos con solución de detergente 500 μl conteniendo PI como preparado en el paso 9.2. Lisar tejido para 1 h mediante la colocación de la placa de 24 pozos en 4 ° c. Pipeta el tejido lisado en un tubo nuevo y almacenar estos tubos a-80 ° C hasta su análisis posterior.
    Nota: El protocolo de ELISA altamente depende del fabricante y deben seguirse las instrucciones del fabricante. Un protocolo estándar de ELISA se describe en el siguiente.
  4. Realizar la prueba de ELISA para medir los niveles de citoquinas en el sobrenadante o lisado según las instrucciones del fabricante. Para medir la IL-1α y TNF-α, capa placa a96-bien por Pipetear 100 μl del anticuerpo de captura (para dilución seguir las instrucciones del fabricante) e incubar durante la noche a TA.
  5. Preparación buffer de lavado disolviendo una tableta de tampón de lavado en 1 L de agua bidestilada. Quitar el anticuerpo de captura y buffer de lavado pipetee 400 μL en cada pocillo. Reemplazar este volumen tres veces. Bloque de la placa mediante la adición de la solución de bloqueo (por ejemplo, BSA 1% en solución tampón, según las instrucciones del fabricante). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
    Nota: ELISA disponible comercialmente estándar requiere 2 x 100 μl del sobrenadante o lisado del tejido. Las muestras deben ser descongelado una vez y justo antes de su uso. Dependiendo de la sensibilidad del ensayo y de la citocina liberada, las muestras deben diluirse antes de las mediciones. Por lo tanto, diluir la muestra en el reactivo proporcionado por el análisis.
  6. Eliminar la solución de bloqueo y añadir las muestras diluidas para la curva estándar (para dilución seguir las instrucciones del fabricante) y 100 μl del sobrenadante de tejido o 100 μl del tejido lisado en duplicados en paso 9.3. Incubar por 2 h a TA.
  7. Retirar las muestras y el tampón de lavado pipetee 400 μL en cada pocillo. Reemplazar este volumen tres veces. Anticuerpo de detección de biotinilado Pipetee 100 μl (para dilución seguir las instrucciones del fabricante) e incubar por 2 h a TA.
  8. Quitar el anticuerpo y tampón de lavado pipetee 400 μL en cada pocillo. Reemplazar este volumen tres veces. Añadir 100 μL/pocillo de estreptavidina marcada con HRP (para dilución seguir las instrucciones del fabricante) e incubar por 20 min a temperatura ambiente (Compruebe las instrucciones del fabricante).
  9. Quitar estreptavidina y tampón de lavado pipetee 400 μL en cada pocillo. Reemplazar este volumen tres veces.
  10. Añada 100 μl del sustrato (recomendado por el fabricante) e incubar por 20 min en la oscuridad (Compruebe las instrucciones del fabricante).
    Nota: Este paso es sensible a la luz. Evitar la exposición a la luz de la placa y el sustrato.
  11. Detener la reacción agregando solución 50 μl (1 M de H2SO4). Medir la absorción de cada pocillo a 450 nm (referencia: 570 nm) usando un lector de microplacas. Restar la absorción a 570 nm de 450 nm.
    Nota: No se trata o controles de tejido del vehículo sirven como controles negativos. Para inducir una respuesta inmune en el tejido pulmonar, utilizar estimulación apropiada (e.g., 100 lipopolysaccharide ng/mL (LPS)) como control positivo. Incubar dos pozos con dos PLCS por pozo con 100 LPS de ng/mL medio de cultivo, por ejemplo, durante 24 h y recoger el sobrenadante y el tejido lisado como se describe en el paso 9.3.
    Nota: Los resultados de la medición son aceptados, si la absorción de más alto nivel es igual o superior a 1.0; de lo contrario la medida debe repetirse. La curva estándar debe seguir el ajuste de curvas sigmoidales dosis-respuesta.
  12. Se normalizan las concentraciones de citocinas (pg) determinadas por ELISA en paso 9.11 para el contenido de proteína total determinada en el lisado de cada muestra de tejido (véase sección 10).

10. medición del contenido de proteína Total en humanos PCLS

Nota: Las PCLS necesario para la lisis para medir concentración de proteínas totales. Los lisados de tejidos de paso 9.3 se utilizan para este paso. El ensayo se realiza en una placa plana de 96 pocillos con 25 μL/pocillo de tejido lisado, pipeta por duplicado.

