Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble

9.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/57082

⸱

27 de febrero de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

En este artículo

Resumen

Se describe un método para fraccionamiento de huntingtina mutada insoluble y soluble especies de ratón cerebro y la célula cultura. El método descrito es útil para la caracterización y cuantificación de flujo de la proteína huntingtina y SIDA en el análisis de homeostasis de proteínas en la patogénesis de la enfermedad y en presencia de perturbaciones

Resumen

La acumulación de proteínas mal plegadas es central a la patología en la enfermedad de Huntington (HD) y muchos otros trastornos neurodegenerativos. Específicamente, una característica patológica fundamental de HD es la acumulación aberrante de la proteína del mutante de HTT (mHTT) en complejos de alto peso molecular y los cuerpos de inclusión intracelulares compuesto por fragmentos y otras proteínas. Los métodos convencionales para medir y entender que las contribuciones de las diversas formas de agregados que contienen mHTT incluyen microscopía de fluorescencia, mancha blanca /negra occidental análisis y filtro trampa de ensayos.

Sin embargo, la mayoría de estos métodos es específicos de conformación y por lo tanto no puede resolver el estado completo del flujo de proteína mHTT debido a la naturaleza compleja de solubilidad total y resolución.

Para la identificación de complejos y varias formas modificadas y mHTT agregado, separación y solubilización de los agregados celulares y fragmentos es obligatoria. Aquí se describe un método para aislar y visualizar la mHTT soluble, monómeros, oligómeros, fragmentos y un insoluble alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT especies. HMW mHTT pistas con la progresión de la enfermedad corresponde con lecturas de comportamiento del ratón y ha sido beneficioso modulada por determinadas intervenciones terapéuticas1. Este enfoque puede utilizarse con cultivo de células, los tejidos periféricos y cerebro de ratón, pero puede adaptarse a otro modelo de los sistemas o contextos de enfermedad.

Introducción

La interrupción de las redes de control de calidad de proteínas que aseguran el correcto plegamiento y degradación de proteínas celulares son probable central a patología en la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH) y otros "proteína mal plegamiento" trastornos de2,3. Una comprensión detallada de los componentes de red proteostasis y sus contribuciones a la patología son cruciales para el desarrollo de intervenciones terapéuticas mejoradas. HD es causado por la anormal extensión de una repetición de CAG en el gen de la EH en un tramo mayor de polyglutamines (poliQ) en la proteína de huntingtina (HTT)4. Una constante característica patológica de la patogenesia de la HD es la resultante mal plegamiento, acumulación y agregación de HTT en regiones del cerebro y en tejidos periféricos, que se ha demostrado que interferir en varios aspectos con la función y la homeostasis celular normal 5 , 6. HTT mientras que ubicuo se expresa, las neuronas espinosas medianas en el estriado son selectivamente vulnerables y más abiertamente afectadas con notable atrofia cortical asociada también a la patogenia de la HD.

La formación de agregados de HTT en el cerebro de pacientes con EH y en modelos animales por lo general ha servido como marcador de progresión de la enfermedad y la ganancia negativa dominante de la función para la mHTT7proxy. Aunque los mecanismos precisos por que la proteína mal plegamiento y agregación pueden contribuir a la toxicidad inducida por la mHTT siguen siendo confusos, la formación de las inclusiones en el cerebro de pacientes con EH y en varios modelos animales es una característica invariable e inevitable. Inclusiones aparecen a conformada en gran parte fragmentos HTT acumuladas que contiene el N-terminal ampliada poliQ, indicando que la proteólisis y de larga duración HTT como alternativa empalme8,9 pueden desempeñar un papel importante en la patogenesia de fragmentos N-terminal HD. HTT puede constituir una forma patológica de HTT que puede agregar rápidamente, nuclear y acelerar o propagar el proceso de agregación10.

Sin embargo, la presencia de estas inclusiones no se correlaciona necesariamente con toxicidad inducida HTT o célula muerte11. HTT se ha propuesto para someterse a un proceso de agregación de un monómero soluble a través de especies oligoméricas solubles y las fibrillas de β-hoja a agregados insolubles y las inclusiones12. Resolver estas diversas especies de proteína mediante análisis bioquímicos estándar ha sido un reto en el campo debido a su estabilidad en tampón de lisis poco detergente y dificultad en visualizar usando análisis bioquímicos estándar. Por lo tanto, consideraciones metodológicas son fundamentales para detectar el grado y patrón de la mHTT acumulada y agregada.

El protocolo presentado aquí ofrece un método para visualizar varios intermedios de HTT, específicamente la formación de una especie de HMW HTT insoluble que parece seguir muy de cerca con HD patogénesis y enfermedad progresión1,13 ,14. Ser capaz de resolver y seguimiento de múltiples especies de mHTT ofrece a los investigadores una herramienta bioquímica para estudiar la patogénesis de la enfermedad y evaluar posibles intervenciones terapéuticas a través de su modulación y su impacto en la patogénesis de la enfermedad.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Declaración de ética animal - experimentos se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y un protocolo de investigación de animales aprobados por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal ( IACUC) de la Universidad de California, Irvine, un AAALAC institución acreditada. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.

