Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Resumen

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Resumen

Microglía representan el 5-10% de todas las células del sistema nervioso central (SNC) y son cada vez más llamar la atención debido a sus contribuciones durante el desarrollo, homeostasis y enfermedad. Aunque los macrófagos han sido estudiados en detalle por décadas, características especializadas de la microglía, los macrófagos residentes de tejido del SNC, se han mantenido en gran parte misteriosa, en parte debido a las limitaciones en la capacidad para recapitular microglial maduro propiedades en la cultura. Aquí ilustramos un sencillo procedimiento para el aislamiento rápido de puro microglia del cerebro de roedores maduros. También describimos las condiciones de cultivo libre de suero que soportan altos niveles de microglial viabilidad con el tiempo. Microglia cultivada bajo estas condiciones del medio definen exhiben elaborados procesos ramificados y comportamiento dinámico de la vigilancia. Ilustramos algunos efectos de la exposición del suero en microglia cultivada y discutir cómo estas culturas sin suero comparan culturas expuestas al suero, así como microglia en vivo.

Introducción

Como los macrófagos de la parenquimia del CNS, microglia interactuar con una amplia gama de circuitos neuronales y gliales redes de señalización. Desempeñan funciones vitales en el desarrollo y homeostasis del cerebro a través de la poda sináptica, separación de células apoptotic y transitorias interacciones con procesos neuronales^1,2. Microglia son primeros respondedores a lesiones neurológicas, ampliando sus procesos de largas y delgadas a los sitios de lesión para coordinar las respuestas inflamatorias y limitar el sangrado^3,4. Cambios en la morfología de microglial y función son ubicuos en lesiones CNS agudas y crónicas, y microglia exposición altera morfología, localización y expresión de mediadores inflamatorios en una amplia gama de Estados de enfermedad¹. Estudios genéticos en humanos indican que las mutaciones que alteran el riesgo de enfermedades neurodegenerativas son a menudo predominantemente o exclusivamente expresadas por microglia del sistema nervioso intacto, apuntando hacia un papel crítico para la microglia en la patogénesis de la enfermedad o progresión de la⁵ . Dada su prominencia en accidentes y enfermedades, favorecer la comprensión de la biología de microglial es una alta prioridad para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.

Han surgido muchos avances fundamentales para la comprensión de la biología de microglial extrapolando mecanismos descubiertos en estudios de otras poblaciones de macrófagos incluyendo métodos de cultivo, perfiles de expresión génica y definiciones funcionales y técnicas / morfológicas Estados. Aunque generalizado macrófago funciones a menudo juegan de manera sorprendente dentro del panorama de la CNS, microglía son altamente especializados, exhiben una morfología ramificada y una firma de expresión de gen único que les diferencia de otros tejidos los macrófagos⁶. Microglia tienen un linaje que es distinto de la mayoría de los otros macrófagos; colonizar el SNC durante una temprana ola embrionaria de hematopoyesis primitiva y uno mismo-renovar toda la vida, independiente de las contribuciones de hematopoyesis definitiva⁷. La firma de expresión de gen completamente maduros de microglia adultos no se logra hasta la segunda semana postnatal⁸. Señales ambientales del tejido circundante juegan un papel importante en el dictado de macrófagos de tejido-específica características⁶, que en el SNC incluye exposición limitada a factores transmitidos por la sangre por la barrera hemato - encefálica⁹.

Un obstáculo para comprender plenamente microglial contribuciones a CNS homeostasis y enfermedad es la dificultad de recapitular las propiedades especializadas de microglia madura visto en vivo con células purificadas en vitro. Muchos métodos han sido desarrollados para aislar y microglia intacta de la cultura, pero la mayoría de enfoques dependen de suero para apoyar la supervivencia de la célula. Hemos demostrado que además del suero, que es un reactivo inherentemente variable que contiene una gran variedad de moléculas bioactivas, es particularmente problemático cuando trabajo con microglia ya que promueve una morfología ameboides, incrementa la proliferación, y aumento de fagocitosis⁹ a menudo visto en vivo cuando microglía están expuestos a factores de sangre después de la interrupción de la barrera blood - brain. De estas métricas, expuestas al suero de las células se asemejan a microglia en lesiones o enfermedades, pero tales alteraciones se reducen cuando microglia se cultivan en el medio de crecimiento definido con CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterol y selenita.