  1. Preparar un estándar de BSA de 7 puntos con concentraciones de BSA de 2.000 μg/mL, 1.500 μg/mL, 1.000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL y 125 μg/mL. Aplicar 25 μl por duplicado para cada estándar y utilizar 25 μl tampón de solución como un espacio en blanco en una placa de 96 pocillos (utilice una placa con una cubierta de placa).
  2. Pipetear 25 μl de los lisados (ver paso 9.3) de cada pozo en duplicados en una placa de 96 pocillos. En total, 50 μl de cada uno así se requiere. Preparar el reactivo de trabajo de solución BCA BCA diluyendo el reactivo B 1:50 en reactivo BCA A. Para una placa de 96 pocillos use 400 μL del reactivo B y 20.000 μl de reactivo A.
  3. Cuidadosamente pipetee 200 μL de reactivo de trabajo en cada pozo, evitando burbujas de aire. Coloque la placa en un agitador orbital (150 rpm) durante 30 s para asegurar una mezcla adecuada de lisados y reactivo de trabajo y poner una tapa de la placa en la placa. Incubar la placa a 37 ° C por 30 min en la oscuridad. Medir la absorción de cada pozo en 540-590 nm utilizando un lector de microplacas.
    Nota: Los resultados de medición son aceptados, si la absorción del más alto estándar de BSA es igual o superior a 0,8; de lo contrario la medida debe repetirse. La curva estándar debe seguir el ajuste de curvas sigmoidales dosis-respuesta.
  4. Para el análisis, calcular la curva estándar utilizando una ecuación de Marquardt 4 parámetros después de restar el espacio en blanco. Usando la curva estándar de ajuste para calcular las concentraciones de proteínas de muestras desconocidas.

Resultados

Con el presente método de investigación, PCLS humanas fueron preparados y expuestos a cinco concentraciones de sustancias industriales evaluar efectos inmunomoduladores inducidos químicamente en material de pulmón humano. Tejido pulmonar fue expuesto bajo condiciones sumergidas como cultura permanente 24 h. toxicidad fue evaluada mediante la medición de LDH liberado, la actividad mitocondrial y viabilidad microscópica tinción. Además, se midieron contenidos de proteína total para normalización y citoquinas proinflamatorias. Siempre que sea posible, 75 valores de concentración inhibitoria (CI) fueron calculados por montaje no lineal curva sigmoidal. Las sustancias de referencia positivo, detergentes para LPS y la citotoxicidad de la respuesta innata del cytokine, fueron utilizadas para la validación de cada carrera. IC75 logarítmicamente transformados valores [μm] (log IC50) fueron utilizados como "irritantes" concentraciones para las medidas de liberación subsecuente del cytokine.

Figura 1 y figura 2 muestran el procedimiento de relleno material de pulmón humano y ejemplar H & E tinción de humano PCLS. Procedimientos rutinarios de higienicos que debe seguir para evitar efectos adversos sobre la salud y garantizar la seguridad del personal que maneja el pulmón humano material. La técnica requiere entrenamiento del personal y la práctica. Experimentados patólogos que distinguen diferentes regiones (lóbulos superior e inferior y subpleural versus más central) y enfermo versus áreas sanas son necesarias para evaluar el estado patológico del material de pulmón humano. La PCLS humano generado puede usarse para la preparación de H & secciones delgadas E teñido, que pueden ser nuevamente evaluadas por un patólogo. Este procedimiento ayuda a los usuarios obtener práctica en discriminantes distintas áreas enfermas y ubicaciones dentro de los pulmones.

Figura 3 presenta los resultados de la medición de actividad de la LDH y WST-1 en humanos PCLS después de 24 h de incubación con SLS. El tratamiento control medio sin SLS, en SLS, de 0 μg/mL es un importante control de calidad. Los valores deben estar por debajo de 20% para LDH en comparación con tejido lisis de detergente y > 0,7 unidades de absorbancia para el ensayo WST-1. Estos controles de calidad sirven también como indicadores de la viabilidad del tejido insuficiente. Capacidad de respuesta de los tejidos humanos hacia la solución de detergente, como una sustancia tóxica eficaz, debe ser incluida como control positivo. Debe resultar en un aumento de 300-500% (> 2,0 unidades de absorbancia) de la LDH en comparación con la toallita y en valores < 0,1 unidades de absorbancia para el ensayo WST-1. SLS produjo una reducción dosis dependiente de la viabilidad celular medida por un aumento de LDH y una disminución de la actividad metabólica en el ensayo WST-1 en concentraciones > 87 μg/mL. Un modelo de concentración respuesta sigmoidea se ajustó a los datos, por lo que es posible calcular valores IC75 o IC50. Estos valores pueden utilizarse posteriormente para seleccionar las concentraciones para los niveles de citoquinas y quimioquinas: en concentraciones altamente tóxicas, generalmente n o pueden detectarse sólo disminución de citoquinas y quimioquinas. Por lo tanto, se recomiendan concentraciones levemente tóxicas no tóxico o solamente (IC75). Es importante señalar que el aumento esperado en la actividad LDH en el sobrenadante de cultivo celular es a menudo influenciado por la sustancia aplicada21. Interferencias ocurren con frecuencia, entre la sustancia y actividad enzimática, conduce a la interpretación de los resultados si el análisis LDH era el ensayo de citotoxicidad único utilizado. Por lo tanto, es importante y necesaria para llevar a cabo varios ensayos de citotoxicidad para obtener resultados fiables y válidos. Por otra parte, debe mencionarse que la sensibilidad de los análisis LDH y WST-1 es altamente comparable.

