Investigación de la síntesis de RNA utilizando 5-Bromouridine etiquetado e inmunoprecipitación

Summary

Este método puede utilizarse para medir la síntesis de ARN. 5-Bromouridine se añade a las células e incorporado en el RNA sintetizado. Síntesis de ARN se miden por la extracción de RNA inmediatamente después del etiquetado, seguido de la inmunoprecipitación de 5 Bromouridine-orientada con RNA y análisis por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.

Abstract

Cuando se comparan los niveles de estado estacionario RNA entre dos condiciones, no es posible distinguir si los cambios son causados por alteraciones en la producción o degradación de RNA. Este protocolo describe un método para la medición de la producción de RNA, utilizando 5-Bromouridine etiquetado de RNA seguido por la inmunoprecipitación, que permite la investigación de ARN sintetizado en un corto plazo (p. ej., 1 h). La ventaja de 5-Bromouridine-etiquetado e inmunoprecipitación sobre el uso de tóxicos inhibidores transcripcionales, como α-amanitin y actinomicina D, es que hay no o muy poco efectos sobre la viabilidad celular durante el uso a corto plazo. Sin embargo, porque 5-Bromouridine-inmunoprecipitación solo captura RNA producido en el corto plazo etiquetado, producido lentamente como degrada rápidamente RNA puede ser difícil de medir por este método. El RNA marcado con el 5-Bromouridine capturado por la 5-Bromouridine-inmunoprecipitación puede analizarse por transcripción reversa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y secuencia de la generación siguiente. Todos los tipos de ARN pueden ser investigados, y el método no se limita a medir mRNA como se presenta en este ejemplo.

Introduction

5-Bromouridine (BrU) inmunoprecipitación (IP) permite el estudio de la producción de RNA en células con n o efectos muy limitados sobre la fisiología de la célula durante el breve período^1,2de etiquetado. El método se basa en la incorporación del derivado sintético de la uridina BrU en el RNA recién sintetizado seguido por IP de ARN marcada con anticuerpos anti-BrU (figura 1).

Se ha sabido por décadas que la síntesis de proteínas puede ser regulada transcripcionalmente, y la existencia de factores de transcripción fue presumida hace más de 50 años

Protocol

Nota: Realizar todos los pasos a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario y mantener reservas en hielo o en el frigorífico (excepto de la elución de búfer que contienen SDS). El protocolo se divide en 5 secciones: las muestras de la preparación de RNA; preparación de granos para IP; Unión de la ARN BrU-labelled para granos; elución y purificación de RNA encuadernado BrU-etiquetados por extracción con fenol-fenol/cloroformo-cloroformo 3 pasos; Análisis de ARN (en este ejemplo utilizando RT-qPCR)

1. preparación de las muestras de RNA

1. Las células HEK293T cuenta con una célula automatizada el contador y la semilla 3.50....

Results

Nuestras pruebas iniciales de tiempo etiquetado BrU fueron realizados en células AsPC-1. Las células fueron tratadas con BrU, para 0, 1, 2 y 4.5 h, seguida por la extracción de RNA total y BrU-IP. Midieron a GAS5 y GAPDH en el ARN de BrU-IP, que ha demostrado que 1 h etiquetado era suficiente para alcanzar un cambio aproximadamente 9 - y 44 veces en comparación con fondo (0 h) de GAPDH y GAS5, respectivamente.

BrU-IP y el anális.......

Discussion

Este protocolo describe el uso de BrU-IP para determinación de la producción de RNA por etiquetado de nuevo produce RNA para 1 h con BrU, seguido por la inmediata extracción de RNA e inmunoprecipitación de ARN marcado con BrU. Este método ha sido descrito previamente en la referencia¹⁶, y este artículo incluye algunos pasos adicionales para aumentar la especificidad IP y pureza del RNA, por granos pre-tratamiento con concentraciones bajas de BrU, así como un paso de purificación de fenol-cloroform.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhibidor de la Rnasa Ribolock	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 Ovejas anti-ratón IgG	Life Technologies	11202D
α-Bromodeoxyuridina anticuerpo de ratón	BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		Espectrofotometría ultravioleta-visible
Fenol saturado con agua pH 6,6	ThermoFisher	AM9712
Fenol:Cloroformo:IAA 25:24:1 pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
Kit de aislamiento de ARN de alta pureza	Roche	11828665001
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Sondas de ARN Taqman	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	Sondas flurgénicas
7500 Sistema rápido de PCR en tiempo real	Applied Biosystems
HEK293T línea celular	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Lonza	BE12-604F
Suero fetal de ternero	Biochrom	S0115
Penicilina/Estreptomicina	Biochrom	A2213
Tampón			5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 y 136,8 mM NaCl pH 6,77, esterilizado en autoclave.
DEPC-H2O			0,1% con dietilpirocarbonato tratado con H2O
Tampón 2xBrU-IP 40			mM Tris-HCl pH 7,5 y 500 mM NaCl en DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibidor			2xBrU-IP tampón 2xBrU-IP suplementado con 1 μ g/μ L BSA y 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL de heparina			2xBrU-IP tampón diluido 1:1 DEPC-H2O y suplementado con 1mg/mL de heparina
1xBrU-IP			2xBrU-IP tampón diluido 1:1 en DEPC-H2O y suplementado con 0,5 μ g/μ L BSA y 20 U/mL de
tampón			0,1% SDS en H2O libre de ARNasa