Este artículo proporciona un acercamiento actualizado al sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar la formación del órgano, mediante la combinación de nuevos procedimientos experimentales in vitro e in ovo .
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Artículo de método
Enfoque de dos pasos para explorar y finales-inicios de la formación de órganos en el modelo aviar: el timo y glándulas paratiroides organogénesis paradigma
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Resumen
Resumen
El embrión aviar, como un modelo experimental, ha sido de suma importancia para descubrimientos seminales en Biología del desarrollo. Entre varios enfoques, la formación de quimeras de pollo de codorniz y el uso de las membranas corioalantoideas (CAM) para sostener el desarrollo de tejidos ectópicos remontan al siglo pasado. Hoy en día, la combinación de estas técnicas clásicas con las últimas metodologías en vitro ofrece nuevas perspectivas para profundizar en la formación de órganos.
Aquí se describe un enfoque de dos pasos para estudiar y finales-inicios de la organogénesis. Brevemente, la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo del órgano es aislada de embriones de codorniz y crecido en vitro en un sistema organotypic (hasta 48 h). Los tejidos cultivados son posteriormente injertados en la leva de un embrión de pollo. Después de 10 días de desarrollo en ovo , órganos completamente formados se obtienen de los tejidos injertados. Este método también permite la modulación de vías de señalización por la regular administración de agentes farmacológicos y la manipulación genética del tejido a lo largo de los pasos del desarrollo in vitro e in ovo . Además, el desarrollo de los tejidos puede recogerse en cualquier ventana de tiempo para analizar su perfil de expresión génica (mediante PCR cuantitativa (qPCR), microarrays, etc.) y morfología (evaluado con biopsia e histología convencional).
El procedimiento experimental descrito puede utilizarse como una herramienta para seguir la formación del órgano fuera el embrión aviar, de las primeras fases de la organogénesis completamente formado y órganos funcionales.
Introducción
Embriones aves han sido ampliamente utilizados en estudios de Biología del desarrollo seminal. Las principales ventajas del modelo aviar incluyen la posibilidad de abrir el huevo, el relativamente fácil acceso al embrión y la capacidad para realizar la micromanipulación. Algunos ejemplos incluyen el sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar células destino1, aplicación de factores de crecimiento específicos al embrión2y el crecimiento de las estructuras celulares ectópicos en el CAM1,3, 4.
Para obtener nuevos conocimientos en distintas etapas de la formación de órganos, recientemente hemos desarrollado un método que combina técnicas de injertos en vitro la manipulación de los tejidos embrionarios5. El enfoque de dos etapas permite la discriminación y la exploración de ambos - y finales-inicios de la organogénesis, que a menudo se limitan debido a interacciones de tejido altamente dinámicos y complejos2. Por otra parte, la falta de marcadores específicos de tejido adecuados con frecuencia limita el uso de transgénicos modelos animales6. Este novedoso método del enfoque de dos pasos en gran medida supera tales limitaciones.
Para estudiar las primeras etapas de formación del órgano, en el primer paso, el territorio embrionario codorniz que comprende el rudimento de órgano prospectivo es aislado y crecido en un sistema de organotypic in vitro durante 48 h. Durante este período, modulación farmacológica de vías de señalización específicas puede realizarse mediante la adición de drogas en el medio de cultivo5,7. Además, los tejidos cultivados pueden ser recogidos en cualquier etapa de crecimiento en vitro y sondeados para expresión génica (usando métodos tales como qPCR, microarrays, etc.).
En el segundo paso, 48 tejidos h cultivadas son entonces injertados en la leva de un embrión de pollo (c) en el día embrionario (E) 8 (cE8) (Hamburger y Hamilton (HH)-etapas de 33-35)8. La cámara se comporta como un surtidor vascular de nutrientes y permite gas intercambios1,3,4 a los tejidos injertados que permite su desarrollo en ovo por períodos más largos de tiempo. Este paso experimental es especialmente idóneo para estudiar las últimas etapas de la organogénesis, como órganos completamente formados pueden obtenerse después de 10 días en ovo desarrollo5,9,10,11 . Análisis morfológico se realizan fácilmente por la histología convencional para confirmar la formación adecuada del órgano y origen del donante de las células puede ser identificado por immunohistochemistry usando los anticuerpos específicos para cada especie (es decir, MAb codorniz PeriNuclear (QCPN)). Durante el período de incubación de la CAM, injertos también ser crecidos en presencia de agentes farmacológicos y recogidos en cualquier etapa de desarrollo para evaluar la progresión de la organogénesis.