En la figura 4, imágenes microscópicas viabilidad de PCLS demuestran capacidad de respuesta de los tejidos humanos detergente como una sustancia tóxica eficaz. Los resultados son muy útiles para confirmar otros datos de viabilidad, pero esto requiere equipo adicional. Efectos tóxicos se evalúan visualmente por la evaluación del tejido de calceína-positivo en comparación con los núcleos de célula EthD-1-positive. Elegido al azar segmentos de parénquima generalmente resultan en datos comparables, mientras que deben evitarse las vías respiratorias o los vasos sanguíneos, como las cavidades más grandes pueden cambiar los resultados. De nuestra experiencia y con las configuraciones microscópicas descritas anteriormente, se mide un volumen promedio entre 1.5 x 106 y 5 x 106 μm3 del tejido de control. Los valores dependen de pulmón material calidad PCLS y también en la enfermedad de la donante de tejido pulmonar. A pesar de la viabilidad del tejido pulmonar humano varía entre los donantes, el número de núcleos de células muertas en comparación con tejido viable no debe exceder el 15% del control del tejido. Si los núcleos de células muertas son predominante presentes en el control de tejido, sin embargo, el experimento debe abandonarse.

Figura 5 muestra datos representativos del efecto inmunomodulador de HClPt y SLS en tejido pulmonar humano. Las citoquinas proinflamatorias IL-1α y TNF-α son biomarcadores de la inflamación, lo que indica el comienzo de los procesos inflamatorios después de la exposición a estimulación de sustancias. Ambas citoquinas fueron medidos por ELISA. Extracelular de IL-1α es generalmente baja en humanos PCLS, mientras que intracelular de IL-1α alcanza niveles de 1.000 pg/mL o más. Una disminución intracelular de IL-1α indica procesos citotóxicos - y se observa sobre todo después de la exposición de PCLS humana a sustancias químicas. Si tejido es estimulado con LPS, un activador del sistema inmune innato y como tal el tratamiento positivo de control, entonces la mayoría de la inducida por IL-1α se puede detectar solamente intracelular después de 24 h. Por el contrario, la secreción de TNF-α inducida por el estímulo de los LPS puede principalmente medir extracelularmente. El uso de un adecuado control positivo, como LPS, demuestra la validez de un método. Con el presente método de investigación, PCLS humanas fueron expuestos a tres concentraciones de HClPt (32, 64 y 125 μg/mL) o dos concentraciones de SLS (1 y 10 μg/mL) por 24 h. citoquinas secreción fue determinada como la suma de las citoquinas intracelulares y extracelulares normalizados para las concentraciones de proteínas totales como se muestra en la figura 5. Cabe mencionar aquí que el ensayo BCA se utiliza generalmente para la determinación del contenido de proteína total, sin embargo, también refleja la citotoxicidad inducidas por sustancias. Por lo tanto, en concentraciones altamente tóxicas, el contenido de proteína total no puede utilizarse para la normalización de los datos del cytokine. Secreción de IL-1α aumentó significativamente de 263 ± 38 pg/mg ± 887 216 pg/mg y de TNF-α 263 ± 38 pg/mg a 1.160 ± 286 pg/mg (figura 5A, B). Por otra parte, se presenta la secreción de IL-1α y TNF-α inducida por LPS en comparación con un control sin estimular tejido. Inducción de citoquinas proinflamatorias por patrones moleculares asociados a patógenos, como LPS, demuestra la validez de un método y es muy recomendable para ser utilizado cuando se trabaja con humanos PCLS investigar efectos inmunomoduladores. Para más detalles sobre los datos HClPt y SLS, consulte el estudio por Lauenstein et al. 21

