Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis

Resumen

Este método muestra cómo visualizar la invasión del patógeno en las células de los insectos con modelos tridimensionales (3D). Hemocitos de larvas de Drosophila estaban infectadas con patógenos virales o bacterianos, o ex vivo o en vivo. Hemocitos infectados luego fijados y teñidos para la proyección de imagen con un microscopio confocal y la posterior reconstrucción celular 3D.

Resumen

Durante la infección patógena de Drosophila melanogaster, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta inmune durante la infección. Así, el objetivo de este protocolo es desarrollar un método para visualizar la invasión del patógeno en un compartimiento inmune específico de las moscas, es decir, hemocitos. El método presentado aquí, 3 × 10⁶ vivo hemocitos pueden obtenerse 200 larvas de Drosophila 3^rd estadio en 30 min para la infección ex vivo . Alternativomente, hemocitos pueden ser infectado en vivo a través de la inyección de 3 larvas de estadio^rd seguido por extracción hemocyte a la infección después de 24 h. Estas células infectadas de la primaria fueron fijadas, teñidos y reflejada usando microscopia confocal. Entonces, se generaron representaciones 3D de las imágenes para mostrar definitivamente la invasión de patógenos. Además, se puede obtener RNA de alta calidad para qRT-PCR para la detección de siguiente de mRNA de patógeno infección y suficiente proteína pueden ser extraído de estas células para el análisis de Western blot. Tomados en conjunto, se presenta un método para la reconciliación definitiva de la invasión de patógenos y confirmación de la infección con tipos de patógeno bacterianos y virales y un método eficiente para la extracción de hemocyte obtener suficiente energizados hemocitos de Drosophila larvas para experimentos de infección ex vivo e in vivo .

Introducción

Drosophila melanogaster es un organismo modelo bien establecido para el estudio de la inmunidad innata¹. Durante la respuesta inmune innata, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta al desafío de patógeno. Hemocitos son cruciales para el encapsulamiento de parásitos, así como tener una función importante en la lucha contra el patógeno a través de la acción fagocítica durante la infección por hongos, virales y bacterianas^2,3.

Para mejor entender la respuesta inmune innata del hospedador a la infección microbiana patógena, es importante vis....

Protocolo

1. infección ex vivo

1. Y aparatos
   1. Bajo condiciones estériles, preparar fresco Drosophila Hemocyte aislamiento medio (DHIM) que contiene de 75% Schneider Drosophila medio 25% suero bovino Fetal (FBS) y filtro de esterilización lo.
   2. Capa de 2-3 pedazos de la película de parafina 10 cm x 10 cm bajo un estereomicroscopio.
   3. Preparar el tubo capilar de vidrio. Ajuste el tirador capilar a 55% del máximo. Tire el tubo capilar a un punto agudo de aproximadamente 10 μm.
   4. Relleno capilar con aceite mineral.
   5. Ensamble tubo capilar lleno en el nanoinjector (figura 1

Resultados

Para cobrar altura hemocitos para infección ex vivo de 3 × 10⁶ hemocitos se obtuvieron de 200 larvas de Drosophila 3^rd estadio. Para el desarrollo de nuestro método, se trató de un número de técnicas diferentes. Disección larvas individual llevaría hasta 1,5 h y un promedio de ~ 8000 células fueron obtenidos usando este método¹⁸, la mayoría de los cuales no estaban viva al final de la colección. A continuación, intentó extrae.......

Discusión

Para entender mejor cómo se infectan las células del huésped, es importante aclarar la localización del patógeno en las células, especialmente cuando experimenta previamente patógeno y células tipo combinaciones⁴. Mientras que el estudio de la cascada de la respuesta celular después de la infección puede indicar invasión patógeno productiva, la combinación de datos de respuesta de imagen y celular es esencial para demostrar la infección y la invasión de patógenos. Mientras reportes imágenes 2D de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Schneider's Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	21720024	1.1.1), 2.1.2)
Suero fetal bovino	GE Healthcare Life Sciences  (HyClone)	SH30070.03HI	1.1.1), 2.1.2)
Filtro (0.22 y micro; L)	RESTEK	26158	1.1.1)
Colador (100 y micro; m)	Greiner bio-one	542000	1.2.1), 2)
Microscopio estereoscópico	Amscope	SM-1BSZ-L6W	1.2), 2)
Capilar de vidrio	Fisher Scientific	21-171-4	1.1), 1.2), 2)
Tirador capilar	Narishige International USA, Inc.	PC-10	1.1.3)
Aceite mineral	Productos		1.1.4)
Nanoinyector	Drummond Scientific Company	3-000-204	1.1), 1.2), 2.2)
Pinzas	VWR	82027-402	1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 aparato de entrega	Genesee Scientific	59-122BC	1.2), 2)
Azul	tripanoThermo Fisher Scientific (Gibco)	15250061	1.3)
Hemocitómetro	Hausser Scientific	3100	1.3)
Placa de 24 pocillos	Greiner bio-one	662160	1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.		1.4), 2.2)
Drosophila platos de jugo Protocolos		Cold Spring Harbor	2.1)
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full Agar	Fisher Bioreactivos	BP1423-500	2.1.1.1)
Metilparabeno	Amresco	0572-500G	2.1.1.2)
Etanol absoluto	Biorreactivos Fisher	BP2818-500	2.1.1.2)
Concentrado congelado de jugo de uva 100% de Welch, 340 mL	B0025UJVGM Amazon		2.1.1.3)
Placas de Petri, 10 x 35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A	2.1.1.4)
Cubreobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-545-80	1.4.4), 2.2.2)
Levadura, panaderos activos secos	MP Biomedicals	0210140001	2.1) Agregue 2 partes de agua a 1 parte de levadura (v/v)
Aguja de tungsteno	Fine Science Tools	10130-20	2.1)
Pinzas de sujeción	VWR	HS8313	2.1)
Paraformaldehído	Fisher Scientific	FLO4042-500	3.1.3)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	3.1.3)
Albúmina sérica bovina	Fisher Scientific	BP9706-100	3.1.3)
4',6-diamidino-2-fenilindol	Thermo Fisher Scientific	62247	3.1.4)
Medio de montaje antidecoloración	Thermo Fisher Scientific	P36930	3.1.6)
Microscopio confocal	Leica	TCS SP8-X Microscopio de escaneo láser confocal de luz blanca	3.2)
Software de reconstrucción de imágenes 3D	Leica	LASX con módulo	de visualización 3D3.3)
Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-552-3	3.1.6)
Virus iridiscente de invertebrados 6 (IIV6)	Dr. Teixeria, L.		4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes	ATCC	cepa: 10403S	4) Listeria monocytogenes cepa 10403S (Bishop y Hinrichs, 1987) se cultivó en el caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) Difco (BD Biosciences) que contenía 50 µ g/ml de estreptomicina a 30 °C.
DNasa I	Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)	18068015	Degradación del ADNg
Kit de síntesis de ADNc	Bio-Rad	1708891	síntesis de ADNc
IIV6_193R_F	IDT		qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R
	IDT		qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd
	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Reactivo verde qRT-PCR Thermo	Fisher Scientific	K0251, K0252, K0253	qRT-PCR
Sistema de PCR en tiempo real	Thermo Fisher Scientific	4351107, 7500 Software v2.0	qRT-PCR
Anticuerpo anti-Listeria monocytogenes	abcam	ab35132	Western blot
Anticuerpo anti-actina producido en conejo	SIGMA-ALDRICH	A2066	Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugado	Promega	W4011	Western blot

de Snow River de RpII_qRTPCR_rev