Artículo de método

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/57080

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29 de diciembre de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina de histonas modificadas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ADN se utiliza posteriormente para PCR cuantitativa para interrogar la abundancia y localización de modificaciones post-traduccionales de las histonas por todo el genoma.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modificaciones post-traduccionales de las histonas (PTMs), como acetilación, metilación y fosforilación, dinámicamente son reguladas por una serie de enzimas que añadir o quitar estas marcas en respuesta a las señales recibidas por la célula. Estos MPa es principales contribuyentes a la regulación de procesos tales como control de expresión del gene y de reparación del ADN. Inmunoprecipitación de cromatina (chIP) ha sido un acercamiento instrumental para disección de la abundancia y la localización de muchos PTMs histonas por todo el genoma en respuesta a las diversas perturbaciones a la celda. Aquí, se describe un método versátil para la realización de chIP de modificación postraduccional histonas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Este método se basa en el entrecruzamiento de las proteínas y el ADN mediante tratamiento de formaldehído de las culturas de levadura, generación de lisados de levadura por cordón latiendo, solubilización de fragmentos de cromatina por nucleasa micrococcal e inmunoprecipitación de ADN histonas complejos. ADN asociado con la marca de la histona de interés es purificado y sometido a análisis PCR cuantitativo para evaluar su enriquecimiento en múltiples loci por todo el genoma. Experimentos representativos sondeo la localización de las marcas de histonas H3K4me2 y H4K16ac en wildtype y levadura mutada se discuten para demostrar la interpretación y análisis de datos. Este método es conveniente para una variedad de la histona PTMs y puede realizarse con diferentes cepas mutantes o en presencia de diversas presiones ambientales, lo que es una excelente herramienta para investigar cambios en la dinámica de la cromatina en condiciones diferentes.

Introducción

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La modificación poste-de translación dinámica (PTM) de las histonas es un mecanismo regulador fundamental para muchos procesos con plantilla de ADN, incluyendo transcripción, replicación y reparación de ADN1,2. La capacidad para determinar la abundancia y la localización precisa de las histonas modificadas concomitantes con estos procesos por lo tanto es fundamental para entender la regulación bajo diferentes condiciones en la célula. El desarrollo de inmunoprecipitación de cromatina (chIP) como un método en gran parte provino de los estudios bioquímicos de las interacciones de proteínas con el ADN, particularmente en vitro métodos reticulantes químicos, junto con la necesidad de evaluar la carácter dinámico de las interacciones DNA proteína en vivo y en regiones específicas del genoma3,4,5. El avance de las tecnologías de secuenciación y la PCR cuantitativa (qPCR) también ha ampliado la capacidad para realizar experimentos de chIP con comparaciones cuantitativas y a través de genomas enteros, lo que es una herramienta poderosa para disecar las interacciones DNA-proteína en múltiples niveles.

Actualmente, la viruta es un método necesario para cualquier grupo de investigación interesado en la regulación de cromatina mediada del genoma como no existen métodos comparables para interrogar directamente el enlace físico entre una histona modificado y un locus genómico específico en vivo. Aunque existen variaciones de este método con secuencia de la generación siguiente a modificaciones de las histonas a lo largo del genoma6,7 , estos enfoques pueden abordar diversas cuestiones científicas y su escala, costo y recursos técnicos pueden ser limitantes para algunos grupos de investigación. Además, chIP-qPCR específica es necesario para complementar estos enfoques proporcionando métodos tanto optimización el protocolo de la viruta antes de iniciar la secuencia y validar los resultados de los conjuntos de datos epigenómica. Espectrometría de masas basado en enfoques para identificar el complemento completo de la histona marcas asociadas con regiones genómicas también han surgido8,9,10,11, sin embargo, estos enfoques tienen algunas limitaciones con respecto a qué regiones del genoma pueden ser sondeadas y requieren conocimientos técnicos y la instrumentación que no estará disponible para todos los grupos de investigación. Por lo tanto, el chIP sigue siendo un método fundamental para el análisis de la abundancia y la distribución de modificaciones de las histonas bajo diversas condiciones para todos los grupos de investigación interesados en epigenética, la cromatina y la regulación de funciones genómicas.

