Method Article

La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

DOI:

10.3791/57051

⸱

March 13th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

In This Article

Summary

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Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

Abstract

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Zika, el dengue y el chikungunya virus son transmitidos por mosquitos, que causan enfermedades con sintomatología similar. Sin embargo, tienen potencialidades diferentes aguas abajo transmisión de paciente a paciente y requieren tratamientos de pacientes muy diferentes. Así, los brotes recientes de Zika hacen urgente a desarrollar herramientas que discriminan rápidamente estos virus en pacientes y atrapados los mosquitos, el correcto tratamiento de los pacientes y para comprender y manejar su epidemiología en tiempo real.

Desafortunadamente, pruebas de diagnóstico actuales, incluyendo ésos emergencia de 2016 recibe autorizaciones de uso y rápido estado, detectar ARN viral por transcripción reversa reacción en cadena polimerasa (RT-PCR), que requiere instrumentación, formación usuarios, y preparación de la muestra considerable. Por lo tanto, deben enviarse a laboratorios de referencia "aprobado", que requiere tiempo. De hecho, en agosto de 2016, el centro para el Control de enfermedades (CDC) estaba pidiendo que las mujeres embarazadas que había sido mordido por un mosquito y desarrolló una erupción de Zika indicando esperar un inaceptable 2 a 4 semanas antes del aprendizaje si estaban infectados. Mucho necesitamos pruebas que se pueden realizar en sitio, con pocos recursos y por personal entrenado pero no necesariamente con licencia.

Este video muestra un ensayo que cumpla con estas especificaciones, trabajando con orina o suero (para pacientes) o cadáveres de mosquitos aplastados (para la vigilancia ambiental), sin mucha preparación de la muestra. Cadáveres de mosquitos son capturados en papel con amonio cuaternario grupos (Q-papel) seguidos por el tratamiento de amoníaco para la gestión de riesgos biológicos. Estos son entonces directamente, sin el aislamiento de RNA, puestos en tubos de ensayo con reactivos liofilizados que ninguna cadena de refrigeración. Una forma modificada de amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa con sondas desplazables fluorescente etiquetas específico del destino produce lectura, en el minuto 30, como una señal de la fluorescencia tricolor. Esto se visualiza con un dispositivo portátil, con pilas con un filtro naranja. Contaminación hacia adelante se previene con tubos cerrados y el uso de termolábiles uracil ADN glicosilasa (UDG) en presencia de dUTP en la mezcla de amplificación.

Introduction

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Infecciones de virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika virus, dengue y chikungunya son en las estrategias de manejo inmediato de aumento y la demanda. Dengue y chikungunya virus ya son endémicos en muchas de las regiones tropicales donde Zika ahora se extiende en el hemisferio occidental1. Zika virus, como el dengue, es un miembro de la familia Flaviviridae y es nativo a África con un asiático y dos linajes genéticos africanos2. A pesar de la identificación del virus Zika se remonta a 1947, Zika infección en seres humanos seguía siendo esporádica por medio siglo antes de emerger en el Pacífico y las Américas. El primer brote reportado de Zika fiebre se produjo en la isla de Yap, en los Estados federados de Micronesia en 2007, seguido de la Polinesia francesa en 2013 y 2014. El primer brote importante en las Américas ocurrió en el año 2015 en Brasil.

Zika, chikungunya y dengue virus son transmitidos principalmente por Aedes aegypti y Aedes albopictus. Sin embargo, Zika tiene posibilidades de transmisión de humano a humano adicionales aguas abajo, es probable que se propague a través del contacto sexual, interacción de la madre al feto y a través de la lactancia materna3,4,5. La fiebre Zika primero se cree que causan sólo leves. Sin embargo, más tarde fue asociada con el síndrome de Guillain-Barré en adultos, microcefalia en recién nacidos y las enfermedades musculoesqueléticas crónicas que pueden durar meses a años. Diagnóstico de enfermedad de Zika puede ser difícil, ya que los síntomas de una infección de Zika son similares a los de otros virus mosquito-extensión6. Las coinfecciones comunes de estos virus hacen diagnóstico diferencial más difícil7,8. Por lo tanto, la detección rápida y confiable de los ácidos nucleicos de Zika y otros virus es necesario para comprender la epidemiología en tiempo real, para iniciar medidas preventivas y control y para gestionar la atención de los pacientes9.