Este protocolo proporciona información detallada para el cultivo de rata juvenil microglia en condiciones libres de suero, relacionados con la obra recientemente publicada⁹. Este protocolo se ha racionalizado para las ratas de día postnatal 21-30 (P21 - P30), pero puede ser adaptado para aislar microglia de ratas y ratones de cualquier edad, aunque el rendimiento y la viabilidad general varían dependiendo de la especie y edad del animal. Máximo rendimiento y viabilidad óptima se logra cuando se usa ligeramente inmaduro microglia (~ P9), con rendimientos y viabilidad estrechándose gradualmente a algo de niveles más bajos en animales adultos. Microglía también puede ser aislado de ratones, pero hemos encontrado que las células de rata muestran significativamente mayor rendimientos, viabilidad y la complejidad de la morfología ramificada, en comparación con las células de ratón en cultivos libres de suero. Animales de edad superior a P50 no han sido evaluadas con este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de immunopanning ha sido optimizado para reducir al mínimo cambios en perfiles transcripcionales microgliales durante el aislamiento y para maximizar la viabilidad posterior de las células. Usando estas técnicas y formulaciones de los medios de comunicación, cultivos primarios de alta viabilidad pueden mantenerse por semanas. Microglia cultivada bajo estas condiciones presentan una morfología muy ramificada con rápida extensión y retracción de los procesos y relativamente bajas tasas de proliferación. Resaltar la importancia de suero-exposición de estas características y discutir las fortalezas y debilidad de este método en comparación con otros enfoques.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran a roedores conforman a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplan con las políticas y las leyes estatales y nacionales. Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Administrativo de la Universidad de Stanford sobre cuidado de animales de laboratorio.

Nota: Todas las composiciones solución y buffer son proporcionadas en la Tabla de materiales.

1. prepare una placa de Petri Immunopanning de CD11b (día 0)

Nota: Preparar 1 immunopanning plato de cada cerebro de rata juvenil 1-2.

1. Añadir 25 mL de 50 mM solución de Tris pH 9.5 a un plato de Petri de 15 cm.
2. Añadir cabra anti-ratón IgG (cadenas H + L) en el plato para una concentración final de 6 μg/mL. Remolino de placa para distribuir uniformemente.
3. Incubar el plato para 1-3 h a 37 ° C.
4. Platos de enjuague tres veces con DPBS⁺⁺ (tampón fosfato salino (PBS) con Ca^{2 +} y Mg^{2 +}), reemplácelo con una solución de lavado tampón que contiene 1 μg/mL de anticuerpos OX42. Deje los platos durante la noche a temperatura ambiente sobre una superficie plana.

2. tejido colección (día 1)

Nota: Este protocolo debe tomar ~ 3-4 h.

1. Antes de empezar, asegúrese de que todas las soluciones son estériles y refrigeradas con hielo. Enfriar todos los instrumentos en el hielo y esterilizar con etanol antes de usarlo.
2. Siguientes procedimientos regulatorios apropiados, sacrificar a una rata de laboratorio juvenil por asfixia dióxido de carbono.
   Nota: Como alternativa, animales más jóvenes que sean sacrificados con una dosis letal de ketamina/xilacina (100-200 μL de 24 mg/mL ketamina, xilacina 2.4 mg/mL). Ketamina/xilacina debe usarse si los animales son menos de 14 días de edad. Si utiliza múltiples animales, extraer el tejido de un animal y lo coloca en DPBS previamente enfriada⁺⁺ en hielo antes de proceder a los siguientes animales.
3. Pellizque un hindpaw y asegurar la insensibilidad completa del animal antes de proceder.
4. Transcardially perfusión el animal con 10-30 mL de tampón de la helada de la perfusión mediante una aguja de 27½-G hasta que el búfer funcione claro.
   Nota: Volumen de perfusión tampón variará dependiendo del tamaño, edad del animal.
5. Inmediatamente después de la perfusión, quitar la cabeza del animal. Provenientes de la médula espinal cortada el cóndilo occipital a cada lado con tijeras de disección, tenga cuidado de no dañar el cerebro. Después de cortar cada lado con cuidado, corte para arriba de un lado a lo largo de los parietales y el hueso frontal hacia el hueso nasal. Con pinzas cuidadosamente tire hacia atrás la parte superior del cráneo, rápidamente Retire el cerebro (o estructuras de CNS de interés) y coloque en DPBS previamente enfriada⁺⁺ en hielo.
6. Repita para todos los animales restantes.
   Nota: Todos los pasos de procedimiento deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles adecuadas.

