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Artículo de método

Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis

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DOI:

10.3791/57077

⸱

24 de mayo de 2018

 ,  , 
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine, Washington State University

En este artículo

Resumen

Este método muestra cómo visualizar la invasión del patógeno en las células de los insectos con modelos tridimensionales (3D). Hemocitos de larvas de Drosophila estaban infectadas con patógenos virales o bacterianos, o ex vivo o en vivo. Hemocitos infectados luego fijados y teñidos para la proyección de imagen con un microscopio confocal y la posterior reconstrucción celular 3D.

Resumen

Durante la infección patógena de Drosophila melanogaster, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta inmune durante la infección. Así, el objetivo de este protocolo es desarrollar un método para visualizar la invasión del patógeno en un compartimiento inmune específico de las moscas, es decir, hemocitos. El método presentado aquí, 3 × 106 vivo hemocitos pueden obtenerse 200 larvas de Drosophila 3rd estadio en 30 min para la infección ex vivo . Alternativomente, hemocitos pueden ser infectado en vivo a través de la inyección de 3 larvas de estadiord seguido por extracción hemocyte a la infección después de 24 h. Estas células infectadas de la primaria fueron fijadas, teñidos y reflejada usando microscopia confocal. Entonces, se generaron representaciones 3D de las imágenes para mostrar definitivamente la invasión de patógenos. Además, se puede obtener RNA de alta calidad para qRT-PCR para la detección de siguiente de mRNA de patógeno infección y suficiente proteína pueden ser extraído de estas células para el análisis de Western blot. Tomados en conjunto, se presenta un método para la reconciliación definitiva de la invasión de patógenos y confirmación de la infección con tipos de patógeno bacterianos y virales y un método eficiente para la extracción de hemocyte obtener suficiente energizados hemocitos de Drosophila larvas para experimentos de infección ex vivo e in vivo .

Introducción

Drosophila melanogaster es un organismo modelo bien establecido para el estudio de la inmunidad innata1. Durante la respuesta inmune innata, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta al desafío de patógeno. Hemocitos son cruciales para el encapsulamiento de parásitos, así como tener una función importante en la lucha contra el patógeno a través de la acción fagocítica durante la infección por hongos, virales y bacterianas2,3.

Para mejor entender la respuesta inmune innata del hospedador a la infección microbiana patógena, es importante visualizar cómo el patógeno invade las células del huésped durante la infección. Esta visualización contribuye a una comprensión del mecanismo de invasión. Junto con los datos de localización intracelular del patógeno y la respuesta celular, estos datos pueden proporcionar pistas sobre la respuesta del huésped a la infección y los orgánulos celulares con los cuales interactúa el microbio. Por lo tanto, reconstrucción 3D modelo después de la proyección de imagen por microscopia puede ser útil para determinar la ubicación precisa de los patógenos en las células del huésped. En este estudio, visualizamos la invasión de Coxiella burnetii (C. burnetii), el agente causal de la fiebre Q, una enfermedad zoonótica que plantea una grave amenaza para la salud humana y animal, en primarias hemocitos de Drosophila . Recientemente, se demostró que la Drosophila son susceptibles al nivel de bioseguridad 2 fase nueve milla II (NMII) clon 4 cepa de C. burnetii y que esta cepa es capaz de replicarse en Drosophila4, indicando Drosophila puede utilizarse como un organismo modelo para estudiar la patogenesia de C. burnetii .

