Artículo de método

La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

DOI:

10.3791/57051

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13 de marzo de 2018

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1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

En este artículo

Resumen

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Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

Resumen

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Zika, el dengue y el chikungunya virus son transmitidos por mosquitos, que causan enfermedades con sintomatología similar. Sin embargo, tienen potencialidades diferentes aguas abajo transmisión de paciente a paciente y requieren tratamientos de pacientes muy diferentes. Así, los brotes recientes de Zika hacen urgente a desarrollar herramientas que discriminan rápidamente estos virus en pacientes y atrapados los mosquitos, el correcto tratamiento de los pacientes y para comprender y manejar su epidemiología en tiempo real.

Desafortunadamente, pruebas de diagnóstico actuales, incluyendo ésos emergencia de 2016 recibe autorizaciones de uso y rápido estado, detectar ARN viral por transcripción reversa reacción en cadena polimerasa (RT-PCR), que requiere instrumentación, formación usuarios, y preparación de la muestra considerable. Por lo tanto, deben enviarse a laboratorios de referencia "aprobado", que requiere tiempo. De hecho, en agosto de 2016, el centro para el Control de enfermedades (CDC) estaba pidiendo que las mujeres embarazadas que había sido mordido por un mosquito y desarrolló una erupción de Zika indicando esperar un inaceptable 2 a 4 semanas antes del aprendizaje si estaban infectados. Mucho necesitamos pruebas que se pueden realizar en sitio, con pocos recursos y por personal entrenado pero no necesariamente con licencia.

Este video muestra un ensayo que cumpla con estas especificaciones, trabajando con orina o suero (para pacientes) o cadáveres de mosquitos aplastados (para la vigilancia ambiental), sin mucha preparación de la muestra. Cadáveres de mosquitos son capturados en papel con amonio cuaternario grupos (Q-papel) seguidos por el tratamiento de amoníaco para la gestión de riesgos biológicos. Estos son entonces directamente, sin el aislamiento de RNA, puestos en tubos de ensayo con reactivos liofilizados que ninguna cadena de refrigeración. Una forma modificada de amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa con sondas desplazables fluorescente etiquetas específico del destino produce lectura, en el minuto 30, como una señal de la fluorescencia tricolor. Esto se visualiza con un dispositivo portátil, con pilas con un filtro naranja. Contaminación hacia adelante se previene con tubos cerrados y el uso de termolábiles uracil ADN glicosilasa (UDG) en presencia de dUTP en la mezcla de amplificación.

Introducción

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Infecciones de virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika virus, dengue y chikungunya son en las estrategias de manejo inmediato de aumento y la demanda. Dengue y chikungunya virus ya son endémicos en muchas de las regiones tropicales donde Zika ahora se extiende en el hemisferio occidental1. Zika virus, como el dengue, es un miembro de la familia Flaviviridae y es nativo a África con un asiático y dos linajes genéticos africanos2. A pesar de la identificación del virus Zika se remonta a 1947, Zika infección en seres humanos seguía siendo esporádica por medio siglo antes de emerger en el Pacífico y las Am....

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Protocolo

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Nota: Los mosquitos eran los únicos animales directamente utilizados en este estudio. Los procedimientos para manejar pollos, cuya sangre se utilizó para la alimentación de los mosquitos infectados, fueron aprobados como IACUC protocolo #201507682 por la propagación de atención Animal institucional de la Universidad de Florida y Committee.Virus de uso y estudios de infección del mosquito fueron realizado en las instalaciones del BSL-3 del laboratorio de Entomología médica de Florida en Vero Beach, FL. RT-LAMP experimentos fueron realizados en el laboratorio BSL-2 compartido por FfAME y Firebird Biomolecular Sciences LLC en Alachua, FL.

1. dis....

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Resultados

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Inicialmente, las actuaciones de cada cartilla RT-LAMP (tabla 1) con su correspondiente sustrato de RNA viral así como controles negativos fueron evaluadas por electroforesis en gel. Cartillas de RT-LAMP fueron diseñados para región objetivo de NS5 (RNA polimerasa dependiente de RNA) de Zika y Dengue 1 y nsP2 región (no-estructural proteínas P2) de Chikungunya. Las plantillas eran ARN total extraído de las poblaciones virales cultivadas en células de mono verde africano (.......

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Discusión

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Virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika, chikungunya y dengue amenazan la salud pública y la reciente Zika brotes resaltan la necesidad de alternativas de detección del punto de atención de bajo costo para el diagnóstico del paciente, así como para la vigilancia de mosquitos. Se desarrollaron métodos de amplificación isotérmica como alternativas asequibles a los sistemas de polimerización en cadena-basado. Particularmente, las plataformas basadas en RT-lámpara se han aplicado para detectar una amplia gama de pa.......

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Divulgaciones

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Varios de los autores y sus instituciones poseen propiedad intelectual asociada a este ensayo.

Agradecimientos

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El trabajo fue apoyado en parte por 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 y NIAID. Investigación en esta publicación fue apoyada en parte por los institutos nacionales de alergias y enfermedades infecciosas y en parte por biomédica investigación programa de Florida Departamento de salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales del Florida Department of Health o NIH. LLC de química combinatoria dinámica es reconocido por su apoyo y contribución a este proyecto.

El virus del dengue 1 (cepa KW010 BOL) fue proporcionado por el Departamento de Florida de salud oficina de laboratorios.....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Iluminador SafeBlue / Sistema de electroforesis, MBE-150-PLUSCiencia principalMBE-150Electroforesis en gel
G:BOX F3SyngeneG:BOX F3Imágenes en gel
LightCycler 480 Instrument II, 96 pocillosRoche Applied Science05 015 278 001PCR en tiempo real
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 con membrana Ultracel-10Millipore SigmaUFC501096membrana de ultrafiltración para diálisis
Centrífuga Eppendorf 5417C CentrífugaMarshall ScientificEP-5417C
Myblock Mini baño secoBenchmark ScientificBSH200baño seco
FreeZone Plus 6 litros Consola en cascada Sistema de liofilizaciónLabconco7934020liofilizador
todos los priers y sondasIDTpersonalizadoRT-LAMP cebadores y sondas
dNTP setBiolineBIO-39049
Trifosfato de desoxiuridina (dUTP)PromegaU1191
Bst  2.0 WarmStart  ADN polimerasaNew England BiolabsM0538Lenzima
WarmStart RTx transcriptasa inversaNew England BiolabsM0380Lenzima
Inhibidor de ARNasa, murinoNew England BiolabsM0314Lenzima
Antártida termolábil UDGNew England BiolabsM0372Lenzima
50bp Escalera de tijera de ADNPromegaG4521marcador
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, blancoRoche Applied Science4729692001análisis RT-LAMP en tiempo real

Referencias

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  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636(2014).
    3. ....

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