El enfoque de dos pasos, descrito aquí en profundidad, ya se ha empleado en Figueiredo et al. 5 para explorar el desarrollo de primordio común aviar paratiroides/timo. En consecuencia, las particularidades inherentes de los territorios embrionarios y etapas de desarrollo en la organogénesis de la timo y las glándulas paratiroides se presentará a continuación.
El timo y el epitelio de las glándulas paratiroides, aunque funcionalmente distintas, deriva del endodermo de las bolsas faríngeas (PP)12. En aves, los epitelios de estos órganos proceden de la tercera y cuarta PP endodermo (3/4PP)12, mientras que en los mamíferos el epitelio tímico deriva la 3PP y el epitelio de las glándulas paratiroides deriva del 3PP y 3/4PP en ratón y humano, respectivamente de13,14.
Una de las etapas más tempranas en la formación de estos órganos es la aparición de discreta timo y paratiroides dominios en el primordio común. En los pollos, estos dominios pueden identificarse por hibridación en situ , con marcadores moleculares específicos, E4.515. Medida que avanza el desarrollo, estos rudimentos de órganos individualizan y separan de la faringe, mientras que rodea una cápsula mesenquimal fina, formada por las células derivadas de la cresta neural, (en E5; HH-stage 27). Más tarde el epitelio tímico es colonizado por células progenitoras hematopoyéticas (en E6.5; HH-stage 30)12.
Como en estudios clásicos de codorniz-gallina de1,12, el enfoque de dos pasos es particularmente útil para estudiar la formación de los órganos hematopoyéticos/linfoide, es decir el timo5. Como explante de la codorniz, con el rudimento del órgano, se injerta en el embrión de pollo antes de la colonización de células progenitoras hematopoyéticas, un timo quimérico se forma con las células del progenitor transmitidas por la sangre del pollo infiltrando una contraparte epitelial tímica de codorniz. Por lo tanto, este método es una herramienta útil para explorar la contribución de las células hematopoyéticas en el desarrollo del sistema hemato/linfoide aviar.
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Protocolo
Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y normas eticas de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. incubación de codornices fertilizado y huevos de gallina
- Incubar codornices japonesas (japonica del coturnix Coturnix) y huevos de gallina (Gallus gallus) fertilizado durante los días 3 y 8, respectivamente.
- Colocar los huevos con la cámara de aire (extremo romo del huevo) hacia arriba en una incubadora humidificada a 38 ° C.
- Utilizar huevos de codorniz alrededor de 20 y 40 huevos de gallina para realizar este experimento.
Nota: Estos números deben doblarse cuando se establece este procedimiento por primera vez.
2. aislamiento de región embrionaria de codorniz que contiene el territorio presuntivo de rudimentos de timo y paratiroides
Nota: Ejecutar el huevo procedimientos de manipulación en condiciones estériles, utilizando una campana de flujo laminar horizontal y los instrumentos esterilizados y materiales.
- Preparar un recipiente grande de vidrio borosilicato de 3/4 lleno con solución salina fría con tampón fosfato (PBS).
- Abrir un huevo de codorniz después de 3 días de incubación golpeando la cáscara y corte una abertura circular en el lado opuesto de su extremo romo con tijeras curvas. Cuidadosamente retire los trozos de cáscara y transferir el embrión a la taza de cristal llenada de PBS frío.
- Sostener el embrión de codorniz (q) en el E3 (qE3) (la etapa de la codorniz correspondiente a la etapa de HH 21 del pollo) con la ayuda de Pinzas finas. Hacer un corte en la membrana vitelina que envuelve la yema con unas tijeras curvas. Continúan cortadas alrededor y desde el exterior a la circunferencia de los vasos extra embrionarios.
- Transferencia del embrión a un pequeño tazón 3/4 lleno con PBS frío con la ayuda de Pinzas finas. Lave muy bien el embrión de la yema restante adjunto.
- Utilizar una espumadera para transferir el embrión a una copa de 100 mm plato de Petri con base negra (véase Tabla de materiales) que contienen 10 mL de PBS frío.
- Coloque la placa de Petri bajo un estereomicroscopio.
Nota: Desde este punto hacia adelante, realice los procedimientos de microcirugía bajo un estereomicroscopio aumento progresivo. Como fuente de iluminación, se recomienda utilizar luces LED incorporadas en el estereomicroscopio o en las fibras ópticas, teniendo en cuenta la carga térmica limitada. - Mantener el embrión en la parte inferior de la placa con pernos insectos delgados. Coloque cuatro pasadores formando un cuadrado en la región extra embrionario.