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Figura 1 : Procedimiento para el llenado de material de pulmón humano. El pulmón humano está preparado inmediatamente después de la resección. El pulmón debe almacenarse a temperatura ambiente para el relleno consistente con agarosa y para evitar la polimerización de agarosa repentino durante el llenado. El pulmón se coloca horizontalmente, con los lóbulos repartidas para una visión óptima en el bronquio principal o bronquios (A & B de primer plano en bronquio). Los bronquios son canulados con un tubo flexible de silicona y fija con abrazaderas (C). Después el relleno procedimiento de polimerización y de agarosa en el tejido, patólogos entrenados cortan el pulmón de sobre 3-5 cm de espesor (D). De estas rodajas núcleos de tejido cilíndrico ( por ejemplo,Ø, 8 mm) se preparan con una herramienta de perforación (E). Estos núcleos de tejido se cortan con una máquina de cortar tejido en PCLS, que son transferidos inmediatamente en platos de Petri llenas de medio de incubación bajo condiciones de cultivo de células normales (E). Después de varios pasos de lavado la PCLS se transfieren a las placas de cultivo celular (p. ej., placa de 24 pozos con dos PCLS por pozo y 500 μl de medio) para eliminar restos de células residuales y mediadores celulares liberados (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 : Determinación de la situación de salud de humana PCLS por tinción H & E. La PCLS en esta imagen, preparada a partir de un donante con un tumor de pulmón, muestra tejido de pulmón intacto con parénquima alveolar, periférica airways (*) y los vasos sanguíneos (flecha) en la descripción (A). A mayor aumento, realización de vías respiratorias con epitelio respiratorio ciliado intacto (flecha) (B), una estructura alveolar intacta con neumocitos viables, incluyendo un tubo capilar con numerosos eritrocitos (flecha) (C), espacios alveolares que contienen macrófagos alveolares (inmunohistoquímica CD68) (D), así como de vasos sanguíneos con endotelio intacto (immunohistochemistry CD31) (E) puede ser observado. Sólo libre de tumor de tejido fue utilizado para la PCLS, razón por la cual no hay áreas macroscópicamente enfermas son accesibles. En contraste con PCLS preparadas de donantes con otras enfermedades pulmonares, como enfisema o fibrosis, no se interrumpe la estructura alveolar y la PCLS es sólo ligeramente raído en la frontera exterior, probablemente debido a los pasos de preparación. Barras de escala indican 1.000 μm (A) y 50 (B–E), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 : Determinación de la citotoxicidad inducida por el SLS de PCLS humano, medido por la fuga de la enzima LDH en medio de cultivo (A) y pérdida de la actividad metabólica de la enzima con el tinte WST-1 (B). Humanos PCLS fueron expuestos al aumento de las concentraciones de SLS. Un modelo de respuesta de concentración sigmoideo posteriormente se ajustó a los datos, para que valores IC75 o IC50 (concentración inhibitoria en el 25% y 50% de reducción de la viabilidad celular) pueden ser calculadas (figuras de derecha). Los datos se presentan como media ± SEM, n = 3-5. Se midió la absorbencia de ensayo LDH a 492 nm (referencia a 630 nm) y del ensayo WST-1 a 450 nm (referencia a 630 nm). Datos fueron adaptados y modificados de Lauenstein et al. 21 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 : Imágenes representativas de tridimensionales microscópica tinción e imagen prestación de PCLS humana. Control de tejido vivo y capacidad de respuesta del tejido a un detergente, como una sustancia tóxica eficaz, aparecen después de la tinción de PCLS humano con calceína AM (amarillo) y EthD-1 (rojo). Pilas de 30 μm fueron tomadas con un objetivo de X 10 (A) y prestadas (B). La barra de escala indica 100 μm. excitación longitudes de onda 488 nm y 543 nm, emisión filtros BP 505-550 nm y LP 560 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5 : Hexachloroplatinate del amonio (HClPt)-inducida por la secreción de IL-1α y TNF-α en PCLS humana después de la exposición de 24 h. PCLS fueron expuestos a tres concentraciones (μg/mL 32 64 μg/mL y 125 μg/mL de HClPt) y dos diferentes concentraciones (1 μg/mL y 10 μg/mL) de SLS. Extracelular e intracelular de IL-1α (A) y TNF-α (B) fueron determinados por ELISA y normalizada para el contenido de proteína total. Para mostrar la validez del método un positivo activador del sistema inmune innato, LPS, se muestra como una referencia para IL-1α intracelular (A) y liberación de TNF-α (B) extracelular, normalizada para el contenido de proteína total. Los datos se presentan como media ± SEM, *p < 0.05 y ***p < 0.001; HClPt y SLS: n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 en técnicas duplicados (test de Mann-Whitney). Esta figura ha sido modificada de Lauenstein et al. 21 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Suplementario Figura 1: proceso computacional detallado para imágenes de viabilidad microscópica tinción utilizando el software de renderización. Paso a paso procedimiento operativo para el análisis de la imagen de imágenes LSM para representación superficial de tejido teñido de calceína viable (A–G, I) y punto detección de núcleos de célula teñida de homodímero de etidio (H, J–M). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Suplementario Figura 2: Resumen de análisis de imagen Computacional de viabilidad microscópica tinción de tejido pulmonar humano. Tejido viable (amarillo) se analizó mediante un procesamiento superficial (B–) y núcleos de células muertas (rojo) fueron detectados por punto detección (J–P). El modo de instantánea se utilizó para exportar la imagen (Q). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La técnica PCLS humana está bien establecida en nuestro laboratorio. El presente trabajo ofrece una descripción de esta técnica y su uso para ensayos de toxicidad de las sustancias en el tejido pulmonar ex vivo. En general, cualquier laboratorio usando que esta técnica debe buscar establecer un ensayo relacionados con la definición de gamas cuantificables, estimación de la variabilidad y controles de calidad garantizando la validez del experimento. Podrían ser posible procedimientos estándar, por ejemplo, repetir cada extremo, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad, en un mínimo de tres donantes biológicos (recorridos individuales) con un mínimo de dos a tres repeticiones técnicas por muestra como positivo y referencias negativas. Personal del laboratorio debe ser entrenado para aumentar la consistencia del análisis y minimizar la variabilidad del ensayo.