3. mecánica disociación (día 1)

1. Después de todos los cerebros han sido recogidos, picar un cerebro en trozos de³ 1 mm en una placa Petri sobre el hielo con una hoja de bisturí frío y transferir a un homogeneizador dounce helada con 5-7 mL de tampón de douncing helada. Disociar un cerebro en un momento.
2. Disociar el tejido con 10-20 movimientos suave e incompletas con un homogeneizador de dounce sueltas. Tenga cuidado de no aplastar directamente el tejido en la parte inferior de la homogeneizadora, pero en su lugar impulsar el tejido a través del espacio entre los lados del pistón y el homogenizador.
3. Retire con cuidado el pistón para evitar la introducción de burbujas de aire. Permite trozos de tejido mal disociada a instalarse en la parte inferior de la homogeneizadora y transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL refrigerado nuevo.
4. Reemplazar el volumen quitado con tampón de douncing fresca y repita los pasos 3.2 y 3.3 para un total de 3-4 rondas o hasta que todo el tejido ha sido disociado. Repita el procedimiento para cada cerebro.

4. mielina retiro (día 1)

Nota: Eliminación de la mielina se utiliza para el aislamiento de la microglía de animales mayores de P12.

1. Medir el volumen de la suspensión de células en el tubo cónico de 50 mL con una pipeta de 25 mL, luego agregar helado douncing tampón para ajustar el volumen total en mL 33,5.
2. Añadir 10 mL de tampón de separación de mielina (MSB) a la suspensión de células y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Esto resultará en una concentración final del 23% de MSB en un volumen de 43,5 mL.
3. Centrifugar las células durante 15 min a 500 x g a 4 ° C con el frenado lento.
   Nota: La centrífuga debe tomar aproximadamente 1.5-2 min a desacelerarse. Esto generará una capa superior de mielina y restos de células muertas, un sobrenadante algo turbio y un pellet más pequeños que se enriquece para células vivas.
4. Quitar la capa superior de la ruina del myelin y el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado al retirar la capa superior para asegurar que gran parte se elimina como sea posible.
5. Resuspender el precipitado de células en 12 mL de tampón de lavado. Triturate suavemente la suspensión de celular romper cualquier grumos de células que puedan quedar.

5. Immunopanning (día 1)

1. Pasar la suspensión celular a través de un colador de celular de 70 μm para eliminar basura grande o grupos de células.
2. Enjuagar el plato barrido tres veces con DPBS⁺⁺OX42 cubierto. No permita que la placa se seque completamente entre lavados.
3. Retirar el último lavado DPBS⁺⁺ y aplique la suspensión filtrada al plato barrido. Suavemente la placa para distribuir las células del remolino, luego Incube la placa en una superficie plana, a temperatura ambiente durante 20 minutos permitir que las células se adhieran. No incubar más de 20 min o células será muy difíciles recuperarse del plato.
4. Enjuagar el plato barrido con DPBS⁺⁺ 10 veces para eliminar las células no adherentes. Microglia será tan firmemente conectada a la placa, agitar la placa con cada enjuague para asegurar el retiro de otras células no adherentes.
5. Retirar el último lavado DPBS⁺⁺ y reemplace con DPBS⁺⁺ de 15 mL y 200 μL tripsina (solución stock de 1.25%).
6. Incubar el plato ≤10 min a 37 ° C con 10% CO₂ para trypsinize.
   Nota: No continúe más de 10 min o microglia será difícil de quitar.
7. Después de 10 min de la tripsinización, microglia todavía se ser pegado a la placa. Vierta de tripsina/DPBS⁺⁺ y lave suavemente 2 x con DPBS⁺⁺ eliminar tripsina, reemplazar con 12 mL de medio de crecimiento de microglia helada (MGM).
8. Lavado plato en hielo durante 2 minutos para ayudar a debilitar la interacción celular/substrato y asegúrese de que el plato es plana para evitar que áreas del plato barrido de la desecación.
9. Pipetear enérgicamente con un controlador de pipeta y pipeta 10 mL de alta velocidad para recuperar las células de la fuente de barrido. Dibujar una cuadrícula de 16 x 16 con la corriente de líquido de la pipeta para tratar de eliminar todas las células.
10. Compruebe las células bajo un microscopio de 20 aumentos para asegurarse de que las células han separado de la placa. Marcar puntos sobre el plato donde las células se pegan todavía y repita el pipeteo en esas áreas.
11. Recoger la suspensión celular y alícuota 3-4 mL del sobrenadante por el tubo cónico de 15 mL. Vuelta por 15 min a 500 x g a 4 ° C con el frenado lento.
    Nota: Microglia a través de un pequeño volumen de giro permite la recuperación máxima de las células.
12. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 mL de MGM con el precipitado de células.
13. Resuspender cada precipitado en MGM restante y las células de los tubos de la piscina.
14. Contar celdas con hemocitómetro.
15. Células de la placa como se describe en los pasos 6 - 7 dependiendo de la aplicación.
16. Células en cultivo a 37 ° C con 10% CO₂.
    Nota: Las células pueden ser cultura para hasta 3-4 semanas con cambios regulares de los medios de comunicación o una semana sin cambios de los medios de comunicación.