- Quite las membranas extra embrionarias de la región cefálica con la ayuda de Pinzas finas y coloque un alfiler Quinta allí.
Nota: Si el embrión está correctamente colocado, entonces la vesícula ótica, el tubo del corazón y la 1st, 2ndy 3rd arcos faríngeos (PAs) deben ser visibles. - Disecar la región embrionaria de interés, es decir, elrd de 3 y 4th de región arco faríngeo (3/4PAR), usando las tijeras de ojo de Wecker.
- Comience cortando longitudinalmente y paralelo al eje del embrión, entre la zona de tubo somite/neural y el PAs.
- Retire el tubo ventral ubicado corazón cortándolo. Mantener las tijeras en la misma posición, girar la caja Petri para volver a colocar el embrión según la dirección del corte.
- Corte entre el 2y y 3rd PAs y por debajo de los 4th PA
- Separar las restantes membranas de la 3/4PAR con la ayuda de Pinzas finas.
- Aspirar los tejidos aislados (3/4PAR) y transfiera a un plato de cristal 3/4 llenan con PBS frío con una pipeta de plástico estéril de 2 mL.
Nota: En adelante, los tejidos pueden ser crecido en vitro hasta 48 horas o inmediatamente ser injertados en la leva de un embrión de pollo en E8. - Mantener el plato de cristal que contiene el aislado 3/4PAR en hielo durante la preparación de la prueba en vitro .
3. in Vitro Organotypic ensayo: cultura de la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo de rudimentos de timo y paratiroides
- Preparar el medio de cultivo con Medio RPMI-1640 suplementado con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina.
Nota: Reactivos farmacológicos Soluble se pueden añadir al medio (por ejemplo, LY-411.575 (Ly) y di-benzazepine o cyclopamine y vismodegib, para inhibir la muesca y Hedgehog (Hh) señalización de vías, respectivamente. Para este ensayo, uso 50-200 nM de Ly o 5-15 μm de Di-benzazepine para inhibir la señalización de Notch en los 3 / 4PAR. Utilice 20 μm del cyclopamine o 10 μm de vismodegib para inhibir la señalización Hh 3/4PAR5. - Preparar el cultivo en vitro de explante 3/4PP en una placa de 6 pozos.
- Llenar un pocillo de la placa de la pozo de 6 con 5 mL de medio de cultivo. Coloque un 24 mm inserción de membrana de policarbonato (véase Tabla de materiales) en el pozo con la ayuda de Pinzas finas.
- Bajo el estereomicroscopio, transferir 3/4PAR explante desde el plato de vidrio a la superficie de la membrana deslizando suavemente con la ayuda de un trasplante de la cuchara (o espátula) y finas pinzas. Coloque los explantes con la parte ventral hacia arriba y el lado dorsal en contacto con la membrana. Añadir hasta siete explantes por inserción de la membrana. Continúe con el paso 3.4.
- Como alternativa, cultura explantes en flotación de filtros de membrana.
- Preparar una placa de Petri con 5 mL de medio de cultivo de 35 mm. Con la ayuda de Pinzas finas, flotador una membrana de filtro (ver Tabla de materiales) y mantener una superficie seca en contacto con el aire.
- Bajo el estereomicroscopio, transferir 3/4PAR explante desde el plato de vidrio para el filtro de membrana suave deslizamiento con la ayuda de un trasplante de la cuchara (o espátula) y finas pinzas. Coloque los explantes con la parte ventral hacia arriba y el lado dorsal en contacto con la membrana. Añadir hasta 8 explantes por filtro de membrana.
- Coloque cuidadosamente los explantes en pasos 3.2 y 3.3 en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO2.
- Después de un período de incubación de 48 horas, retire la placa de 6 pozos y el plato de Petri de 35 mm de la incubadora.
- Recoger los explantes cultivados de la inserción de la membrana de la placa de la pozo 6.
- Añadir PBS a temperatura ambiente (RT) para la inserción de la membrana.
- Separar los explantes de la membrana, el lavado vigoroso con una pipeta de plástico estéril de 2 mL.
- Con la ayuda de la espátula y pinzas finas, transferencia de los explantes cultivados a un plato de cristal 3/4 llenados con PBS a TA.
- Asimismo, recoge los explantes cultivados desde el filtro de membrana flotante en el plato de Petri de 35 mm.