1. preparación de buffer de lisis

  1. Preparar "Soluble" tampón de lisis (10 mM Tris, pH 7.4, de 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerol) y un filtro estéril con filtro de 0.22 μm.
    1. Para un buffer de lisis "Solubles" de trabajo, medir N-etilmaleimida (NEM) y disolver completamente en 100 mM phenylmethysulfonyl fluoruro (PMSF) disuelto en 100% EtOH.
      Nota: Inhibidores de tampón de lisis: (i) 20 mM N-etilmaleimida (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1 mM ortovanadato de sodio (Na3VO4); (iv) 1 leupeptin μg/mL; (v) 1 μg/mL aprotinina; (vi) 20 mM de fluoruro de sodio (NaF).
      PRECAUCIÓN: Use una mascarilla cuando se trabaja con NEM en el protocolo. Tampón de lisis de trabajo debe hacerse fresca para inhibidores activos.
    2. Tampón de lisis soluble con inhibidores de la proteasa, inhibidores de añadir en el siguiente orden: fluoruro sódico (NaF), enrasar con tampón de lisis frío, ortovanadato de sodio (Na3VO4), aprotinina y Leupeptin.
  2. Para el tampón de lisis "Insoluble", suplemento 4% SDS por agregar 500 μl de SDS 20% 2 ml de tampón de lisis "Soluble". Dejar a temperatura ambiente.
    Nota: SDS precipita hacia fuera conservado a 4 ° C; Mantenga este a temperatura ambiente. Composición final de tampón de lisis: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% Tritón X-100; 150 mM de NaCl; glicerol al 10%; 4% SDS (sólo insolubles).

2. solubles/insolubles fraccionamiento protocolo

Nota: Vea la figura 1 para un diagrama esquemático.

  1. Dos juegos de tubos para cada muestra de la etiqueta: "Soluble" e "Insoluble".
  2. Añadir X-μl de helada tampón de lisis soluble de trabajo complementado con inhibidores de la proteasa (véase 1.1.1) al tejido.
    Nota: X = volumen varía dependiendo de la cantidad de tejido; Vea la tabla 1.
  3. Para el tejido de cerebro de ratón (es decir, cuerpo estriado), dounce lentamente 30 veces en douncer de vidrio 1 mL y pipeta en "Insoluble" etiquetado tubo (mantener en hielo).
    Nota: Tenga cuidado de no romper la superficie del líquido después de comenzar el douncing, como las burbujas se forma y pueden producir homogeneización incompleta.
  4. Para las células (es decir, HeLa, HEK293T), enjuague las células una vez con frío, 1 x PBS. Quite PBS y aplicar mínimo volumen de tampón de lisis a las células y levante con el raspador de la célula.
    Nota: Para sobre líneas celulares, las células fueron plateadas en 5 x 105 células por placa bien 6 y crecidas a cerca de la confluencia. Uno bueno es comparable a volúmenes utilizados para el striatum del ratón.
  5. Transferencia homogeneizado o célula lisada en la etiqueta, "Insoluble" tubos y lyse en hielo 1 hora (reloj de inicio después de procesada tubo final).
    Nota: Para los lysates de la célula, triturate varias veces romper grumos de células antes de comenzar la incubación. Evitar formación de burbujas. Brevemente vortex pulso cada muestra para 1 s a la mitad de lisis.
  6. Centrifugar las muestras a 4 ° C a 15.000 x g por 20 min.
  7. Recuperar el sobrenadante como la fracción "Soluble".
    1. Extraiga con pipeta, tenga cuidado de no perturbar la capa pellets/nublado que esto contaminará la fracción. Fracción soluble de la pipeta en "Soluble" etiquetado tubo. Mantener en hielo.
  8. Lavar el pellet con 500 μl de tampón de lisis (x2) y centrifugar a 4 ° C a 15.000 x g durante 5 min después de cada lavado; pasa nada si parte de la capa turbia se pipetea apagado.
  9. Después del último lavado, eliminar todo el tampón de lavado restante dejando únicamente el pellet de tejido.
    Nota: Desde este punto, muestras insolubles ahora deben ser mantenidas a temperatura ambiente.
  10. Pellets de resuspender con X-μl de tampón de lisis con 4% SDS (volumen puede ajustarse dependiendo del tamaño de la pelotilla; ver tabla 1).
  11. Someter a ultrasonidos cada muestra durante 30 s a temperatura ambiente con un sonicador de sondeo (125 w, 20 kHz, pulso, amplitud 40%, ver Tabla de materiales).
  12. Hervir las muestras (rolling hervir) durante 30 minutos; Centrifugar brevemente (15 s) 6.000 x g en cuanto a no perder cualquier muestra.
  13. Realizar ensayo de proteína DC (detergente compatible) (véase Tabla de materiales) o ensayo de proteínas de Lowry para medir concentración de proteínas (se recomienda empezadas diluciones de 1/5 de la muestra en tampón de lisis respectivo para el cultivo celular y 1/10 para lisados de tejidos).
    Nota: Las concentraciones de proteína debe ser leído usando un análisis DC o Lowry debido a la alta concentración de detergente.
  14. Muestras alícuotas en 50 lotes de μL para evitar problemas de congelación y descongelación.
    Nota: Protocolo puede pausarse aquí antes más análisis bioquímico mediante el almacenamiento de ambas fracciones a-20 ° C.