Estudios previos han utilizado hemocitos para examinar la respuesta inmunológica innata del hospedador. Hemocitos se han utilizado para observaciones morfológicas5,6,7, morfométricos análisis2,8, fagocitosis análisis2,3, qRT-PCR2 , 9, inmunoprecipitación10,11, análisis inmunofluorescente10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e immunohistochemistry9,14. Aunque las células S2 de Drosophila también están disponibles para varios experimentos en vitro , inmortalización y potencial infección viral existente cambian su comportamiento15,16. El uso de pilas en lugar de una línea celular inmortalizada, como células de S2, permite el estudio de la función inmune innata en un sistema más representativo de todo el organismo. Además, la infección de hemocitos en vivo, antes de la extracción, permite a las células interactuar con otras proteínas de host y el tejido, una ventaja sobre extracción de hemocitos antes infección ex vivo . Un número de diferentes métodos se han utilizado para obtener un número suficiente de hemocitos en un corto período de tiempo para mantener los hemocitos vivo8,17,18,19.

En este estudio, se presenta un método para extraer hemocitos de larvas de Drosophila 3rd estadio de infección microbiana patógena con C. burnetii, Listeria monocytogenes (listeriosis) o invertebrados iridiscente Virus 6 (IIV6). Se describen los métodos para las infecciones hemocyte tanto in vivo y ex vivo . In vivoy ex vivo-hemocitos infectados fueron visualizadas con microscopía confocal y usados para construir modelos 3D de invasión de C. burnetii . Además, usando el protocolo de extracción, ex vivo-hemocitos infectados fueron utilizados para la expresión de gene y proteína ensayos. Específicamente, para examinar el grado de infección por IIV6 y Listeria, proteína o RNA total fue aislada de las células para qRT-PCR o análisis de Western blot. Tomados en conjunto, el protocolo proporciona métodos para recolectar rápidamente un número elevado de hemocitos de 3 larvas de estadio de lard y evidencia que los hemocitos primarias, infectado ya sea en vivo o ex vivo, son una plataforma conveniente para microbiana estudios de infección de los patógenos y análisis posteriores aplicables como la microscopía, transcriptómica y proteómica.

