Este artículo proporciona un acercamiento actualizado al sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar la formación del órgano, mediante la combinación de nuevos procedimientos experimentales in vitro e in ovo .
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Artículo de método
Enfoque de dos pasos para explorar y finales-inicios de la formación de órganos en el modelo aviar: el timo y glándulas paratiroides organogénesis paradigma
En este artículo
Resumen
Resumen
El embrión aviar, como un modelo experimental, ha sido de suma importancia para descubrimientos seminales en Biología del desarrollo. Entre varios enfoques, la formación de quimeras de pollo de codorniz y el uso de las membranas corioalantoideas (CAM) para sostener el desarrollo de tejidos ectópicos remontan al siglo pasado. Hoy en día, la combinación de estas técnicas clásicas con las últimas metodologías en vitro ofrece nuevas perspectivas para profundizar en la formación de órganos.
Aquí se describe un enfoque de dos pasos para estudiar y finales-inicios de la organogénesis. Brevemente, la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo del órgano es aislada de embriones de codorniz y crecido en vitro en un sistema organotypic (hasta 48 h). Los tejidos cultivados son posteriormente injertados en la leva de un embrión de pollo. Después de 10 días de desarrollo en ovo , órganos completamente formados se obtienen de los tejidos injertados. Este método también permite la modulación de vías de señalización por la regular administración de agentes farmacológicos y la manipulación genética del tejido a lo largo de los pasos del desarrollo in vitro e in ovo . Además, el desarrollo de los tejidos puede recogerse en cualquier ventana de tiempo para analizar su perfil de expresión génica (mediante PCR cuantitativa (qPCR), microarrays, etc.) y morfología (evaluado con biopsia e histología convencional).
El procedimiento experimental descrito puede utilizarse como una herramienta para seguir la formación del órgano fuera el embrión aviar, de las primeras fases de la organogénesis completamente formado y órganos funcionales.
Introducción
Embriones aves han sido ampliamente utilizados en estudios de Biología del desarrollo seminal. Las principales ventajas del modelo aviar incluyen la posibilidad de abrir el huevo, el relativamente fácil acceso al embrión y la capacidad para realizar la micromanipulación. Algunos ejemplos incluyen el sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar células destino1, aplicación de factores de crecimiento específicos al embrión2y el crecimiento de las estructuras celulares ectópicos en el CAM1,3, 4.
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Protocolo
Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y normas eticas de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. incubación de codornices fertilizado y huevos de gallina
- Incubar codornices japonesas (japonica del coturnix Coturnix) y huevos de gallina (Gallus gallus) fertilizado durante los días 3 y 8, respectivamente.
- Colocar los huevos con la cámara de aire (extremo romo del huevo) hacia arriba en una incubadora humidificada a 38 ° C.
- Utilizar huevos de codorniz alrededor de 20 y 40 huevos de gallina para realizar este experimento.
Nota: Estos números deben doblarse cuando se es....
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Resultados
Lo anterior describe detalles del Protocolo de un método que permite la investigación de ambos - y finales-inicios de la organogénesis, a menudo limitada por complejas interacciones celulares y moleculares.
Este método fue empleado anteriormente en Figueiredo et al. 5 para desentrañar el papel de Notch y Hh de señalización en el desarrollo de primordio común aviar paratiroides/timo.
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Discusión
Un aspecto crucial para el éxito de este método es la calidad del pollo y codornices huevos. Teniendo en cuenta los períodos de incubación, especialmente durante el ensayo en ovo , una buena calidad de huevos de gallina mejora viabilidad precios (hasta un 90%) al final del procedimiento. Para lograr esto, prueba de huevos de diferentes proveedores. Incubar los huevos unmanipulated durante largos períodos (hasta 16-17 días) y comprobar su desarrollo. Para ser considerado un lote de buena calidad, más del 80% de l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores están agradecidos con António Cidadão, Isabel Alcobia y Leonor Parreira para la lectura crítica del manuscrito, a Padma Akkapeddi para la narración del video, y a Vitor Proa desde el servicio de histología del Instituto de Histologia e Biologia Desarrollo, Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para el soporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro y Hugo Silva de la unidad de audiovisuales (equipo Audiovisual), Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa por su compromiso excepcional con la producción de este video. Reconocemos Leica Microsystems para proporcionar amablemente un estereoscopio equipado con s....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Huevos fertilizados de gallina (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Granja avícola | |
| Huevos fecundados de codorniz (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Granja de aves | |
| Tubos de centrífuga de PP de 15 mL | Tubos de | ||
| Corning | 430290 | ||
| Placas de Pyrex de 60 x 20 mm | Grupo Duran | 21 755 41 | |
| Placas de Pyrex de 100 x 20 mm | Grupo Duran | 21 755 48 | |
| Inserto de membrana de policarbonato | Corning | 3412 | transwell de 24 mm con inserto de membrana de policarbonato de poro de 0,4 mm |
| Filtro de membrana | Millipore DTTP01300 | 0,6 mm Filtro de membrana Isopore | |
| Placas de cultivo de 6 pocillos | Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675 | ||
| Placa de Petri, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Cuencos | del supermercado | ||
| Pipetas de transferencia | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | Pipeta de plástico de 2 mL |
| Pipeta de vidrio pasteur | normax 5426015 | ||
| Whatman papel de filtro cualitativo | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Papel de filtro |
| Cinta | de supermercado | ||
| Citoqueratina (pan; ácida y básica, citoqueratinas tipo I y II), clon Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Hidrato de ciclopamina | Sigma-Aldrich | C4116 | Inhibidor farmacológico de la señalización de Hh |
| fetal bovino sérico | , Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN anticuerpo | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | QCPN | |
| RPMI 1640 Medio, Suplemento GlutaMAX | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Elastómero de silicona Kit 1,1 kg | ELKEM/Silmid | RH141001KG | Para preparar la base trasera de la placa de Petri |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Inhibidor farmacológico de la señalización de Notch |
| Reactivo TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 Reactivo para el aislamiento total de ARN | |
| Dumont #5 Pinzas | Herramientas de Ciencias Finas | 11251-30 | Pinzas finas |
| Tijeras Bonn extrafinas, curvadas | Fine Science Tools | 14085-08 | Tijeras curvas Alfileres para |
| insectos | Herramientas de ciencia fina | 26001-30 | |
| Micro espátula | Herramientas de ciencia fina | 10087-12 Cuchara de | trasplante |
| Pines de minutiense | Herramientas de ciencia fina | 26002-20 | Microbisturí |
| Moria Soporte de alfiler niquelado Herramientas | ciencia fina | 26016-12 | Soporte |
| Moria Cuchara perforada Herramientas | ciencia fina | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Tijera de ojo | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Cámara | Leica Microsystems | Estereoscopio MC170 HD | |
| Leica | Microsystems | Leica M80 | |
| Leica Microsystems | DM2500 |
Referencias
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological ....
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Reimpresiones y permisos
