Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble

Resumen

Se describe un método para fraccionamiento de huntingtina mutada insoluble y soluble especies de ratón cerebro y la célula cultura. El método descrito es útil para la caracterización y cuantificación de flujo de la proteína huntingtina y SIDA en el análisis de homeostasis de proteínas en la patogénesis de la enfermedad y en presencia de perturbaciones

Resumen

La acumulación de proteínas mal plegadas es central a la patología en la enfermedad de Huntington (HD) y muchos otros trastornos neurodegenerativos. Específicamente, una característica patológica fundamental de HD es la acumulación aberrante de la proteína del mutante de HTT (mHTT) en complejos de alto peso molecular y los cuerpos de inclusión intracelulares compuesto por fragmentos y otras proteínas. Los métodos convencionales para medir y entender que las contribuciones de las diversas formas de agregados que contienen mHTT incluyen microscopía de fluorescencia, mancha blanca /negra occidental análisis y filtro trampa de ensayos.

Sin embargo, la mayoría de estos métodos es específicos de conformación y por lo tanto no puede resolver el estado completo del flujo de proteína mHTT debido a la naturaleza compleja de solubilidad total y resolución.

Para la identificación de complejos y varias formas modificadas y mHTT agregado, separación y solubilización de los agregados celulares y fragmentos es obligatoria. Aquí se describe un método para aislar y visualizar la mHTT soluble, monómeros, oligómeros, fragmentos y un insoluble alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT especies. HMW mHTT pistas con la progresión de la enfermedad corresponde con lecturas de comportamiento del ratón y ha sido beneficioso modulada por determinadas intervenciones terapéuticas¹. Este enfoque puede utilizarse con cultivo de células, los tejidos periféricos y cerebro de ratón, pero puede adaptarse a otro modelo de los sistemas o contextos de enfermedad.

Introducción

La interrupción de las redes de control de calidad de proteínas que aseguran el correcto plegamiento y degradación de proteínas celulares son probable central a patología en la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH) y otros "proteína mal plegamiento" trastornos de^2,3. Una comprensión detallada de los componentes de red proteostasis y sus contribuciones a la patología son cruciales para el desarrollo de intervenciones terapéuticas mejoradas. HD es causado por la anormal extensión de una repetición de CAG en el gen de la EH en un tramo mayor de polyglutamines (p....

Protocolo

Declaración de ética animal - experimentos se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y un protocolo de investigación de animales aprobados por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal ( IACUC) de la Universidad de California, Irvine, un AAALAC institución acreditada. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.

1. preparación de buffer de lisis

1. Preparar "Soluble" tampón de lisis (10 mM Tris, pH 7.4, de 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerol) y un filtro estéril con filtro de 0.22 μm.....

Resultados

Resolución de lysates de la célula soluble e insoluble después de fraccionamiento puede ser detectado usando western análisis y filtro de retraso análisis (figura 2). Por ejemplo, células HEK293T fueron transfectadas con el reactivo de transfección (p. ej., lipofectamine 2000) con exón HTT 1 cDNA codificación que contiene glutamina 97 repite¹⁵ seguido por la región rico poli prolina y estas células se les permitiera expresa pa.......

Discusión

Algunas precauciones son necesarias para que los protocolos anteriores asegurar resultados consistentes y cuantitativos. En primer lugar, mHTT en ambas fracciones espontáneamente forman agregados con el tiempo a múltiples ciclos de descongelación de congelación, especialmente cuando en una alta concentración. Por lo tanto es crítico para congelar alícuotas de las preparaciones de proteínas y descongelar sólo el volumen necesario antes de ejecutar el ensayo como se describe en el protocolo anterior. Además, si fracción in.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro estéril	Millipore	SCGP505RE	Tapón de rosca, filtro de vacío estéril
1 mL Triturador de tejidos, Sonicador de	357538		Wheaton
	Qsonica	modelo Q125
DC Ensayo de proteínas	Biorad	5000111	comparable al ensayo de Lowry
Tris 1M solución tampón	Alfa Aesar	J60636
Triton X-100	Fisher	BP151-100
NaCl 5M	solución Teknova	S0251
Glicerol	Fisher	BP229-1
20% SDS solución	Teknova	S0295
N-etilmaleimida	Sigma	E1271
Fenilmetilsulfonia fluoruro Sigma		P7626	crea una solución madre de 100 mM en un 100% EtOH, tienda a 4° C
Ortovanadato de sodio	Sigma	S6508	Crear solución madre de 0,5 m en agua
Leupeptina	Sigma	L2884	Crear solución madre de 10 mg/ml en agua
Aprotinina	Sigma	A1153	Crear solución madre de 10 mg/ml en agua
Fluoruro de sodio	Sigma	S4504	Crear solución madre de 500 mM en agua
Millipore	Anti-HTT	MAB5492	Uso 1:1000 para Western blot, 1:500 para el ensayo de retardo de filtro
Anti-GAPDH	Novus Biologicals	NB100-56875	Use 1:1000 para Western blot soluble

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