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Protocolo

1. infección ex vivo

  1. Y aparatos
    1. Bajo condiciones estériles, preparar fresco Drosophila Hemocyte aislamiento medio (DHIM) que contiene de 75% Schneider Drosophila medio 25% suero bovino Fetal (FBS) y filtro de esterilización lo.
    2. Capa de 2-3 pedazos de la película de parafina 10 cm x 10 cm bajo un estereomicroscopio.
    3. Preparar el tubo capilar de vidrio. Ajuste el tirador capilar a 55% del máximo. Tire el tubo capilar a un punto agudo de aproximadamente 10 μm.
    4. Relleno capilar con aceite mineral.
    5. Ensamble tubo capilar lleno en el nanoinjector (figura 1A) y abra punta fundida tubo capilar interrumpiendo la punta con pinzas (figura 1B). El diámetro externo de la punta debe ser de 100 μm para la fácil absorción de los hemocitos.
    6. Extraer tanto petróleo como sea posible de la extremidad del tubo capilar, luego llene con DHIM. Para la fácil visualización de la frontera para arriba-tomado de la hemolinfa y el aceite, incluyen una burbuja de aire entre el aceite y DHIM (figura 1B').
  2. Extracción de la hemolinfa
    1. Escoger 3rd instar larvas de Drosophila del interior pared de comida los frascos suavemente con unas pinzas y colocarlos en un colador 100 de μm (figura 1C). 3 larvas de estadio de lard se encuentran 3-6 días siguientes ponedora fértil de una hembra adulta.
      Nota: Estos experimentos utilizan el genotipo, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, puesto que los hemocitos de estos animales expresan mayor proteína verde fluorescente (EGFP) para ayudar en la identificación de las células por microscopía.
    2. Vierta 5 mL de agua estéril sobre larvas y agitar el colador durante 5 s. Coloque el colador sobre paño de tarea eliminar el exceso de agua (figura 1C').
    3. Transferencia de las larvas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Anestesiar con CO2 gas para 5 s (figura 1D).
    4. Coloque las larvas en la película de parafina bajo el estereomicroscopio, con el lado dorsal hacia arriba (figura 2A).
    5. Lugar el vidrio capilar ligeramente sobre el cuerpo posterior larvas para mantener en su lugar y alterar la cutícula posterior abre con unas pinzas de punta finas (figura 2B).
    6. Permita que la hemolinfa fluir en la película de parafina (figura 2C).
    7. Hacer una piscina de hemolinfa incluyendo hemocitos de larvas de 20-50 en un momento en la película de parafina.
    8. Tienen hemolinfa combinado con el vidrio capilar en el nanoinjector (figura 2D).
      Nota: Debe haber aproximadamente 10-20 μl de hemolinfa.
    9. Expulsar la hemolinfa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL conteniendo 500 μl de DHIM (figura 2E).
    10. Repita los pasos 1.2.4) - 1.2.9) para cada lote de larvas.
  3. Contar el número de hemocitos.
    1. Pipeta de 5 μl de solución de azul de tripano 0.4% en un tubo de microcentrífuga de 0.6 mL para teñir las células muertas. Suavemente mezcle el DHIM y hemocitos en el tubo de 1,5 mL con una pipeta y transferir 5 μl de DHIM incluyendo hemocitos en el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL y mezclar suavemente.
    2. Pipetear 10 μl de células a partir de la mezcla 1:1 Trypan azul: hemocyte en el hemocitómetro.
    3. Contar el número de hemocitos vivo que no son manchó con Trypan azul en cada uno de los campos 4 esquina de la hemocytomter y calcular la concentración de los hemocitos por mililitro con la fórmula:
      figure-protocol-1
      donde X es la concentración de hemocitos vivo por mililitro; a, b, c y d se contó el número de células vivas (según lo determinado por la exclusión del azul tripán) en cada 4 de los campos en el hemocitómetro. División por 2 el número total de células contadas es debido a la dilución de 1:1 de las células con azul tripán. Células teñidas con Trypan azul se consideran muertas.
  4. Ex vivo Infecciones
    1. Determinar el número de pozos a ser sembradas con las células basadas en puntos de tiempo y biológico Replica para cada experimento. 5.0 × 104 hemocitos son deseables para la purificación de RNA y proteínas después de la infección.
    2. Calcular el volumen de acción del patógeno a diluirse con DHIM para infección usando la siguiente fórmula:
      figure-protocol-2
      Cuando multiplicidad de infección (MOI) es el número de virus o bacterias deseado por la célula.
      Nota: MOI utilizado depende de la experiencia individual y ensayos realizados. Aquí, 10 equivalentes de genoma (GE) / células de C. burnetii, 10 CFU/células de Listeriao 1 TCID50/cell de IIV6 fue utilizado.
    3. Preparar 500 μl de medio patógeno para cada pocillo de una placa de 24 pocillos añadiendo el volumen adecuado de DHIM al volumen viral o bacteriano en un tubo.
    4. Lugar un 12 mm redondo cubierta de vidrio (no. 1 de espesor) en un pozo de una placa de 24 pocillos.
    5. Dividir el DHIM incluyendo los hemocitos en pocillos de una placa de 24 pocillos.
    6. Añadir 500 μl de medio de patógeno a hemocitos en un pozo.
    7. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante 5 minutos.
    8. Incubar la placa por 1 h a 28 ° C. Cada 15 minutos, incline suavemente la placa de atrás al frente, luego de izquierda a derecha para 5 s a mano.
    9. Después de la 1 h de paso de la invasión/accesorio 1.4.8), suavemente pipeta de medio patógeno y lavado los hemocitos con DHIM fresco y rellenarlo con 500 μl de DHIM fresco.
    10. Incubar los hemocitos infectadas durante el tiempo deseado. En estos experimentos, C. burnetii- o hemocitos IIV6 infectados se incuban durante 24 h y la Listeria-hemocitos infectados se incuban durante 1, 2 o 4 h.