6. punto capa las placas de cultivo de tejidos/cubreobjetos (día 1)

1. Placa de 15 μl de la capa de colágeno IV en el centro de una placa de cultivo de tejidos recubiertos 24-pozo aniónico/catiónico (para detalles, véase Tabla de materiales ) e incubar por 15 min a 37 ° C con 10% CO₂.
2. Después de contar las células con hemocitómetro diluir las células a 2.3 x 105/ml en MGM. Aspirar en lugar de colágeno IV y placa 15 μl de la suspensión celular a este lugar; Esto le dará 3.5 x 10³ células/punto. Incubar durante 5-10 min a 37 ° C con 10% CO₂ para permitir que las células se adhieren, Añadir 500 μl de CO_{2 -}equilibrado que contiene medio de crecimiento TGF-β2 y IL-34/colesterol (TIC) suavemente hacia el pozo.
3. Si la galjanoplastia en cubreobjetos, primera capa cubreobjetos de vidrio estéril con 10 μg/mL estratagema-D-lisina (PDL) en H₂O por 1 h a temperatura ambiente, lavar 3 veces con H₂O y dejar secar en una campana bajo luz UV. Una vez seco cubreobjetos, proceder con la galjanoplastia del punto sobre el cubreobjetos como se describe en el paso 6.2.

7. recubrimiento para el aislamiento de RNA/proteína

1. El día 1, capa toda la zona de un 24-pozo aniónico/catiónico revestido en placa de cultivo de tejidos con la capa de colágeno IV e incubar por 10 min - 1 h a 37 ° C con 10% CO₂, luego retire e inmediatamente la placa 3-5 x 10⁴ células/pozo en CO₂ equilibrado Medios de comunicación TIC.
2. En el día 2, realizar un cambio de media de 50% para cada uno bien el día después de la preparación. Las células muertas tienden a cluster en el centro del pozo, así que los medios de comunicación a partir de ahí.
3. Realizar un cambio de media de 50% cada 2-3 días para mantener los cultivos. Si los cambios de los medios de comunicación introducen una variable no deseada de las culturas, las células pueden sobrevivir aproximadamente una semana sin ningún cambio de los medios de comunicación, frente a más de 3 semanas con mantenimiento regular.

Resultados

Este protocolo describe un método de cultura alta pureza ramificado microglia de ratas juveniles. Resultados similares pueden obtenerse utilizando animales inmaduros, perinatales y adultos, como se explica a continuación. Desde aislamientos celulares suelen incluyen matices sutiles y muchas oportunidades para que las células mueren, usamos puntos de control de calidad para ayudar a determinar el éxito en varios pasos. Normalmente supervisamos suspensiones celulares usando un hemocitómetro...