Aquí, describimos un método para modelo de chIP con la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) para investigar la distribución de PTMs histonas en la cromatina. Este enfoque se basa en una serie de componentes de la base de protocolos chIP desarrollado en la levadura y también se aplica a modelo diversos sistemas12,13. Las interacciones entre las histonas modificadas y ADN en la célula se conservan por entrecruzamiento con formaldehído. Tras preparación lisada, fragmentos de cromatina son solubilizados en fragmentos de tamaño uniformemente por digestión con nucleasa micrococcal. Inmunoprecipitación de las histonas modificadas se realiza con anticuerpos comerciales o generados por el laboratorio y cualquier ADN asociado es aislado y analizado para el enriquecimiento en determinadas regiones genomic usando qPCR (figura 1). Para muchas modificaciones de las histonas, la cantidad de ADN obtenido de este protocolo es suficiente para probar más de 25 diferentes loci genómicos por qPCR.

Este método de chIP es muy versátil para el control de la distribución de una modificación de las histonas solo a través de múltiples cepas mutantes o las condiciones ambientales, o para probar múltiples modificaciones de las histonas en las células de tipo salvaje en un número de loci genómicos. Además, numerosos componentes del protocolo son fácilmente ajustables para optimizar la detección de cualquiera de los dos altamente o humildes-abundantes marcas de histona. Finalmente, realizar chIP de histonas modificadas en levadura de florecimiento ofrece la oportunidad de utilizar los controles claves para especificidad de anticuerpos que no están ampliamente disponibles en otros sistemas. Es decir, se pueden generar cepas de levadura que llevan las mutaciones de punto en los residuos de las histonas que son objeto de modificación y, en algunos casos, existe solamente una sola enzima que cataliza un residuo particular histona modificación (ej. lisina de las histonas metiltransferasas). Por lo tanto, chIP puede realizarse en cualquiera de los dos las histona mutante o enzima eliminación cepas analizar la medida en que Unión inespecífica del anticuerpo se puede que ocurre y generar falsos positivos. Este control es particularmente valioso para los anticuerpos del recién desarrollado y puede incluso ser utilizado para validar la especificidad del anticuerpo por modificaciones de las histonas conservados antes de su uso en otros sistemas. Este enfoque complementa otros métodos para probar la especificidad del anticuerpo que distinguen entre Estados de modificación diferentes (por ejemplo, mono-, di - y tri-metilación), incluyendo matrices de péptidos modificados de sondeo y realizar western blot de las histonas o nucleosomas con modificaciones definidas. En general, chIP en levadura de florecimiento es un método eficaz para evaluar la dinámica de la histona MPa por todo el genoma y los mecanismos que regulan su regulación de disección.

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Protocolo

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1. atar los anticuerpos bolas magnéticas

  1. Mezcla bien las bolas magnéticas de proteína A/G y transferir 20 μl de granos magnéticos por una inmunoprecipitación (IP) muestra a un tubo de 1,5 mL.
    Nota: Cuando el pipeteo granos, utilizar puntas de ancha, baja retención.
  2. Coloque el tubo con los granos en un soporte magnético y permitir cuentas recoger en el lado del tubo. Eliminar el sobrenadante.
  3. Lavar los granos 3 veces con 1 mL de solución salina fría tamponada con Tris (TBS) (50 mM Tris-HCl de pH 7.5, 150 mM NaCl).
  4. Añadir 200 μL de TBS para granos y la cantidad adecuada de anticuerpos. Gire a 8 rpm durante la noche a 4 ° C.
    Nota: Para muchos anticuerpos PTM de las histonas, 1-3 μg de anticuerpo por IP es suficiente. Sin embargo, experimentos de titulación se recomiendan determinar las concentraciones adecuadas. Concentraciones recomendadas para los anticuerpos del PTM histona bien caracterizado, comerciales a menudo son precisas y pueden encontrarse en los informes publicados o literatura del producto.
  5. Colocar los granos en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante. Lave con 1 mL de TBS.
  6. Resuspender los granos en 20 μl de TBS por muestra IP además de 5 μl adicionales (en caso de error de pipeteo) de TBS.
    Nota: Los granos pueden almacenarse a corto plazo a 4 ° C hasta su uso.

2. cultivar las células de levadura

  1. Inocular 10 mL de YPD (Extracto de levadura 10%, 20% peptona y dextrosa 20%) con una sola Colonia de la cepa adecuada y cultivarlo a 30 ° C durante la noche en un incubador de agitación a 220 rpm.
  2. Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) de la cultura de la levadura utilizando un espectrofotómetro. Diluir la cultura a un OD600 = 0.2 en YPD en un nuevo frasco de 100 mL.
  3. Crecer las células en 30 ° C en un incubador de agitación en rpm 220 hasta llegar a fase media logarítmica (OD600 = 0.6-0.8).