2. infección in vivo

  1. Infección
    1. Caliente la placa de agar de Drosophila fruta zumo a temperatura ambiente durante 15 minutos las placas se hacen como se ha descrito20.
      1. Añadir 30 g de agar a 700 mL de agua y autoclave por 40 minutos.
      2. Disolver 0,5 g de metilparabeno en 10 mL de etanol absoluto.
      3. Añadir la solución de metil parabeno a 300 mL de jugo concentrado.
      4. Rápidamente mezclar el concentrado de jugo en la solución de agar esterilizado y añada 5 mL en 10 × 35 mm placas de Petri.
      5. Después de que las placas se han enfriado durante 15 min, almacenarlos a 4 ° C.
    2. Preparar 3rd instar larvas siguiendo pasos 1.2.1) - 1.2.3).
    3. Coloque la pasta de levadura sobre una placa de agar. Hacer un corte fino en la placa de agar donde las larvas pueden migrar a evitar que se sequen (figura 3A). Montar una aguja de punta de tungsteno de 0,001 mm sosteniendo pinzas usando la película de parafina (figura 3B, C).
    4. Pipetee 50 μl de alto-título mCherry expresando -C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL) sobre la parafina de la película bajo el microscopio estéreo y coloque las larvas en la piscina de bacterias.
    5. Coloque las larvas en la piscina de bacterias. Las larvas del pinchazo con una aguja de tungsteno (figura 3D). La transferencia de las larvas en una placa de agar (figura 3E).
    6. Transfiera el medio restante del patógeno sobre la placa de agar y sellar la placa con la película de parafina.
    7. Mantenga las larvas en la placa en el aire húmedo hasta que la post-infección tiempo deseado (figura 3F). En este experimento, C. burnetii-larvas infectadas están en la placa de 24 h.
  2. Extracción de la hemolinfa y galjanoplastia de hemocitos
    1. Preparar el medio y el equipo siguiente paso 1.1).
    2. Lugar un 12 mm redondo cubierta de vidrio (no. 1 de espesor) en un pozo de una placa de 24 pocillos. Pipetear 500 μl del DHIM en el pozo.
    3. Extraer la hemolinfa de las larvas infectadas siguiendo pasos 1.2.4) - 1.2.8).
    4. Expulsar la hemolinfa en el pozo siguiente paso 2.2.2).
    5. Repetición de 2.2.3) y 2.2.4) para varios lotes de larvas.
    6. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante 5 minutos.