- Transferir el filtro de membrana con unas pinzas finas para un nuevo plato de Petri de 35 mm llenado de PBS a TA.
- Extraer los explantes del filtro de membrana de pipeteo vigoroso utilizando una pipeta de plástico estéril de 2 mL.
- Con la ayuda de Pinzas finas, descarga el filtro de membrana de explante libre después de confirmando que no explantes permanecieron unido a él.
- Con una espátula y pinzas finas, transferencia de los explantes a un plato de cristal llenado de PBS a TA.
- Recoger los explantes cultivados de la inserción de la membrana de la placa de la pozo 6.
- Transferencia de los explantes cultivados con una espátula a 1 mL de un reactivo para el aislamiento de RNA total y para estudios de expresión génica.
PRECAUCIÓN: Exposición a este agente reactivo (véase Tabla de materiales) puede ser un peligro grave para la salud. Utilizar guantes, ropa y gafas protectoras adecuadas. Siga las instrucciones de manejo y leer las hojas de datos de seguridad proporcionadas por el fabricante. - Injerto, los tejidos cultivados en CAM de embriones de pollo en E8. Siga al paso 4.
4. preparación de la CAM
- Retire los huevos de gallina con 8 días de desarrollo embrionario de la incubadora.
Nota: Los huevos fueron incubados con cámara de aire hacia arriba a 38 ° C en una incubadora humidificada. - Cubrir el extremo romo del huevo con cinta de plástico transparente para evitar que pedazos de la cáscara caiga en la cámara de aire. Toque la cáscara y cortar una abertura circular en el huevo con tijeras curvas. La cámara de aire debe ser visible.
- Retire con precaución la membrana blanca de la cámara de aire con unas pinzas finas. CAM es visible y accesible para el trasplante de tejido ectópico.
Nota: No utilice PBS para hidratar la CAM, antes o después del trasplante, ya que PBS promueve el deslizamiento y desplazamiento de los explantes. Si la membrana se seca, desechar el huevo.
5. injerto de los explantes cultivados en la CAM
- Crear pequeñas lesiones/heridas vasculares en vasos más pequeños de la CAM con un microscalpel en un soporte.
Nota: Utilice la punta de una pipeta Pasteur para eliminar sangre por capilaridad en el caso de sangrado excesivo. - Utilizar una espátula y pinzas finas para transferir el explante cultivado para el área de heridos de la CAM.
- Cortar un trozo de un papel de filtro ligeramente más grande que el explante y colóquelo en la parte superior del explante.
Nota: El papel de filtro ayuda a la localización de explante de seguimiento después de su desarrollo en la CAM. También, permite entrega diaria de la droga para el explante durante el desarrollo de ovo , si es necesario (descrito en el paso 5.6). - Sello de la ventana de huevo con cinta de plástico transparente e identificarlo utilizando un lápiz carbón.
Nota: La cinta plástica protege el embrión de la deshidratación durante el período de incubación. - Incubar el huevo manipulado durante 10 días en una incubadora humidificada a 38 ° C. Seguir al paso 6.
- Paso opcional: Drogas la administración diaria durante el período de incubación.
- Para acceder al filtro, levante parcialmente la cinta plástica. Añada 100 μl de solución de fármaco, gota a gota, sobre el papel. Volver a cerrar la ventana y volver a colocar el huevo en la incubadora humidificada a 38 ° C.
Nota: Para este ensayo, la dosis de 20 μm de cyclopamine inhiben la señalización Hh durante en ovo desarrollo5.
- Para acceder al filtro, levante parcialmente la cinta plástica. Añada 100 μl de solución de fármaco, gota a gota, sobre el papel. Volver a cerrar la ventana y volver a colocar el huevo en la incubadora humidificada a 38 ° C.
6. formación del órgano ectópico en la CAM tras 10 días de desarrollo de Ovo
- Después de 10 días de incubación, retirar el huevo de la incubadora y retirar cuidadosamente la cinta plástica.
- Corte la CAM en la región de filtro con tijeras curvas y transferencia explante derivado de CAM con papel de filtro a un vaso pequeño tazón 3/4 lleno con PBS frío.
- Con la ayuda de Pinzas finas transferencia explante derivado de CAM a una placa de Petri de 100 mm con base negra que contiene 10 mL de PBS. Retire con cuidado el papel de filtro y el exceso de membrana usando Wecker ojo tijeras y pinzas finas.