3. en Vivo reticulación de las proteínas al ADN

  1. Cuando las culturas llegan a fase logarítmica media, añadir 2,7 mL de formaldehído al 37% directamente al medio, para una concentración final de 1% de formaldehído. Transferir el matraz a un agitador a 25 ° C (o temperatura ambiente) y agitar a 50 rpm por 15 minutos.
  2. Añadir 5 mL de 2,5 M glicina al medio y continúe la agitación a 50 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos calmar el formaldehído.
  3. Transferencia de las células para botellas de centrífuga y centrifugar las células a 5800 x g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante.
    1. Lavar las células a resuspender en 45 mL de TBS frío y transferir la suspensión a un tubo cónico de 50 mL. Girar el tubo a 2800 x g durante 3 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
    2. Lavado de que las células en 10 mL de frío chIP tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM ácido de etilendiaminotetracético (EDTA), 1% nonidet octil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), almacenado a 4 ° C).
    3. Girar las células a 2800 x g durante 3 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
      Nota: Las células pueden ser congeladas con nitrógeno líquido y almacenadas a-80 ° C hasta el procesamiento posterior.

4. hacer lisados de levadura

  1. Resuspender las células en 1 mL de tampón de lisis ChIP frío con fluoruro (PMSF) del phenylmethylsulfonyl de 1 mM y 1:1,000 dilución del inhibidor de proteasa de levadura cóctel. Transferir la suspensión a un tubo de tapón de rosca 2.0 mL que contiene 200 μL de perlas de vidrio.
  2. Transferir las células a una tira a aparatos para la agitación de alta velocidad a 4 ° C y grano supera 6 veces para 30 s cada uno. Mantener las células en hielo para por lo menos 1 minuto entre cada grano superando.
  3. Transferir el lisado a un tubo de 1,5 mL gel de puntas de carga. Centrifugue el lisado a 15.500 x g por 20 min a 4 ° C.
  4. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 250 μl de tampón de digestión MNase (pH de 10 mM Tris-HCl 7.5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl2, 21 m m CaCl2, 1% NP-40, almacenados a 4 ° C) transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  5. Añadir 2,5 μl de MNase a las reacciones. Mezclar suavemente por inversión 4 - 6 veces e inmediatamente lo Incube en un baño de agua de 37 ° C por 20 min.
    Nota: Condiciones de digerir deben ser optimizadas cuando se utiliza un nuevo stock de MNase. Consulte el paso 10 del protocolo.
  6. Inmediatamente Coloque los tubos en hielo para detener la reacción y añadir 5 μl de EDTA de 0,5 M para una concentración final de 10 mM, EDTA. Mezclar suavemente por inversión.
  7. Centrífuga de la reacción a 15.500 x g durante 15 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.
    Nota: Será Soluble cromatina (digerida) en el sobrenadante. El precipitado contiene restos celulares cualquier cosa sin digerir e insoluble.

5. Immunoprecipitate (IP) modifica las histonas

  1. Determinar la concentración de proteínas de cada fracción de la cromatina MNase lanzado usando un análisis de Bradford. Añadir 1 mL de reactivo de Bradford a cada uno de 8 cubetas desechables plus 1 cubeta adicional para cada muestra de la proteína a probar.
    1. Prepare una solución de 2 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA).
    2. Añadir el volumen adecuado para conseguir las siguientes concentraciones de BSA en 1 mL de reactivo de Bradford: 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL y 10 μg/mL. Añadir 2 μL de la fracción de la cromatina MNase lanzado a cubetas adicionales.
    3. Cubrir la parte superior de cada cubeta con un pequeño trozo de parafilm e invertir las cubetas de 4 a 6 veces para mezclar bien la solución. Incubar las cubetas a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    4. Utilizando un espectrofotómetro de luz visible, medir la absorbancia a 595 nm para la curva estándar y las muestras experimentales.
      Nota: Utilice la cubeta sin BSA (0 μg/mL) y en blanco el espectrofotómetro antes de realizar la primera medición.
    5. Trazar una curva estándar utilizando los valores de absorbancia para las distintas concentraciones de BSA en software de hoja de cálculo o software asociado con el espectrofotómetro. Basado en la curva estándar y utilizadas el factor de dilución (1: 500), utilizar los valores de absorbancia para calcular la concentración de proteína de cada una de las muestras de la fracción de la cromatina.
  2. Para cada IP, añadir 50 μg de proteínas totales de la fracción de la cromatina MNase lanzado a tampón de lisis de ChIP para llegar a un volumen final de 1 mL.
    Nota: Si configurar más de una IP por lisado, hacer una mezcla maestra de lisado y ChIP de tampón de lisis y alícuota 1 mL a tubos individuales para la IP.
  3. Saque 100 μl de la mezcla IP al proceso como la muestra de entrada. Congelar la entrada muestra a-20 ° C hasta el paso 7.1.
    Nota: Cualquier muestra restante de la cromatina puede congelarse a-20 ° C y utilizar una IP posterior si se desea.
  4. Añadir 20 μl de granos magnéticos de A/G de proteína previamente atado con anticuerpo para cada muestra IP.
Girar la muestra a 8 rpm durante 3 h (estándar) o durante la noche (si se prefiere) a 4 ° C.