Pruebas de diagnóstico actuales para estos virus incluyen pruebas serológicas, aislamiento viral, secuenciación de virus y transcripción reversa PCR (RT-PCR). Estándar métodos serológicos a menudo sufren de sensibilidad insuficiente y resultados pueden ser complicados por reactividad cruzada en pacientes que previamente han sido infectados por otros flaviviruses.

Por lo tanto, pruebas de ácido nucleico sigue siendo la forma más confiable para detectar y diferenciar estos virus. Detección de Zika y otros virus transmitidos por mosquitos se realiza generalmente mediante RT-PCR o RT-PCR en tiempo real en gran variedad de fluidos biológicos, como suero, orina, saliva, semen, leche materna y líquido cerebral10,11. Las muestras de orina y la saliva se prefiere generalmente sobre sangre, puesto que exhiben menos inhibición de la polimerización en cadena, cargas virales más altas, presencia de virus por largos períodos de tiempo y aumento de la facilidad de recolección y manejo de12,13. Pruebas diagnósticas basadas en RT-PCR, sin embargo, conforman la muestra extenso y caro equipamiento ciclismo térmico, haciéndolo menos óptima para el punto de atención.

Muestras de su tolerancia de sustancias inhibidoras en biológico y reversa de la transcripción mediada por el bucle de amplificación isotérmica (RT-LAMP) ha surgido como una poderosa alternativa de RT-PCR debido a su alta sensibilidad y especificidad14,15, y operación de temperatura individual, que significativamente ensayo de baja complejidad y los costos asociados, lo que es adecuado para entornos de bajos recursos. RT-LAMP, como clásicamente se implementa, consta de seis cartillas que se unen a ocho regiones distintas dentro de la meta de RNA. Funciona en temperaturas constantes entre 60 ° C y 70 ° C y utiliza una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa con filamento fuerte desplazando la actividad.

Durante las etapas iniciales de RT-LAMP, hacia adelantados y hacia atrás interiores imprimaciones (FIP y BIP, figura 1A) junto con cartillas externas hacia adelantados y hacia atrás (F3 y B3) forman una estructura de la pesa de gimnasia, la estructura de la semilla de la amplificación exponencial de lámpara. Amplificación es aún más acelerada por el lazo hacia adelante y hacia atrás cartillas (LF y LB), que están diseñados para enlazar las regiones solo trenzadas de la pesa de gimnasia, y resultados en la formación de concatemers con la repetición de múltiples lazadas16. LÁMPARA clásica de ensayos basado en turbidez o lectura por ADN intercalando tintes no es totalmente adecuado para detección de punto de atención de Zika, donde es cierto nivel de multiplexación había deseado17,18,19. Multiplexing no es fácilmente obtenido en estos sistemas, ya que son propensos a generar falsos positivos debido a amplificaciones de fuera de objetivo.

Para gestionar estos temas, la literatura agrega un componente adicional en la forma de una "sonda desplace el filamento" a la clásica lámpara RT arquitectura20,21,22. Cada sondeo tiene una región de doble cadena de secuencia-específicas y una región sola cebado. La sonda con la región monocatenario es etiquetada con un fluoróforo de 5', y la sonda complementaria se modifica con un extintor de extremo 3'. En la ausencia de un objetivo, ninguna fluorescencia se observa debido a la hibridación de los filamentos complementarios de la sonda, que trae el fluoróforo y el quencher en proximidad cercana. En presencia de un objetivo, la sola porción de la sonda fluorescente se une a su complemento en el destino y luego se extiende por un filamento desplazando polimerasa. Extensión adicional de la polimerasa por cartillas inversas provoca la separación del quencher filamento de su filamento fluorescente etiquetado complementario, permitiendo la emisión de fluorescencia ()figura 1B). Con este diseño, la señal es generada después de la formación pesa de gimnasia, reduciendo las posibilidades de las señales de falsos positivos.