Variables principales de evaluación utilizadas para evaluar los efectos inmunomoduladores de sustancias en el tejido pulmonar incluyen citotoxicidad mediciones con diferentes ensayos (por ejemplo, análisis de LDH, WST-1 ensayo, ensayo de tinción microscópica), ensayos de liberación de citoquinas, así como cambios en el perfil de la expresión y caracterización de los cambios en las poblaciones celulares por immunohistopathological métodos6. Además, existen técnicas que describe la visualización de las células, como células dendríticas pulmonares, en murinos PCLS28 que también pueden ser transferidos a PCLS humanos y así puede proporcionar la visión más detallada de la composición celular antes y después del tratamiento con supuestas sustancias citotóxicas.

Este protocolo básico y técnica para la preparación de las secciones de tejido de pulmón humano es comparable a las técnicas que han sido bien descritas en publicaciones29. En Resumen, el material del órgano se obtiene de pacientes que sufren de mortales viven enfermedades crónicas tales como cáncer de pulmón, que tienen que someterse a una cirugía de resección o trasplante. Los estudios deben ser aprobados por el Comité de ética local. Consentimiento informado de pacientes es necesario. Establecer un flujo de trabajo entre clínica y laboratorio es un tema crítico y requiere comunicación y definición de interfaces y de infraestructura entre ambos sitios. Material de pulmón humano debe procesarse directamente después de la resección para preservar la viabilidad del tejido. Cabe mencionar que se puede aplicar la técnica descrita aquí para PCLS humano pulmones jóvenes y viejos y pulmones sanos y enfermos. En los Estados Unidos, por ejemplo, es posible obtener los pulmones de donantes de órganos sanos que murieron en accidentes o cuyos órganos han sido rechazados para trasplante.

El primer paso crítico en el protocolo es la inflación de las vías respiratorias y el parénquima circundante con solución de agarosa. Este paso es necesario para solidificar el tejido muy suave para el procedimiento de corte posterior. La calidad del material de pulmón humano, basado en los antecedentes de la enfermedad, es fundamental aquí. Pueden llenarse solamente lóbulos con pleura intacta. Tumores de la fase final cerca de los bronquios a veces evitar el proceso de llenado. Antes de inflar el material humano, la temperatura de la solución de agarosa tiene que ser examinado. Demasiada sangre (u otros líquidos, exudados) dentro de lo humano tejido pulmonar tendrá como resultado indeseable disolución de agarosa e influirá en el proceso de polimerización. Después de la inflación del tejido pulmonar y gelificación de agarosa en el hielo, los pulmones se cortan en secciones de 200 a 300 μm de espesor. Consistencia de los tejidos es un tema muy crítico. Si el tejido es muy suave, de corte de secciones iguales es difícil. Aunque el mismo micrótomo se establecen parámetros para cada donante, el espesor de las láminas entre los donantes puede variar, debido a las condiciones y cambios durante el inflado del proceso para cada pulmón. Relleno no homogénea del tejido resultará en rebanada diferentes espesores. En lugar de medir y estandarizar el grosor de las rebanadas, medición del contenido total de proteínas puede utilizarse para supervisar indirectamente espesores de rebanada de pulmón. Varias enfermedades de estado obstaculizan el proceso de corte; por ejemplo, sangre vasos extremadamente son espesados en hipertensión pulmonar y tejido fibrótico puede ser tan rígida que corte de cilindros de tejido es apenas posible y la cuchilla del microtomo debe sustituirse muy a menudo.

