Artículo de método
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En este trabajo, describimos protocolos para investigar el papel de las vesículas extracelulares (EVs) liberado por los eritrocitos Plasmodium falciparum infectados. En particular, nos centramos en las interacciones de EVs con las células endoteliales.
La malaria es una enfermedad potencialmente mortal causada por parásitos de Plasmodium , p. falciparum siendo la más frecuente en el continente africano y responsable de la mayoría de las muertes relacionadas con el paludismo a nivel mundial. Varios factores, incluyendo el secuestro de parásito en los tejidos, disfunción vascular y las respuestas inflamatorias influyen en la evolución de la enfermedad en personas infectadas por la malaria. P. falciparum-glóbulos rojos infectados (iRBCs) liberar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) que contiene diferentes tipos de carga moléculas que median la comunicación celular y patogénesis entre parásitos y huésped. EVs se toman eficientemente por las células en las que modula su función. Aquí se discuten estrategias para abordar el papel de EVs en las interacciones huésped parásito. En primer lugar, se describe un método sencillo para el etiquetado y seguimiento EV internalización por las células endoteliales, usando un tinte de vinculador de celda verde. En segundo lugar, se presenta una forma sencilla de medir permeabilidad en una monocapa de células endoteliales mediante el uso de un fluorescente etiquetado dextrano. Por último, os mostramos cómo investigar el papel de pequeñas moléculas de ARN no codificante en función de la célula endotelial.
Según la Organización Mundial de la salud, había 212 millones de nuevos casos de malaria en todo el mundo en 2015 y aproximadamente 429.000 personas murieron, principalmente a niños menores de cinco años de edad1. Los mecanismos que conducen a la enfermedad severa, que a menudo se asocia con disfunción vascular, siendo mal definidas2. Plasmodium- iRBCs secretan esferas pequeñas de bi-lípidos de membrana conocidas como vesículas extracelulares (EVs). Es sabido que los EVs son potencialmente relevantes para el proceso de infección y la respuesta inmune del huésped a la infección; sin embargo, poco se sabe sobre la....
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Glóbulos rojos humanos fueron obtenidos de la sangre de donantes sanos, siguiendo las directrices de Swissethics (swissethics.ch).
Nota: Culturas de parásito p. falciparum (3 7) y la producción de EV fueron descritos previamente en Mbagwu, et al. 11 debido a p. falciparum es un patógeno humano, consulte las normas locales para el manejo. Las culturas deben conservarse estéril todo el tiempo.
1. fluorescencia de etiquetado de los vehículos eléctricos
Nota: El siguiente procedimiento aprovecha la tecnología de etiquetado estable incorporac....
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Aquí, describimos protocolos para investigar las interacciones de EVs con las células del huésped. La absorción de la fluorescencia etiquetadas EVs es supervisada por microscopía confocal (figura 1). Las células endoteliales toman eficientemente EVs, sin embargo el tiempo de incubación con EVs puede optimizarse para el seguimiento de la absorción. Para una mejor localización de los vehículos eléctricos dentro de las células, mancha de actina con phalloidin. A.......
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Varias parásitos, incluyendo el Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania y Trichomonas desencadenan la liberación de los vehículos eléctricos por la célula huésped infectada. Dependiendo de los patógenos, el EVs liberado puede modular la respuesta inmune del huésped o median la comunicación celular entre los parásitos6. Sin embargo, hay poca evidencia que sugiere cómo estas vesículas pequeñas contribuyen a la enfermedad de la malaria. Aquí, hemos descrito varias maneras de investigar la función de los .......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Este estudio fue apoyado en parte por la Fundación Novartis para el médico y biológico investigación (PYM), el Gottfried y Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW y PYM) y el grupo de investigación de la Universidad de Friburgo (a PYM). Subvenciones adicionales incluyen las becas de excelencia de gobierno suizo para académicos extranjeros (a KAB y SM). Agradecemos a Isabelle Fellay y Solange Kharoubi Hess para el soporte técnico.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PKH67 Verde Enlazador de Celdas Fluorescentes Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluyente C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Faloidina CF594 | Biotio | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Mountant Antidecoloración | ThermoFisher | P36934 | |
| Isotiocianato de rodamina B– Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Inserto con membrana de PET Falcon transparente para placa de 24 pocillos | Falcon | 353095 | |
| Crecimiento de células endoteliales Medio MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromicina diclorhidrato | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Kit de ensayo colorimétrico de proliferación celular | Biovision | K300-500 | |
| bromuro de hexadimetrina | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION MicroARN de Lenti, Humano has-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISIÓN MicroARN de Lenti, ath-miR416, Partículas de transducción de control negativo 1 | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISIÓN MicroARN de Lenti, | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan Kit de transcripción inversa de microARN 1000 reacciones | ThermoFisher | 4366597 | |
| has-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, con UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Sistema de PCR en tiempo real | ThermoFisher | 4376600 |
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