3. cuantificación y Western Blot

  1. Realizar western blot como se informó en otra parte1,13 por dilución 30 μg de muestra 1:1 en la carga de búfer (1.6 x tinte, 1 x reducción de la carga).
    Nota: 30 μg de proteína por la fracción es suficiente, pero se puede ajustar para una resolución óptima. 3 - geles de poli-acrilamida de Tris acetato de 8% deben utilizarse para la fracción insoluble. 4 - se recomiendan geles de Tris bis 12% para la fracción soluble.
  2. Hervir las muestras (hervir) por 5 min, centrifugar brevemente (15 s) 6.000 x g para obtener muestra.
  3. Analizar fracciones por SDS-PAGE y western blot, según protocolo del fabricante para muestras reducidas.
    Nota: Fracción Insoluble resuelve mejor cuando transfieren a la membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm. nitrocelulosa de 0,45 o 0,2 μm puede utilizarse para la fracción soluble, dependiendo del tamaño de la proteína de interés. Algunos optimización puede ser necesario para la mejor transferencia de materiales de APM.
  4. Mancha la membrana con la mancha de la proteína entera (p. ej., MEMcode, ver la Tabla de materiales) para visualizar proteínas eficiencia de carga.
    Nota: Manchas blancas /negras occidentales pueden ser analizadas por la intensidad de la medias pixel. Fracciones soluble pueden ser normalizados a una proteína de mantenimiento mejor adaptada para el sistema experimental. Fracción insoluble como la abundancia relativa de proteínas fue verificado por coloración reversible proteína o normalización de la histona 3 en blot separada.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Resolución de lysates de la célula soluble e insoluble después de fraccionamiento puede ser detectado usando western análisis y filtro de retraso análisis (figura 2). Por ejemplo, células HEK293T fueron transfectadas con el reactivo de transfección (p. ej., lipofectamine 2000) con exón HTT 1 cDNA codificación que contiene glutamina 97 repite15 seguido por la región rico poli prolina y estas células se les permitiera expresa pa...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Algunas precauciones son necesarias para que los protocolos anteriores asegurar resultados consistentes y cuantitativos. En primer lugar, mHTT en ambas fracciones espontáneamente forman agregados con el tiempo a múltiples ciclos de descongelación de congelación, especialmente cuando en una alta concentración. Por lo tanto es crítico para congelar alícuotas de las preparaciones de proteínas y descongelar sólo el volumen necesario antes de ejecutar el ensayo como se describe en el protocolo anterior. Además, si fracción in...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los NIH (to1-NS090390). También nos gustaría agradecer al Dr. Joan Steffanfor asistencia técnica y debate durante el desarrollo de este ensayo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro estérilMilliporeSCGP505RETapón de rosca, filtro de vacío estéril
1 mL Triturador de tejidos, Sonicador de357538Wheaton
Qsonicamodelo Q125
DC Ensayo de proteínasBiorad5000111comparable al ensayo de Lowry
Tris 1M solución tampónAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5Msolución TeknovaS0251
GlicerolFisherBP229-1
20% SDS soluciónTeknovaS0295
N-etilmaleimidaSigmaE1271
Fenilmetilsulfonia fluoruro SigmaP7626crea una solución madre de 100 mM en un 100% EtOH, tienda a 4° C
Ortovanadato de sodioSigmaS6508Crear solución madre de 0,5 m en agua
LeupeptinaSigmaL2884Crear solución madre de 10 mg/ml en agua
AprotininaSigmaA1153Crear solución madre de 10 mg/ml en agua
Fluoruro de sodioSigmaS4504Crear solución madre de 500 mM en agua
MilliporeAnti-HTTMAB5492Uso 1:1000 para Western blot, 1:500 para el ensayo de retardo de filtro
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Use 1:1000 para Western blot soluble
Dounce

Referencias

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73(2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710(2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Prote na huntingtinafraccionamiento de prote nasseparaci n soluble insolublepeso molecular elevadoan lisis por Western blotSDS PAGEensayo de prote naslisis celularcentrifugaci nsonicaci n
Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.