Después de la preparación de humanos PCLS y pasos de lavado intensivo, que son necesarios para eliminar restos celulares y lanzado enzimas, tejido secciones pueden ser utilizadas para experimentos29. PCLS humanos son cultivadas bajo condiciones de cultivo de células normales y expuestos, por ejemplo, a sustancias químicas, drogas o lipopolisacáridos. Contaminación ocasional de los PCLS debido a infecciones (desconocidas) es un número especial en la cultura material de pulmón humano. Culturas del tejido mostrando infecciones debe ser descartadas y el equipo debe ser desinfectado completamente. Separación espacial entre los lugares de laboratorio utilizados para la preparación en una mano y cultivo por otro lado puede ayudar a evitar infecciones cruzadas. Con respecto a los equipos, puede perder el microtomo y sueltos tornillos hexagonal pueden conducir a daños en el motor y la parada del movimiento de la hoja. No todas las partes de la máquina de cortar es de acero inoxidable, y así se oxide si no seca inmediatamente alterar la de limpieza. Para superar los problemas de los equipos, puede ser necesario tener al menos un dispositivo de copia de seguridad.

En publicaciones anteriores, agarosa ha sido divulgada para ser eliminada y quitado durante intensivo lavado pasos después de la preparación. De hecho, esto no es posible, la agarosa no se puede quitar. Para la evacuación total de la agarosa, necesita ser re-fundida a altas temperaturas, que destruirían el tejido. La agarosa en alvéolos y las vías respiratorias no interfiere con los extremos descritos. Otros puntos finales pueden ser influenciados por la presencia de agarosa (véase también limitaciones). La necesidad de preparar secciones de tejido muy fresco tiene que ser subrayado, como viabilidad del tejido es un asunto crucial en la cultura. Broncoconstricción no es un parámetro válido para la viabilidad. Se recomienda utilizar al menos dos o tres ensayos de citotoxicidad independiente para comprobar la viabilidad del parénquima circundante; Esto debe comprobarse en cada experimento30. Controles de calidad en los ensayos de citotoxicidad sirven como indicadores de la viabilidad del tejido insuficiente. Por lo tanto, se recomienda evaluar la capacidad de respuesta de los tejidos, por ejemplo, para una eficaz sustancia tóxica como un detergente en todos los ensayos de citotoxicidad. Basado en curvas de dosis-respuesta, valores mínimos y máximos de absorción es necesario definir para los ensayos de citotoxicidad y se reunieron para experimentos posteriores. Otras modificaciones en el protocolo dependen sobre todo de los productos químicos aplicados y los extremos de interés. La aplicación de sustancias químicas altamente reactivas o insolubles es limitada. La mayor concentración de solvente para DMSO se limita a 1%. Concentraciones más altas se pueden utilizar pero pueden ocasionar pronunciada liberación de citoquinas proinflamatorias, como IL-8. Por otro lado, el estímulo utilizado puede ser relativamente débil. En este caso, la cantidad de tejido puede aumentar de dos a cuatro rebanadas por pozo. Este enfoque limita la viabilidad a las 24 h.