La porción de la doble hebra de la sonda desplace el filamento puede ser cualquier secuencia, y cuando se aplica la multiplexación, la misma secuencia puede utilizarse con pares de diferentes fluoróforo-quencher. Con esta arquitectura, contaminados por el virus de la orina, suero o mosquito muestras aplastadas en el papel fueron introducidas directamente en el ensayo sin preparación de la muestra. Lectura de la fluorescencia tricolor visible para el ojo humano se generaron dentro de 30-45 min, y señales fueron visualizadas por un cuadro de observación impreso en 3D que utiliza un LED azul y un filtro naranja. Liofilización de los reactivos de RT-LAMP permitió el despliegue de este kit para bajar la configuración de recursos sin necesidad de refrigeración.

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Protocol

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Nota: Los mosquitos eran los únicos animales directamente utilizados en este estudio. Los procedimientos para manejar pollos, cuya sangre se utilizó para la alimentación de los mosquitos infectados, fueron aprobados como IACUC protocolo #201507682 por la propagación de atención Animal institucional de la Universidad de Florida y Committee.Virus de uso y estudios de infección del mosquito fueron realizado en las instalaciones del BSL-3 del laboratorio de Entomología médica de Florida en Vero Beach, FL. RT-LAMP experimentos fueron realizados en el laboratorio BSL-2 compartido por FfAME y Firebird Biomolecular Sciences LLC en Alachua, FL.

1. diseño de Primers y filamento desplazando las puntas de prueba

  1. Extraer secuencias virales de Dengue 1 de la base de datos Instituto Broad23; secuencias de Zika y chikungunya del NIAID Virus patógeno la base de datos y análisis de recursos24.
    1. Crear múltiples alineaciones de la secuencia (MSAs) para las secuencias de interés utilizando el software de músculo v3.8.3125. Uso generado MSAs para buscar lámpara cartillas conjuntos dentro de una región conservada de la meta y evitar objetivos no deseados o no relevantes, como distinción entre subtipos de un objetivo.
  2. Seguir las normas de diseño de cartillas de la lámpara como se describe en línea (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) y permitir el uso de bases mixtas en Imprimaciones para cubrir el virus divergencia26. Para evitar la reactividad cruzada de juegos de primer, comparar generados cartillas de lámpara a la base de datos de virus de ARN de NCBI usando BLAST del NCBI27. Comparar cada sistema para eliminar cebadores que se dimerizan en un ensayo de multiplexado usando BLAST del NCBI así.
  3. La porción de la doble hebra de la sonda desplace el filamento contra cualquier secuencia del genoma viral y la secuencia genomic de mosquito de la pantalla. Modificar el 5'-extremos de la punta de prueba de enlace de destino con fluoresceína amidite (FAM), HEX tinte y tinte 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) Zika, chikungunya y Dengue 1, respectivamente.
    1. Incluyen un primer control positivo para las muestras de orina. Diseño de cartillas de lámpara a ADN mitocondrial humano. Etiqueta desplace el filamento de la sonda con TET en el extremo 5'. Etiqueta extintor las puntas de prueba que son parcialmente complementarios a cada fluorescente etiquetado probe con extintor (por ejemplo, Iowa negro-FQ) en el extremo 3'-(tabla 1).

2. virus aísla e infectados muestras del Mosquito

  1. Uso de los aislantes del virus Zika (tensión de Puerto Rico), virus de Chikungunya (tensión de La isla o Islas Vírgenes Británicas) y el virus del Dengue serotipo 1 (cepa de Key West). Determinar los títulos virales mediante ensayo de placa28 o RT-PCR cuantitativa29. Extraer ARN viral usando comercialmente disponibles kits de extracción de RNA.
    Nota: La tabla 2 representa los títulos virales de cada cepa de virus utilizados en este estudio.
  2. Siga el artículo publicado por Yaren et para un protocolo detallado acerca de la infección de las hembras de Ae. aegypti con Zika y chikungunya virus20. Consulte la tabla 2 para la titulación viral de la muestra de mosquito infectada con el virus Zika.