6. lavar las IPs y eluir complejos histona-ADN

  1. Colocar los tubos en un soporte magnético y dejar granos de recoger en el lado del tubo. Quite el sobrenadante con una pipeta. Lavar los granos con 1 mL de cada uno de los amortiguadores a continuación.
    1. Realizar cada lavado girando a 8 rpm por 5 min a 4 ° C, colocar los granos en un soporte magnético, retirar el sobrenadante y añadir tampón próximo: x 2 - ChIP de tampón de lisis, 2 x - alta sal tampón de lavado (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA El 1% NP-40, almacenados a 4 ° C), 1 x - LiCl y detergente lavado Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, desoxicolato de sodio al 1%, almacenado a 4 ° C), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, almacenado a 4 ° C) y 1 x - TE.
    2. Con el último lavado TE, transferencia de cuentas a un nuevo tubo con 0,5 mL de TE para transferir la mayor parte de los granos, luego otro 0,5 mL de TE Lave el tubo y transferir los granos restantes.
  2. Añadir 250 μl de la fresca viruta tampón de elución (1% SDS, 1 mM NaHCO3). Vórtice la solución brevemente. Rotar las muestras a 8 rpm durante 15 min a temperatura ambiente.
  3. Coloque el tubo en un soporte magnético y recoger los granos. Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y evitar los granos.
    Nota: El efluente contiene immunoprecipitated proteínas y ADN asociado.
  4. Añadir otro 250 μl de tampón de elución de la viruta a los granos. Rotar las muestras a 8 rpm durante 15 min a temperatura ambiente.
  5. Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a tubo que contiene la primera elución. Si es necesario, retire un volumen menor (240 μL) para que todas las IPs evitar molestar a los granos.

7. Invierta la proteína ADN reticulaciones

  1. Descongelar las muestras de entrada y añadir 400 μL de tampón de elución de ChIP a cada entrada.
  2. Entrada tanto muestras IP, añadir 20 μl de NaCl 5 M, 5 μl de glucógeno 20 mg/mL y μl 12.5 de 20 mg/mL de proteinasa K. mezcla bien invertir o agitando los tubos. Incubar las muestras en un baño de agua de 65 ° C durante la noche.

8. purificar y concentrar el ADN

  1. Añadir 10 μl de ARNasa A 10mg/mL a la entrada y las muestras de la IP. Incubar las muestras en un baño de agua de 37 ° C durante 30 minutos.
  2. Añadir 600 μl de fenol: chlorofrom:isoamyl alcohol (25:24:1 PCI) a la solución acuosa y mezclar bien. Los hace girar a 15.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    1. Retirar la capa acuosa a un tubo nuevo. Añadir 600 μl de PCI y mezclar bien. Girar el tubo a 15.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Transferir la capa acuosa a un tubo nuevo.
      PRECAUCIÓN: En la campana y usar equipo de protección personal al trabajar con PCI. Disponer residuos líquidos y sólidos por las directrices.
  3. Agregar 0.1 volumen x de acetato de sodio de 3 M y 1 mL de etanol al 100% frío para precipitar el ADN. Invertir el tubo 4 - 6 veces para mezclar bien la solución. Incubar a-20 ° C durante la noche.
    1. Girar el tubo a 15.500 x g por 20 min a 4 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
    2. Lavar el precipitado en 1 mL de etanol frío al 70%. Vuelta a 15.500 x g por 10 min a 4 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
    3. Secar el pellet en la campana por aproximadamente 20 min (hasta totalmente seco). Resuspender las muestras IP en 50 μl de agua libre de nucleasas y resuspender entradas muestras en 100 μl de agua libre de nucleasa. Almacenar las muestras de ADN a-20 ° C hasta realizar qPCR.