Discusión

Porque microglia sirva de centinela de las células inmunes de la CNS, son altamente sensibles a los cambios ambientales; por lo tanto, se requiere gran cuidado para reducir al mínimo las respuestas inflamatorias dentro de las células durante el aislamiento y cultura⁸. Esto se logra en este protocolo a través de la velocidad y la temperatura. Mantener las células en hielo o a 4 º C siempre que sea posible reduce la activación, por lo que realizará todos los pasos de centrifugación a 4 ° C, los anim...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rata: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
ratón anti-rata CD11b monoclonal (clon OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Paneo: 1:1,000; Tinción: 1:500
Cabra policolonia anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Tinción: 1:500
Conejo policlonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Tinción: 1:500
Alexa Fluor Burro anti-ratón 594	Invitrogen	Cat# 11055	Tinción: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-cabra 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Tinción: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Tinción: 1:500
Triton-X (detergente en tinción ICC)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparán sulfato	Galen Suministros de laboratorio	Cat# GAG-HS01
Heparina	Sigma	Cat# M3149
Peptona de sólidos lácteos	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Lana ovina colesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Colágeno IV	Corning	Cat# 354233
Ácido oleico	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Ácido eicosadienoico (gondoico) Productos	químicos de las Islas Caimán	Cat# 20606
Calceína AM colorante	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington Cat	# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Tripsina	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicilina/ Estreptomicina	Gibco Cat	# 15140-122
Glutamina	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetilcisteína	Sigma	Cat# A9165
Insulina	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Selenito de sodio	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (alta glucosa)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lisina	Sigma	Cat# A-003-E
Placas Primarias	VWR	Cat# 62406-456
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Reactivos bursátiles
Apo-transferrina			Reconstitución: 10 mg/mL en PBS Concentración utilizada: 1:100 Almacenamiento: -20° C
N-acetilcisteína			Reconstitución: 5 mg/mL en H2O Concentración utilizada: 1:1.000 Almacenamiento: -20° C
Selenito			Reconstitución: 2.5 mg/mL en H2O Concentración utilizada: 1:25,000 Almacenamiento: -20° C
Colágeno IV			Reconstitución: 200 μ g/mL en PBS Concentración utilizada: 1:100 Almacenamiento: -80° C
TGF-b2			Reconstitución: 2 mg/mL en PBS Concentración utilizada: 1:1,000 Almacenamiento: -20° C
IL-34			Reconstitución: 200 μ g/mL en PBS Concentración utilizada: 1:1,000 Almacenamiento: -80° C
		lana ovina	Reconstitución: 1,5 mg/mL en etanol al 100% Concentración utilizada: 1:1.000 Almacenamiento: -20° C
Sulfato			Reconstitución: 1 mg/mL en H2O Concentración utilizada: 1:1.000 Almacenamiento: -20° C
Ácido oleico/Ácido			Reconstitución: Gondoico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL en etanol al 100% Concentración utilizada: 1:1.000 Almacenamiento: -20° C
Reconstitución de heparina			: 50 mg/mL en PBS Concentración utilizada: 1:100 Almacenamiento: -20° C
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Solutions  Receta de tampón
		perfusión
de tampón			: 200 μ L de 0,4% de DNasaI en 50 mL de DPBS++ Observaciones: Úselo cuando esté helado
Tampón			Receta: 2 mg/mL de peptona de sólidos lácteos en DPBS++Medio de
microglía (MGM)			Receta: DMEM/F12 que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 μ g/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 5 μ g/mL de N-acetilcisteína, 5 y mu; g/mL de insulina, 100 μ g/mL de apo-transferrina y 100 ng/mL de selenito de sodio Observaciones: Use MGM helado para desbancar la microglía de la placa de inmnopanning.
Receta de recubrimiento			: MGM que contiene 2 μ g/mL de colágeno IV
Tampón			Receta: 9 mL de Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS sin Ca++ y Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2 Observaciones: Mezclar bien después de la adición de  CaCl2 y MgCl2
TGF-b2 / IL-34 / Medios de crecimiento que contienen colesterol (TIC)			Receta: MGM que contiene 2 ng/mL de TGF-b2 humano, 100 ng/mL de IL-34 murino, 1,5 μ g/mL de colesterol de lana ovina, 10 μ g/mL de heparán sulfato, 0,1 μ g/ml de ácido oleico, y 0,001 μ g/ml de ácido gondoico Observaciones: Asegúrese de agregar colesterol a los medios calentados a 37 & grados; C y no agregue más de 1.5 μ g/mL o se precipitará. No filtre los medios que contengan colesterol. Equilibre los medios TIC con 10% de CO2 durante 30 minutos a 1 hora antes de agregarlos a las celdas para asegurar un pH óptimo.

de sodio Colesterol de de heparán gondoico > : 50 μ g/mL de heparina en DPBS++ (PBS con Ca++ y Mg++) Observaciones: Úselo cuando esté heladoReceta Douncing de paneo crecimiento de de colágeno IV de separación de mielina