3. RT-LAMP juntada con termolábiles Uracil ADN glicosilasa

  1. 10 x preparación de mezcla de cartilla.
    1. Preparar la solución madre de 100 μm de cada cebador y sonda (ver paso 1) mediante la adición de agua libre de nucleasa. Mezclar bien y conservar a-20 ° C hasta su uso.
    2. Para mezcla de Primer X 10 para cada μl de mezcla de 16 Zika, Dengue 1 u objetivo de ADN mitocondrial, de la FIP, 16 μl BIP, 2 μl de F3, 2 μl de B3, 5 μl de LF, 2 μl de LB, 3 μl de LB-fluorescente etiquetado sonda, 4 μL de sonda extintor y 50 μl de agua libre de nucleasa para dar un total de 100 μl.
    3. Para 10 X Primer mix de Chikungunya, la mezcla de 16 μl de FIP, 16 μl BIP, 2 μl de F3, 2 μl de B3, 5 μl de LB, 2 μl de LF, 3 μl de LF-fluorescente etiquetado sonda, 4 μL de sonda extintor y 50 μl de agua libre de nucleasa para dar un total de volumen de 100 μl.
      Nota: La sonda concentración descrita anteriormente utiliza 300 nM de última sonda fluorescente y 400 nM de sonda extintor. Por otra parte, el uso 80 nM de sonda de fluorescencia marcada y 200 nM de su sonda extintor para análisis en tiempo real.
  2. Añadir 5 μl de 10 X mezcla imprimación (para 3-plex, añadir 5 μl de cada 10 X mezcla de cartilla), 5 μl de 10 X buffer de amplificación isotérmica (1 X buffer composición: 20 mM Tris-HCl tampón, pH 8.8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1% Tween-20, 1 mM TDT), 7 μl de mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dCTP y dGTP, dTTP y dUTP 5 mM), 16 unidades de ADN polimerasa, 15 unidades de la transcriptasa reversa, 80 unidades de inhibidor de la ribonucleasa recombinante, 2 unidades de UDG termolábil, 1-2 μl de cantidades variables de vi ral RNAs y agua para llevar el volumen total hasta 50 μl de PCR 0,25 mL del tubo (véase Tabla de materiales).
  3. Incluyen ensayos de control negativo en esta etapa mediante la sustitución de volumen de RNA viral con agua. Incubar muestras entre 65-68 ° C por 45 min a 1 h, y luego analizar mediante la ejecución de 5 μl de cada muestra en gel de agarosa 2,5% en buffer de X TBE 1 que contiene bromuro de etidio (0,4 μg/mL). Use un 25 bp o 50 bp ADN como marcador en el gel.
    Nota: Además de una plantilla específica no es opcional.
  4. Para detectar la presencia de patógeno ARN, probar cada juego de cartilla y su control de plantilla no variando la concentración de temperatura o magnesio, ya que cada RT-LAMP primer set fue diseñado para trabajar en diferentes temperaturas (65 ° C a 68 ° C) o magnesio concentraciones de (6 a 10 mM final). Preparar los experimentos a temperatura ambiente.

4. RT-LAMP utilizando orina de tacon de ARN Viral

  1. Prueba de iniciadores RT-LAMP en diversas concentraciones finales de orina (0%, 10%, 20% y 50%) en 50 μl de volumen de reacción total. Para la concentración de la orina final de 10%, añadir 1 μl de RNA viral a 5 μl de orina. Para la concentración de la orina final de 20%, añadir 1 μl de RNA viral a 10 μl de orina. Para la concentración de la orina final de 50%, añadir 1 μl de RNA viral a 25 μl de orina.
  2. Para monitoreo en tiempo real de la lámpara de RT en el 10% de la orina, use un instrumento PCR en tiempo real (véase Tabla de materiales) con fluoróforo diferentes filtros.
    1. Para leer las señales de fluorescencia de amplicones marcados con la FAM para Zika, use un filtro desde 483 a 533 nm; para amplicones marcados con HEX para chikungunya, use un filtro desde 523 568 nm; para amplicones marcados con TAMRA para Dengue 1, utilice un filtro desde 558 a 610 nm. y para amplicones marcados con TET para ADN mitocondrial, use un filtro desde 523 568 nm.
      Nota: FAM tiene máximos de excitación y emisión de 495 nm y 520 nm, respectivamente. HEX tiene máximos de excitación y emisión de 538 nm y 555 nm, respectivamente. TAMRA tiene máximos de excitación y emisión de 559 nm y 583 nm, respectivamente. TET tiene máximos de excitación y emisión de 522 nm y 539 nm, respectivamente.
  3. Placas de uso 96 pocillos y sello de la placa con una hoja de plástico transparente, luego incubar las muestras a 65-68 ° C durante 60-90 min y registrar la fluorescencia cada 30 s usando el light cycler. Inicialmente use 80 nM de sondas fluorescente etiquetadas y prueba de los 300 nM de sondas fluorescente etiquetadas.
    1. Determinar el límite de detección para cada destino añadiendo en serie diluido RNAs virales en la concentración de la orina final de 10%.
      Nota: Utilice lámpara de RT en tiempo real para determinar la temperatura óptima, la concentración de magnesio, sonda de fluorescencia marcada concentración y tiempo de reacción.
  4. Para visualizar la fluorescencia generada por sondas desplazable hebra por el ojo, use una fuente de luz LED azul de un light cycler con excitación a 470 nm (cualquier caja de gel de electroforesis con fuente de luz azul incorporado trabajar, ver la tabla de materiales) y grabar la imagen con una cámara de teléfono celular a temperatura ambiente en la oscuridad.
    Nota: Uso 300 nM de sondas fluorescente etiquetadas, cuando es necesaria la visualización de los tres colores por el ojo con LED azul.

