Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Resumen

Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.

Resumen

Visualización del ADN para microscopía de fluorescencia utiliza una variedad de tintes tales como los colorantes de Cianina. Estos colorantes son utilizados debido a su alta afinidad y sensibilidad para el ADN. Para determinar si las moléculas de ADN son completas después de la terminación del experimento, se requiere un método para determinar si las moléculas de tinción son longitud total por digestión de DNA con enzimas de restricción. Sin embargo, DNA manchada puede inhibir las enzimas, por lo que es necesario un método para determinar qué enzimas se puede usar para el fluorocromo mancharon ADN. En este método, el ADN se tiñe con un tinte de Cianina durante la noche para permitir que el tinte y el ADN se equilibren. Siguiente, tiñe ADN es digerido con una enzima de restricción, cargan en un gel y al. Las bandas de digestión de ADN experimentales son comparadas a una digestión en silico para determinar la actividad de la enzima de la restricción. Si hay el mismo número de bandas, como era de esperar, la reacción es completa. Bandas más de lo esperado indica la digestión parcial y menos bandas indican digestión incompleta. La ventaja de este método es su simplicidad y utiliza equipos que un científico necesita de una enzima de la restricción análisis y electrophoresis del gel. Una limitación de este método es que las enzimas disponibles para la mayoría de los científicos son las enzimas comercialmente disponibles; sin embargo, podría utilizarse cualquier enzimas de restricción.

Introducción

La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3 y BOBO-3; Tabla 1) se utiliza en una amplia variedad de experimentos donde la visualización de ADN es necesario^{1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13....}

Protocolo

1. preparación de colorantes, Buffers y Gel de la agarosa

1. Preparar las siguientes soluciones para la tinción de ADN o la digestión de ADN teñido.
   1. Preparar 1 x TE (Tris-HCl y etilendiaminotetracético ácido; Tampón EDTA) con 10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA en un cilindro graduado o un matraz aforado. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).
   2. Hacer alícuotas de cada tinte: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabla 1). Pipetear 4 μL de colorante de 1 mM en un ámbar oscuro o negro tubo de 1,5 mL y añadir 36 μl de TE 1 x, mezclar con la pipeta; Esta concentración hace que una solución de tinte de 10....

Resultados

Con el fin de determinar que si un colorante intercalante afecta una enzima de restricción que digiere ADN, el orden correcto de pasos debe ser seguidos (figura 1). Una vez que el ADN es manchado y digerido con una enzima dada, una imagen del gel puede tomarse para determinar el número de fragmentos y su tamaño (figura 2). Para determinar la eficiencia de la enzima, el número total de bandas visibles esperados dividido por el núm.......

Discusión

Para digerir el ADN etiquetado fluorescente (figura 1), se requieren una serie de pasos. En primer lugar, ADN se tiñe con un fluorocromo durante la noche. ADN puede incubarse con dímeros de Cianina por un período más corto de tiempo; sin embargo, Carlsson et al encontraron que ADN creado bandas doble para cada tamaño de ADN debido a la tinción incompleta²⁰. Para remediar esto, el ADN puede mancharse durante la noche para evitar que bandas dob.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ADN lambda no metilado	NEB	N3013S
YOYO-1	ThermoFisher Scientific	Y3601
TOTO-1	ThermoFisher Scientific	T3600
POPO-1	ThermoFisher Scientific	P3580
BOBO-1	ThermoFisher Scientific	B3582
YOYO-3	ThermoFisher Scientific	Y3606
TOTO-3	ThermoFisher Scientific	T3604
POPO-3	ThermoFisher Scientific	P3584
BamHI	NEB	R0136S
PmlI	NEB	R0532S
ScaI	NEB	R3122S
EcoRI	NEB	R0101S
HindIII	NEB	R0104S
SmaI	NEB	R0141S
Tris	Fisher	BP152-1	Irritante
EDTA	Fisher	S316-212
HCl	Fisher	S25358	Tampón corrosivo e irritante
1	NEB	B7201S	NEB 1.1
Tampón 2	NEB	B7202S	NEB 2.1
Tampón 3	NEB	B7204S	NEB Cutsmart
Gel de agarosa de alta temperatura gelificante	Lonza	50041
Ácido acético	Fisher	S25118	Peligroso
Transiluminador de luz azul	Dark Reader	DR196	Use gafas correctas
Bromuro de etidio Fisher		15585011	cancerígeno; otras alternativas son Nancy 520, Gel rojo, etc.
Cámara Cannon EOS Rebel T3I Cannon
Apogee Modelo H4	Biorad	1704510
Power Pac Fuente de alimentación básica	Biorad	1645050
Ficoll	Fisher Scientific	BP525-25
Azul de bromofenol	Fisher Scientific	B-392
Xileno Cyanol	Eastmen	T1579

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