- CAM-explante de transferencia a la solución de fijación (3,7% PFA en PBS) con una espumadera. Eutanasia a los embriones de pollo sin quitarlas del huevo haciendo un corte preciso en la región del cuello del embrión con la ayuda de tijeras grandes.
- Evaluar la formación de órganos en secciones de parafina de los explantes derivados de CAM por inmunohistoquímica e histología convencional.
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Resultados
Lo anterior describe detalles del Protocolo de un método que permite la investigación de ambos - y finales-inicios de la organogénesis, a menudo limitada por complejas interacciones celulares y moleculares.
Este método fue empleado anteriormente en Figueiredo et al. 5 para desentrañar el papel de Notch y Hh de señalización en el desarrollo de primordio común aviar paratiroides/timo.
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Discusión
Un aspecto crucial para el éxito de este método es la calidad del pollo y codornices huevos. Teniendo en cuenta los períodos de incubación, especialmente durante el ensayo en ovo , una buena calidad de huevos de gallina mejora viabilidad precios (hasta un 90%) al final del procedimiento. Para lograr esto, prueba de huevos de diferentes proveedores. Incubar los huevos unmanipulated durante largos períodos (hasta 16-17 días) y comprobar su desarrollo. Para ser considerado un lote de buena calidad, más del 80% de l...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores están agradecidos con António Cidadão, Isabel Alcobia y Leonor Parreira para la lectura crítica del manuscrito, a Padma Akkapeddi para la narración del video, y a Vitor Proa desde el servicio de histología del Instituto de Histologia e Biologia Desarrollo, Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para el soporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro y Hugo Silva de la unidad de audiovisuales (equipo Audiovisual), Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa por su compromiso excepcional con la producción de este video. Reconocemos Leica Microsystems para proporcionar amablemente un estereoscopio equipado con sistema de video y Interaves - Sociedade Agro-pecuaria, S.A. para contribuir con codorniz huevos fertilizados. Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Huevos fertilizados de gallina (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Granja avícola | |
| Huevos fecundados de codorniz (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Granja de aves | |
| Tubos de centrífuga de PP de 15 mL | Tubos de | ||
| Corning | 430290 | ||
| Placas de Pyrex de 60 x 20 mm | Grupo Duran | 21 755 41 | |
| Placas de Pyrex de 100 x 20 mm | Grupo Duran | 21 755 48 | |
| Inserto de membrana de policarbonato | Corning | 3412 | transwell de 24 mm con inserto de membrana de policarbonato de poro de 0,4 mm |
| Filtro de membrana | Millipore DTTP01300 | 0,6 mm Filtro de membrana Isopore | |
| Placas de cultivo de 6 pocillos | Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675 | ||
| Placa de Petri, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Cuencos | del supermercado | ||
| Pipetas de transferencia | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | Pipeta de plástico de 2 mL |
| Pipeta de vidrio pasteur | normax 5426015 | ||
| Whatman papel de filtro cualitativo | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Papel de filtro |
| Cinta | de supermercado | ||
| Citoqueratina (pan; ácida y básica, citoqueratinas tipo I y II), clon Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Hidrato de ciclopamina | Sigma-Aldrich | C4116 | Inhibidor farmacológico de la señalización de Hh |
| fetal bovino sérico | , Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN anticuerpo | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | QCPN | |
| RPMI 1640 Medio, Suplemento GlutaMAX | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Elastómero de silicona Kit 1,1 kg | ELKEM/Silmid | RH141001KG | Para preparar la base trasera de la placa de Petri |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Inhibidor farmacológico de la señalización de Notch |
| Reactivo TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 Reactivo para el aislamiento total de ARN | |
| Dumont #5 Pinzas | Herramientas de Ciencias Finas | 11251-30 | Pinzas finas |
| Tijeras Bonn extrafinas, curvadas | Fine Science Tools | 14085-08 | Tijeras curvas Alfileres para |
| insectos | Herramientas de ciencia fina | 26001-30 | |
| Micro espátula | Herramientas de ciencia fina | 10087-12 Cuchara de | trasplante |
| Pines de minutiense | Herramientas de ciencia fina | 26002-20 | Microbisturí |
| Moria Soporte de alfiler niquelado Herramientas | ciencia fina | 26016-12 | Soporte |
| Moria Cuchara perforada Herramientas | ciencia fina | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Tijera de ojo | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Cámara | Leica Microsystems | Estereoscopio MC170 HD | |
| Leica | Microsystems | Leica M80 | |
| Leica Microsystems | DM2500 |
Referencias
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