5. Lámpara de RT en la detección de los mosquitos infectados Zika Q papel tecnología

  1. Preparar cuaternario amonio modificado filtro de papel (Q-), según métodos previamente publicados con ligeras modificaciones30.
    1. Sumergir 1 g de círculos de papel de filtro de celulosa (véase Tabla de materiales) con un diámetro de 3,5 cm en 50 mL de 1,8% de solución acuosa de NaOH durante 15 minutos para la activación.
    2. Recoge círculos de papel activado por filtración de vacío y luego sumergirlos en 40 mL de solución acuosa de cloruro de trimetilamonio (2, 3-epoxipropil) (0.28 g) durante la noche a temperatura ambiente.
      Nota: Mantenga la relación entre la masa de cloruro de trimetilamonio (2, 3-epoxipropil) a papel de filtro en 0.28 a 1.
    3. Recoge el papel catiónico resultante de la filtración de vacío y neutralizar con 50 mL de 1% de ácido acético.
    4. Lavar el papel tres veces con etanol y secar al aire bajo una campana de flujo de aire constante.
  2. Corte hojas de papel Q en pequeños rectángulos (3 x 4 mm) utilizando un punzón para papel o tijeras. Aplastar los mosquitos hembras de Ae. aegypti potencialmente infectados con Zika en cada papel con un mortero micro.
  3. Añadir a cada papel 20 μl de solución de amoníaco acuosa de 1 M (pH ≈ 12) y espere 5 minutos. Luego lave cada papel una vez con 20 μl de EtOH de 50% y otra con 20 μl de agua libre de nucleasa. Seque el papel de bioseguridad BSL-2 gabinete durante aproximadamente 1 hora.
    Nota: En este punto, las muestras pueden almacenarse a-20 ° C durante la noche hasta su uso.
  4. Utilizando pinzas, coloque cada papel en 100 μl de mezcla de reacción RT-LAMP e incubar a 65-68 ° C durante 45 minutos hace que al sumergir totalmente el papel en la solución; no debe estar flotando. Leer y registrar la fluorescencia derivadas de virus Zika con fuente de luz LED azul y filtro naranja o amarillo.