3. visualización

  1. Fijación y tinción
    1. Después de permitir que los hemocitos a posarse sobre la cubierta redonda de vidrio en el pozo, retire suavemente el medio de cada pozo.
    2. Suavemente, añadir 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) en cada pocillo de hemocitos colocados. Incubar los hemocitos por 20 min a temperatura ambiente.
    3. Quitar el 4% PFA y suavemente agregar 200 μL de PBS con un 0.1% Tritón X-100 y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) a cada pocillo. Incubar los hemocitos durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Retirar el PBS y suavemente agregar 200 μL de 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a cada pocillo. Incubar los hemocitos durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
    5. Retirar la solución DAPI y añadir suavemente el PBS a cada pocillo. Incubar los hemocitos por 5 min a temperatura ambiente.
    6. 10 μl de medio de montaje antifade la gota en un portaobjetos de vidrio.
    7. Después de retirar el PBS de cada bien, quitar el cristal de la cubierta de la placa de 24 pocillos con unas pinzas de punta fina. Coloque suavemente el vidrio de cubierta en el medio de montaje antifade en la diapositiva de cristal, con los hemocitos hacia abajo.
    8. Permita que el portaobjetos se seque colocándolo en la noche oscura.
  2. Proyección de imagen confocal
    1. Configuración del microscopio confocal para tres imágenes de color de DAPI, EGFP y mCherry. Utilice la siguiente configuración: excitación de DAPI (ex) 405 nm, emisión (em) 415-480 nm. EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
    2. Coloque la muestra en el microscopio y el enfoque en la muestra usando un 63 X / 1.4 objetivo de la apertura numérica (NA). Busque hemocitos deseadas en el campo de visión para la proyección de imagen.
    3. Ajustar ganancias poder y detector de láser para lograr la exposición correcta de la muestra. Revise varios z-planos para garantizar que el nivel de exposición es apropiado para el grosor de la muestra entera.
    4. Encontrar la posición superior e inferior en el eje z de un hemocyte todo. Establecer estas posiciones como las posiciones inicial y final para seccionamiento de z.
    5. Sólo utilice análisis zoom a la imagen el área que contiene el hemocyte. A menudo se utilizan factores de zoom de 3 X.
    6. Recoge la serie de imagen en resolución adecuada como 1024 x 1024 píxeles en el plano x-y y 0,3 μm espaciado en la dimensión z.
  3. Reconstrucción de modelos 3D
    Nota: El software de código abierto existe que realiza muchas de las funciones descritas para la reconstrucción de modelos 3D.
    1. Importar el archivo de la serie de imagen seccionada en z en el software asociado con el microscopio confocal para la reconstrucción de modelos 3D.
    2. Seleccione una celda que muestra la localización de núcleos teñidos con DAPI y mCherry expresando C. burnetii en un EGFP expresar hemocyte. Cultivo de la serie de imagen que contiene la célula.
    3. Seleccione la opción Visor 3D que reconstruye el modelo 3D usando algoritmo previamente empaquetado del software. Seleccione el tipo deseado de representación 3D mezcla, superficie y opciones mixtas. En este método, hemocitos, núcleos y C. burnetii se muestran utilizando modelos de superficie.
    4. Observar la célula 3D reconstruida desde varias posiciones de visualización manteniendo el botón del ratón y arrastrando el cursor por la pantalla. Ajustar la orientación de la célula y posición de la fuente de luz modelada para optimizar la imagen. Existen otras opciones de opacidad, mínimo y máximo umbral, Specular, Ambient, Shineness y Gamma para optimizar la imagen.
    5. Tomar secciones transversales a través del modelo usando comandos recorte y seccionamiento para visualizar el contenido interior de la hemocyte.

4. aplicación para el análisis del gene o proteína

  1. Después de la infección con IIV6 y Listeria, lyse las células para posterior qRT-PCR o análisis de Western blot como describieron anteriormente21 y siguiente las instrucciones.
    Nota: Consulte la Tabla de materiales para los cebadores para qRT-PCR y anticuerpos por Western blot.
  2. Analizar los productos PCR por electroforesis en gel de agarosa, como se describió anteriormente22, para asegurar la longitud adecuada del producto amplificado.

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Resultados

Para cobrar altura hemocitos para infección ex vivo de 3 × 106 hemocitos se obtuvieron de 200 larvas de Drosophila 3rd estadio. Para el desarrollo de nuestro método, se trató de un número de técnicas diferentes. Disección larvas individual llevaría hasta 1,5 h y un promedio de ~ 8000 células fueron obtenidos usando este método18, la mayoría de los cuales no estaban viva al final de la colección. A continuación, intentó extrae...