9. cuantitativo PCR (qPCR) para detectar enriquecido regiones genómicas

  1. Hacer una mezcla maestra de qPCR para cada juego de iniciadores. Una reacción contiene 5 μl de la mezcla de x qPCR 2, 0.25 μl de cebador forward de 20 μm y 0.25 μl de cebador inverso de 20 μm.
    Nota: Primer apropiado diseño y pruebas para los experimentos de qPCR son describen en otros lugares14,15,16.
  2. Hacer mezclas principales de ADN para cada muestra de ADN. Una reacción contiene 0,5 μl de ADN y 4,0 μL de agua libre de nucleasa.
  3. Agregar 5.5 μl de la mezcla principal de imprimación adecuada y 4.5 μl de la mezcla principal de ADN apropiada a cada pocillo de una placa de 384 pozos qPCR.
    Nota: Comience con la adición de 5.5 μl de la mezcla de la cartilla a cada pocillo. Haga girar la placa a 200 x g durante 1 min a temperatura ambiente antes de agregar 4.5 μl de la mezcla de ADN.
  4. Adherir el sello de la placa y la vuelta a 200 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
  5. Realizar qPCR utilizando un sistema qPCR en tiempo real con las siguientes condiciones: 95 ° C por 3 min; 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55 ° C por 30 s; curva fusión 65 º C a 95 ° C con incrementos de 0,5 ° C, 5 s.
  6. Para cada par de la cartilla, calcular la entrada por ciento de la muestra de la propiedad intelectual en relación con la muestra de entrada 5% usada en la qPCR. Utilizar los medios de las técnica PCR triplicados para realizar los cálculos.
    Nota: Si se observa una variación sustancial en el triplicado de la polimerización en cadena, es mejor repetir la qPCR con atención a la composición de la mezcla principal, pipeteo errores y contaminación cruzada entre pozos en la placa de 384 pozos.
    1. Ajuste los valores de Cq para la entrada al 100% restando el número de ciclos que representan el factor de dilución de los valores crudos de Cq.
      Nota: La entrada de cinco por ciento representa un factor de dilución de 20-fold, que equivale a 4,32 ciclos (sesión2 20 = 4.32).
    2. Calcular el porcentaje de entrada como 2 ^ (Cqentrada - CqIP) multiplicado por 100.

10. determinar las condiciones del MNase Digest (recomendado antes chIP completo primer experimento)

  1. Siga los pasos 2.1 por 4.4 del protocolo anterior. Ampliar el protocolo para generar suficiente lisado para muestras múltiples de la digestión MNase de la pelotilla que contiene la cromatina. En paso 4.4, Resuspender el pellet en 1,25 mL de tampón de digestión MNase. Alícuota de las muestras a 5 tubos hasta que cada uno contiene 250 μl de la pelotilla de cromatina que se resuspendió en Buffer de digestión MNase.
  2. Añadir 0, 1.5, 2.5 o 5 μl de MNase a cada tubo. Mezclar suavemente por inversión 4 - 6 veces e inmediatamente incubar los tubos en un baño de agua de 37 ° C por 20 min.
  3. Inmediatamente colocar los tubos en hielo y añadir 5 μl de EDTA de 0,5 M para una concentración final de 10 mM para detener las reacciones.
Mezcle la solución suavemente por inversión.
  • Centrifugar los tubos a 15.500 x g durante 15 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.
  • Añadir SDS a concentración final de 1% (25 μl de solución stock de 10%) y NaHCO3 a concentración final de 0,1 M (25 μl de solución de 1 M) para las muestras en los tubos de 1,5 mL.
  • Añadir 20 μl de NaCl 5M, 5 μl de glucógeno y 12,5 μl de proteinasa K de 20mg/mL para las muestras en los tubos de 1,5 mL. Les incubar a 65 ° C durante la noche.
  • Añadir 10 μl de RNaseA 10 mg/mL. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
  • Añadir 300 μL de PCI a la solución acuosa y mezclar bien. Vuelta a 15.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    1. Retire la capa acuosa a un tubo nuevo. Añadir 300 μL de PCI y mezclar bien. Vuelta a 15.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Transferir la capa acuosa a un tubo nuevo.
  • Agregar 0.1 volumen x de 3 M acetato de sodio (generalmente 30 μL) y 1 mL de etanol al 100% frío para precipitar el ADN. Invertir el tubo 4 - 6 veces para mezclar bien. Incubar el tubo a-80 ° C por 1 h o -20 ° C durante la noche.
    1. Girar el tubo a 15.500 x g por 20 min a 4° C. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
    2. Lavar el pellet en 1 mL de etanol frío al 70%. Vuelta a 15.500 x g por 10 min a 4 ° C.
    3. Deje que las pastillas deje secar al aire en el campana aproximadamente 20 minutos (o hasta totalmente seco). Resuspender el pellet en 30 μl de agua libre de nucleasa.
  • Añadir el ADN carga del tinte y ejecutar 20 μl en una agarosa 2% gel para visualizar digiere ADN.