Una limitación importante de PCLS humana es que en Alemania puede solamente estar preparados de material enfermo de pulmón humano. Los pacientes que se someten a cirugía son normalmente mayores de 50 años y 80% de los pacientes que sufren de cáncer de pulmón son o para ser fumadores. Medicación de los pacientes, tales como glucocorticoides, también puede influir en el resultado de experimentos con tejido humano. Por lo tanto, es esencial para: i) validar cada experimento por referencias positivas, verificar la viabilidad, funcionalidad y sensibilidad de los tejidos individuales y ii) Cruz-validar los resultados con tejido pulmonar sano, no enfermo, edad media de animales de laboratorio (primates no humanos como cangrejeros y, si es posible, ratón, rata, conejillo de Indias). Mejor la puntuación de la patología del tejido enfermo, mejor los resultados experimentales. Apenas se puede utilizar tejido enfermo pesadamente y muy a menudo muestra limitada viabilidad, niveles inadecuadamente bajos o muy altos de citoquinas, infecciones bacterianas o fúngicas y menos broncoconstricción. Donante a donante variación mayor se compara con resultados obtenidos en animales de laboratorio, lo que refleja la variabilidad individual de los seres humanos. Esto, sin embargo, no es una limitación en general; como se mencionó anteriormente, en otros países (por ejemplo, los Estados Unidos) es posible obtener sanos pulmones de donantes de órganos fallecidos por trasplante. Capacidad de respuesta del tejido ha sido bien descrito para la primera hasta 48 h en experimentos de exposición aguda. Viabilidad y funcionalidad de los tejidos se reduce después de muchos días de cultivo o almacenamiento a-80 ° C. Es posible para el tejido de pulmón humano cultura de hasta cerca de 14 días. Viabilidad continúa durante este tiempo; sin embargo, se observa un aumento en la variabilidad, así como una pérdida de funcionalidad de varias poblaciones celulares, como macrófagos en el tejido, dando por resultado la liberación de citoquinas limitada en respuesta a mitógenos. Otra limitación para algunos extremos es la presencia de agarosa en el tejido, lo que dificulta, por ejemplo, el aislamiento de alta calidad y suficiente cantidad de RNA31 o la preparación de suspensiones celulares solo para citometría de flujo posterior y fenotipo de las células. Así se limita la posibilidad de ganar penetraciones mecánicas en respuestas de unicelular y funcionalidad.

Modelos de tejido Organotypic como humano PCLS, se consideran que tienen un alto impacto en investigación básica y clínica-no. Material de pulmón humano tiene una composición biológica que refleja de cerca la arquitectura normal del órgano. Por ejemplo, contiene células epiteliales alveolares y bronquiales residenciales, las células musculares lisas, fibroblastos, células endoteliales, fibras nerviosas y macrófagos. El tejido es viable y las células responden a varios estímulos. Del nervio las fibras, aunque corta, puede activarse localmente, conduce a respuestas reflejo terminal14. En consecuencia, este modelo ex vivo ofrece la posibilidad de estudiar celular respuesta inmune innata, respuestas de defensa, señalización de citoquinas e inducción de marcadores de superficie celular. Varias mejoras en la técnica de cultivo y validación de criterios de valoración permiten el uso de humanos PCLS en ciencia traslacional. Ejemplos de enfoques de futuro son: i) validación de nuevos objetivos en el tejido de pulmón humano ii) evaluación de la respuesta inmune después de la exposición, por ejemplo, a sustancias químicas, drogas, nanopartículas, etc., iii) suplementación del tejido pulmonar con las células inmunes, tales como los linfocitos T, iv) identificación y modificación de patrones moleculares, por ejemplo, después de la exposición a sensibilizantes respiratorios, inducir enfermedad sustancias o compuestos activos inhibiendo vías; Además, v) remodelación de las vías respiratorias y vi) regulación neuronal32. El campo científico está interesado en estos enfoques actuales y futuros con PCLS. Además, hay una gran variedad de acontecimientos diferentes que ayudarán a mejorar la técnica del PCLS, como criopreservación20y33 para imitar el movimiento natural del tejido durante la respiración o mecánicos de estiramiento del tejido ventilación.

La gran ventaja de humano PCLS en comparación con otros modelos 3D es la presencia de células inmunes y las fibras nerviosas. Los experimentos pueden realizarse también en ratón, ratas y primates no humanos, que son las especies animales que todavía se utilizan más a menudo en farmacología y toxicología. La complejidad del tejido pulmonar humano apoya la traducción de resultados de animal a humano y en vitro en vivo. En el contexto de ensayos alternativos existentes para la identificación de sensibilizadores respiratorios, PCLS humanas son muy complejas y no permiten penetraciones en las respuestas de la célula. Sin embargo, citometría de flujo y microscopía podría brindar información acerca de respuestas celulares, si el marcador bien celular se usa en combinación, por ejemplo, con apoptosis, necrosis o marcadores intracelulares. Hay ensayos publicados que han sido validados y registrados que se han utilizado para la identificación de sensibilizadores respiratorios. Sin embargo, los avances en el uso de PCLS con todas sus ventajas en análisis unicelulares están haciendo una contribución valiosa en el sentido que la técnica puede utilizarse para el cribado de alto rendimiento, según lo descrito por Watson et al. 34 desarrolló un ensayo de cribado de alto rendimiento para predecir la toxicidad de las vías respiratorias en murinos PCLS crio-preservado. Con su formato miniaturizado de PCLS 96 pocillos, que detectan lecturas similares en líquido de lavado murino, haciendo PCLS un posible ensayo de alto rendimiento.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar. Fraunhofer procede a una organización pública independiente de la investigación sin fines de lucro para la investigación aplicada, investigación de contrato en nombre de las industrias biotecnológica, farmacéutica, química y cosméticos. Financiación del Instituto proviene de proyectos públicos nacionales e internacionales.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Lan Lauenstein por su trabajo previo sobre estrategias alternativas de prueba para evaluación del riesgo con humanos PCLS. Algunas de las investigaciones fue apoyado por una subvención de la Comisión Europea dentro del programa de marcoth 6 SENS-ti-IV "Novela estrategias de pruebas de evaluación In Vitro de alérgenos".