6. liofilización de reactivos de RT-LAMP para 100 μl de volumen de reacción

  1. Preparar mezcla de cartilla de lámpara X 10 según el artículo 3.1 y preparar la mezcla de dNTP con dUTP según el artículo 3.2. Tienda cartilla mezcla y dNTPs a-20 ° C hasta su uso.
  2. Preparar 10 mL de buffer de enzima diálisis para eliminar el glicerol, al mezclar 100 μl de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 500 μl de 1 M de KCl, 2 μl de EDTA de 0,5 M, 100 μl de 10% Tritón X-100, 100 μl de 0,1 M TDT y 9,198 mL de agua libre de nucleasa. Almacenar el buffer de diálisis a 4 ° C.
    Nota: Asegúrese de filtrar (filtros de 0.2 micrones) todos soluciones tampón reactivo antes de usar y almacenar a 4 ° C.
    1. Utilizar una membrana de ultrafiltración con límite de corte de 10 kDa (véase Tabla de materiales). Colocar 350 μl de buffer de diálisis 4 μL de 32 unidades de ADN polimerasa, 2 μl de 30 unidades de la transcriptasa reversa y 2 μl de 80 unidades de inhibidor de la Rnasa a membrana de ultrafiltración y centrifugar a 14.000 xg por 5 min a 4 ° C.
    2. Añadir otro 350 μl de buffer de diálisis a la membrana de la ultrafiltración y la centrífuga (14.000 x g) por 5 min otra vacía el tubo de la colección y repita este paso, luego centrifugar (14.000 x g) durante 3 minutos.
    3. La elución, invierta la membrana y coloque en un tubo nuevo de la colección. Centrifugado a 1.000 x g durante 2 min medir el volumen de elución; Si menos de 8 μl, llevar el volumen hasta 8 μl mediante la adición de buffer de diálisis. Almacenar la elución a 4 ° C y proceder inmediatamente al siguiente paso.
      Nota: Este protocolo para la liofilización de tubo único, pero preparar los tubos de reacción por lo menos 10 a la vez utilizando la misma membrana de ultrafiltración y utilizar la misma cantidad de buffer de diálisis.
  3. Mezclar 10 μl de cebador de lámpara X 10 si singleplex (para 3-plex, añadir 10 μl de cada 10 X mezcla de cartilla), 14 μl de mezcla de dNTP, 8 μl de mezcla de enzima dializado, 2 μl de 2 unidades de UDG termolábil y 66 μl de nucleasa libre de agua (para 3-plex utilizar 46 μL) en un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL y deja la tapa abierta. En su lugar, añadir otra tapa punza con una aguja para permitir que el vapor se escape.
  4. Inmediatamente congelar los tubos a-80 ° C por 2 h y liofilizar el tubo de 4 h. tapa de la cámara de liofilización con papel de aluminio para protección de la luz. Cuando los reactivos se desecan, quite las tapas del pinchado, cierre la tapa original y almacenar los tubos con reactivos liofilizados a 4 ° C en la oscuridad.
    Nota: Los reactivos se liofilizado durante la noche, si es necesario.

7. prueba liofilizado RT-LAMP reactivos en orina y muestras de mosquitos que contengan Zika

  1. Utilice los siguientes elementos del kit (véase la Tabla de materiales) para Zika: liofilizado de un cuadro de observación 3D impreso con naranja (filtro pase largo, corte en ~ 540 nm), 2 pilas AAA para la observación de la caja, tubos de reacción con la etiqueta ZV para detección de Zika, y 1.1 X la rehidratación Buffer en tubos de tapa de rosca de 1,5 mL.
  2. Preparar 50 mL de 1.1 X buffer de la rehidratación mediante la mezcla de 5,5 mL de 10 X buffer de amplificación isotérmica que viene junto con la polimerasa de la DNA (véase la Tabla de materiales), 3,3 mL de 100 mM de MgSO4110 μl de 0,5 M TDT y 41,09 mL de agua libre de nucleasa. Mezcla bien, alícuota 1 mL de esta solución a tubos de 1,5 mL tapa de rosca y almacenar a 4 ° C hasta su uso.
  3. Agregar 90 μl de tampón de rehidratación de 1.1 X a cada tubo de reacción (0,5 mL). Asegúrese de que el líquido llena la parte inferior del tubo que contiene los reactivos liofilizados (disolver con mezcla por agitación, entonces brevemente desactivación (1.000 x g)). Añadir 10 μl de muestra de orina enriquecida con el ARN viral en los tubos de reacción (véase la sección 4.1 para más detalles).
    1. Si pruebas los mosquitos, añada un rectángulo de papel Q sostiene mosquito canales (ya preparada en los pasos descritos en las secciones 5.2 y 5.3), junto con 10 μL agua en lugar de las muestras de orina purificada.
      Nota: Como alternativa, agregue 10 μl de las muestras de suero o saliva en vez de orina. Si las muestras son extraído DNA o RNA, añadir 2-5 μl de la muestra en la mezcla de rehidratado y completar con agua libre de nucleasas hasta 10 μl de volumen de la muestra final.
  4. Cierre la tapa de los tubos de reacción. Colocar en un baño de bloque de calor (o incubadora) pre-establecido a 65-68 ° C. Incubar por 30-45 min, pero no más de 1 h. Después de la incubación, retirar el tubo del fuego. Para evitar la contaminación de los ensayos futuros, asegurar que estos tubos permanecen cerrados.
  5. Colocar los tubos de reacción en el cuadro de observación; la temperatura descienda a la temperatura ambiente (preferiblemente 25 º C). Encienda el interruptor en la parte posterior de la caja de observación. Observar la muestra a través del filtro naranja y capturar la imagen con una cámara de teléfono celular que se lleva a cabo a una distancia donde la imagen llena el 80% del campo de visión.
    Nota: Mejor visualización se logra en ambientes de luz baja.
  6. Después de completa la visualización, apague el interruptor. Almacenar los tubos cerrados en la oscuridad, preferiblemente con refrigeración, si es necesario la visualización más adelante.