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Discusión

Para entender mejor cómo se infectan las células del huésped, es importante aclarar la localización del patógeno en las células, especialmente cuando experimenta previamente patógeno y células tipo combinaciones4. Mientras que el estudio de la cascada de la respuesta celular después de la infección puede indicar invasión patógeno productiva, la combinación de datos de respuesta de imagen y celular es esencial para demostrar la infección y la invasión de patógenos. Mientras reportes imágenes 2D de ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Estamos agradecidos con el Dr. Robert Heinzen para proporcionar reservas de expresar mCherry burnetii de la coxiella. Agradecemos a Dr. Luis Teixeira para proporcionar virus iridiscente invertebrados 6 y el centro de Stock de Bloomington para proporcionar a las poblaciones de la mosca. Este proyecto fue financiado en parte por NIH subsidio R00 AI106963 (A.G.G.) y Universidad Estatal de Washington.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Schneider's Drosophila Medium Thermo Fisher Scientific (Gibco)217200241.1.1), 2.1.2)
Suero fetal bovinoGE Healthcare Life Sciences  (HyClone)SH30070.03HI1.1.1), 2.1.2)
Filtro (0.22 y micro; L)RESTEK261581.1.1)
Colador (100 y micro; m)Greiner bio-one5420001.2.1), 2)
Microscopio estereoscópicoAmscopeSM-1BSZ-L6W1.2), 2)
Capilar de vidrioFisher Scientific21-171-41.1), 1.2), 2)
Tirador capilarNarishige International USA, Inc.PC-101.1.3)
Aceite mineralProductos1.1.4)
NanoinyectorDrummond Scientific Company3-000-2041.1), 1.2), 2.2)
PinzasVWR82027-4021.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 aparato de entregaGenesee Scientific59-122BC1.2), 2)
AzultripanoThermo Fisher Scientific (Gibco)152500611.3)
HemocitómetroHausser Scientific31001.3)
Placa de 24 pocillosGreiner bio-one6621601.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherryDr. Heinzen, R.1.4), 2.2)
Drosophila platos de jugo ProtocolosCold Spring Harbor2.1)
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full AgarFisher BioreactivosBP1423-5002.1.1.1)
MetilparabenoAmresco0572-500G2.1.1.2)
Etanol absolutoBiorreactivos FisherBP2818-5002.1.1.2)
Concentrado congelado de jugo de uva 100% de Welch, 340 mLB0025UJVGM Amazon2.1.1.3)
Placas de Petri, 10 x 35 mmFisher Scientific08-757-100A2.1.1.4)
Cubreobjetos de microscopioFisher Scientific12-545-801.4.4), 2.2.2)
Levadura, panaderos activos secosMP Biomedicals02101400012.1) Agregue 2 partes de agua a 1 parte de levadura (v/v)
Aguja de tungstenoFine Science Tools10130-202.1)
Pinzas de sujeciónVWRHS83132.1)
ParaformaldehídoFisher ScientificFLO4042-5003.1.3)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-5003.1.3)
Albúmina sérica bovinaFisher ScientificBP9706-1003.1.3)
4',6-diamidino-2-fenilindolThermo Fisher Scientific622473.1.4)
Medio de montaje antidecoloraciónThermo Fisher ScientificP369303.1.6)
Microscopio confocalLeicaTCS SP8-X Microscopio de escaneo láser confocal de luz blanca3.2)
Software de reconstrucción de imágenes 3DLeicaLASX con módulode visualización 3D3.3)
Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-552-33.1.6)
Virus iridiscente de invertebrados 6 (IIV6)Dr. Teixeria, L.4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenesATCCcepa: 10403S4) Listeria monocytogenes cepa 10403S (Bishop y Hinrichs, 1987) se cultivó en el caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) Difco (BD Biosciences) que contenía 50 µ g/ml de estreptomicina a 30 °C.
DNasa IThermo Fisher Scientific(Invitrogen)18068015Degradación del ADNg
Kit de síntesis de ADNcBio-Rad1708891síntesis de ADNc
IIV6_193R_FIDTqRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R
IDTqRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd
SIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
SIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Reactivo verde qRT-PCR ThermoFisher ScientificK0251, K0252, K0253qRT-PCR
Sistema de PCR en tiempo realThermo Fisher Scientific4351107, 7500 Software v2.0qRT-PCR
Anticuerpo anti-Listeria monocytogenesabcamab35132Western blot
Anticuerpo anti-actina producido en conejoSIGMA-ALDRICHA2066Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP ConjugadoPromegaW4011Western blot
de Snow River de RpII_qRTPCR_rev

Referencias

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