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    Resultados

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    Un componente clave de este protocolo es optimizar la concentración de nucleasa micrococcal (MNase) utilizada para digerir la cromatina en fragmentos solubles, como se indica en el paso 10. Esto es fundamental para la obtención de datos de alta resolución con respecto a la distribución de modificaciones de las histonas en regiones genómicas de interés. Debe realizarse una valoración de MNase para determinar la concentración más adecuada para lograr principalmente mono-nucleosomas con una ...

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    Discusión

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    El procedimiento aquí descrito permite la eficiente recuperación de ADN asociada con histonas modificadas en las células de levadura por la inmunoprecipitación. Esto es seguido por qPCR utilizando cebadores que amplifican regiones de interés para determinar el enriquecimiento local o el agotamiento de las modificaciones específicas de histonas. A pesar de ser desarrollado como un método hace casi 20 años, chIP sigue siendo el ensayo definitorio para investigar el estado de modificación de las histonas en diferentes regio...

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    Divulgaciones

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Agradecimientos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Los autores desean agradecer a miembros del laboratorio verde para discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH R03AG052018 y R01GM124342 a E.M.G.

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    Extracto de levadura Productos deinvestigación internacional (RPI)Y20025-1000.0
    PeptonaProductos de investigación internacional (RPI)P20250-1000.0
    DextrosaThermoScientificBP350-1
    FormaldehídoSigma-AldrichF8775
    GlicinaFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-nonilfenil-polietilenglicolSigma-Aldrich74385Equivalente a NP-40
    MgClThermoScientific S25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    Dodecil Sulfato de SodioAmrescoM107-1KG
    Desoxicolato de SodioSigma-Aldrich30970-100G
    Acetato de SodioSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    Cóctel de inhibidores de la proteasa de levaduraVWR10190-076
    25 Fenol:24 Cloroformo:1 Alcohol isoamílicoVWR Life Science97064-824
    EtanolSigma-AldrichE7023
    Agua sin nucleasasVWR100720-992
    NucleasamicrocócicaWorthington BiochemicalLS004797
    GlycogenThermoScientificR0561
    Proteinasa KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNasa A Sigma-AldrichR6513-50MG
      reactivo de ensayo Bradford ThermoScientific23238
      Estándar BSA 2 mg/mLThermoScientific23210
    &alfa; H4EMD Millipore04-858
    y alfa; H4K16acEMD MilliporeABE532
    y alfa; H3Abcamab1791
    y alfa; H3K4me2Motivo Activo39142
      Mezcla de qPCR de alta resistenciaAccuris qMax verde, mezcla de qPCR de baja resistenciaACC-PR2000-L-1000
    Proteínas A/G Perlas magnéticasThermoScientific88803
    soporte magnético para tubos de 1,5 mlFisher ScientificPI-21359
    Perlas de vidrio lavadas con ácidoSigma-AldrichG8772
      Homogeneizador de microtubosBenchmarkD1030
    Tubos de rosca de 2,0 mL con anillos de selladoSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Puntas de carga de gelFisher Scientific07-200-288
    CubetasFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    Tubos cónicos de 50 mLFisher Scientific14-432-22
    Placa de PCR de 384 pocillosFisher ScientificAB-1384W
      Agitador de piso giratorioNew Brunswick ScientificModel G10
    EspectrofotómetroThermoScientificND-2000c
      sistema de detección por PCR en tiempo realBio-Rad1855485

    Referencias

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
    2. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
    3. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
    4. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
    5. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
    6. Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37(2009).
    7. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
    8. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
    9. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
    10. Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
    11. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
    12. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
    13. Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
    14. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
    15. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
    16. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
    17. Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
    18. Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
    19. Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
    20. Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
    21. South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
    22. Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).
    23. Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
    24. Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
    25. Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
    26. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).

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