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Results

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Inicialmente, las actuaciones de cada cartilla RT-LAMP (tabla 1) con su correspondiente sustrato de RNA viral así como controles negativos fueron evaluadas por electroforesis en gel. Cartillas de RT-LAMP fueron diseñados para región objetivo de NS5 (RNA polimerasa dependiente de RNA) de Zika y Dengue 1 y nsP2 región (no-estructural proteínas P2) de Chikungunya. Las plantillas eran ARN total extraído de las poblaciones virales cultivadas en células de mono verde africano (...

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Discussion

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Virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika, chikungunya y dengue amenazan la salud pública y la reciente Zika brotes resaltan la necesidad de alternativas de detección del punto de atención de bajo costo para el diagnóstico del paciente, así como para la vigilancia de mosquitos. Se desarrollaron métodos de amplificación isotérmica como alternativas asequibles a los sistemas de polimerización en cadena-basado. Particularmente, las plataformas basadas en RT-lámpara se han aplicado para detectar una amplia gama de pa...

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Disclosures

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Varios de los autores y sus instituciones poseen propiedad intelectual asociada a este ensayo.

Acknowledgements

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El trabajo fue apoyado en parte por 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 y NIAID. Investigación en esta publicación fue apoyada en parte por los institutos nacionales de alergias y enfermedades infecciosas y en parte por biomédica investigación programa de Florida Departamento de salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales del Florida Department of Health o NIH. LLC de química combinatoria dinámica es reconocido por su apoyo y contribución a este proyecto.

El virus del dengue 1 (cepa KW010 BOL) fue proporcionado por el Departamento de Florida de salud oficina de laboratorios. Zika virus y el linaje asiático del virus chikungunya fueron proporcionados gentilmente por los centros de Control y prevención de enfermedades. El linaje del océano Índico de virus chikungunya fue amablemente proporcionado por Robert Tesh (centro de referencia mundial de virus emergentes y arbovirus, a través de la rama médica de la Universidad de Texas en Galveston, Texas) a la UF-FMEL. Agradecemos a S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, Velez D., K. Wiggins, ZimLer r. y K. Zirbel para obtener ayuda con los estudios de la infección. También agradecemos a M. S. Kim por proporcionar papel de Q.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Iluminador SafeBlue / Sistema de electroforesis, MBE-150-PLUSCiencia principalMBE-150Electroforesis en gel
G:BOX F3SyngeneG:BOX F3Imágenes en gel
LightCycler 480 Instrument II, 96 pocillosRoche Applied Science05 015 278 001PCR en tiempo real
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 con membrana Ultracel-10Millipore SigmaUFC501096membrana de ultrafiltración para diálisis
Centrífuga Eppendorf 5417C CentrífugaMarshall ScientificEP-5417C
Myblock Mini baño secoBenchmark ScientificBSH200baño seco
FreeZone Plus 6 litros Consola en cascada Sistema de liofilizaciónLabconco7934020liofilizador
todos los priers y sondasIDTpersonalizadoRT-LAMP cebadores y sondas
dNTP setBiolineBIO-39049
Trifosfato de desoxiuridina (dUTP)PromegaU1191
Bst  2.0 WarmStart  ADN polimerasaNew England BiolabsM0538Lenzima
WarmStart RTx transcriptasa inversaNew England BiolabsM0380Lenzima
Inhibidor de ARNasa, murinoNew England BiolabsM0314Lenzima
Antártida termolábil UDGNew England BiolabsM0372Lenzima
50bp Escalera de tijera de ADNPromegaG4521marcador
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, blancoRoche Applied Science4729692001análisis RT-LAMP en tiempo real

References

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