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Manguera de silicona 3,0 x 5,0 mmA. Hartenstein (Leipzig, Alemania)SS04
JeringaFaust Lab Science (Klettgau, Alemania)9.410 050
Herramientas de extracción de muestrasa medida
(FEATHER)pfm medical ag  (Colonia, Alemania)
Cuchillas de corte (FEATHER)pfm medical ag  (Colonia, Alemania)205500000
Microtomo: Cortadora de pañuelosAlabama R& D (Bad Homburg, Alemania)303400-ADPTCortadora de pañuelos Krumdieck (MD6000)
Hoja de micrótomoWilkinson Sword (Solingen, Alemania)ENR-4027800011506
Placas de cultivo de tejidosSigma (Mü nchen, Alemania)Z666246-420EA
Filtro de filtro de células (100 y micro; m Nylon)Becton Dickinson (Heidelberg, Alemania)BD352360
Inoculation loopCopan Diagnostics (Murrieta, EE. UU.) 
TPP Placas de cultivo de tejidos 24 pocillosSigma (Mü nchen, Alemania)Z707791-126EA
CassetteThermo Scientific (Schwerte, Alemania)1000957
Nunc MaxiSorp de fondo planoFisher Scientific GmbH (Hannover, Alemania)44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well Thermo Scientific (Schwerte, Alemania)260836
Microscopio confocalZeiss (Jena, Alemania)Software de renderizado de imágenes Confocal LSM Meta 510
Bitplane AG (Zü rich, Suiza)IMARIS 7.6
LSM Image BrowserZeiss (Jena, Alemania)
Multiwell-ReaderTecan Group Ltd. (Mä nnedorf, Suiza)Tecan infinite F200ProLector de placas
Agitador de placasEdmund Buehler GmbH (Hechingen, Alemania)KM-2 Akku
BenchMark ULTRAVentana Medical Systems (Tucson, EE. UU.)Sistema automatizado de tinción de portaobjetos IHC/
ISHEnsayos
WST-1Roche (Basilea, Suiza)11644807001
Kit de detección de citotoxicidad (LDH)Roche (Basilea, Suiza)11644793001
Tinción microscópica de vitalidad Invitrogen (Carlsbad, EE. UU.)L-3224LIVE/DEAD Kit de viabilidad/citotoxicidad
BCA Protein AssayThermo Scientific (Schwerte, Alemania)23225
Kit de ensayo ELISAR & D sistemasvarios, por ejemplo, DY210 (TNF-α) o DY200 (IL-1α)DuoSet
Agarosa, baja temperatura de gelificación Sigma (Mü nchen, Alemania)A9414-100G
Mezclas y soluciones equilibradas de sales, cultivo celular, medios clásicos y sales, Earle' s Sales Equilibradas (EBSS)Sigma (Mü nchen, Alemania)E2888-500ML
Penicilina y estreptomicinaLonza (Verviers, Bélgica)17-602E
Dulbecco&agudo; s Águila modificada y aguda; s Medio Mezcla de nutrientes F-12 Jamón (DMEM F-12)Gibco (Darmstadt, Alemania)11039-047Medio de cultivo
Dulbecco&agudo; s Fosfato con Ca y Mg (DPBS)Lonza (Verviers, Bélgica)BE17-513F   solución tampón
Albúmina de suero bovino (BSA)Sigma (Mü nchen, Alemania)A9647-500G
DetergenteSigma (Saint Louis, EE. UU.)X100-100MLTriton X-100
Tampón de lavadoMerck (Darmstadt, Alemania)524653  0.05% Preadolescente 20 en PBS
Mango de cuchilla de corte a medida 205530001CD176S01Reactivo de proliferación celular

Referencias

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