Artículo de método

Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

DOI:

10.3791/57164

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2 de agosto de 2018

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1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anticuerpos que se unen a los receptores de blanco en la superficie celular pueden conferir conformación y alteraciones clustering. Estos cambios dinámicos tienen implicaciones para caracterizar el desarrollo de fármacos en las células diana. Este protocolo utiliza la microscopia confocal y espectroscopia de la correlación de imagen a través de ImageJ/FIJI para cuantificar el grado de agrupamiento en la superficie celular del receptor.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia confocal proporciona una metodología accesible para capturar las interacciones celulares esenciales para la caracterización y el desarrollo de los agentes marcados con sondas fluorescentes. Con los avances recientes en droga citotóxica anticuerpo basado en sistemas de entrega, comprensión de las alteraciones inducidas por estos agentes en el ámbito de agregación del receptor y de internalización es de vital importancia. Este protocolo utiliza la metodología bien establecida de immunocytochemistry fluorescente y la distribución de FIJI de código abierto de ImageJ, autocorrelación incorporado y funciones matemáticas de la imagen, para realizar la correlación espacial de la imagen Espectroscopia (ICS). Este protocolo quantitates la intensidad fluorescente de receptores etiquetados en función de la zona de la viga del microscopio confocal. Esto proporciona una medida cuantitativa del estado de agregación de la molécula blanco en la superficie celular. Esta metodología se centra en la caracterización de las células estáticas con potencial para ampliar en las investigaciones temporales de la agregación del receptor. Este protocolo presenta una metodología accesible para proporcionar la cuantificación de la agrupación los eventos que ocurren en la superficie de la célula, utilizando bien establecido técnicas y aparatos de proyección de imagen no especializado.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo de anticuerpos terapéuticos ha demostrado un éxito notable en el tratamiento de varios tipos de tumor1. Los avances recientes de conjugados de anticuerpos-drogas (ADC) como mecanismos de entrega para los compuestos citotóxicos ha ampliado los requisitos para la comprensión de la dinámica de las interacciones del anticuerpo: receptor en la célula superficial2. Tras la selección exitosa de un anticuerpo para el receptor de superficie celular, estos complejos pueden inducir patrones de agregación similares a los observados en las interacciones de ligand: anticuerpo3. Alteraciones en la agregación de receptores pueden inducir cambios en la membrana y el resultado de la internalización de los receptores y su retiro de la superficie de la célula. En el contexto de un conjugado de anticuerpo-drogas, este proceso libera posteriormente la carga citotóxica en endosomas internalizada y, posteriormente, el citoplasma, resultando en muerte celular efectiva.

La microscopia confocal ha proporcionado un medio eficaz de visualizar estas interacciones importantes de anticuerpos y sus receptores de destino4. Para explorar los cambios de agregación de la molécula de la blanco en la superficie celular de este protocolo utiliza el post procesamiento de imágenes de microscopía confocal mediante una imagen espacial correlación espectroscopia (ICS) técnica 5,6,7 .

La base de la espectroscopia de correlación de la imagen es la observación que las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia espacial comparten una relación con el estado de agregación y densidad de las estructuras marcadas. Esta relación se establece siguiendo el cálculo de una función de autocorrelación espacial de una imagen capturada5.

Todas las variantes de la espectroscopia de correlación de imagen requieren el cálculo de la autocorrelación de una imagen. Esto es seguido por el montaje de esta función a una curva gaussiana bidimensional para la extracción de parámetros de estado de agregación Cuantitativa contenida en la imagen. En términos simples, el cálculo de la autocorrelación de una imagen implica comparar todos los pares de píxeles posible dentro de una imagen y calcular la probabilidad de que ambos igualmente tan brillante como uno al otro. Esto se visualiza como una función de la distancia y las direcciones de píxeles de separación8.

El marco teórico de la espectroscopia de correlación de imagen fue establecido y definido por Petersen y Wiseman et al. 5 , 6. en el presente Protocolo, se realizan los cálculos de la autocorrelación en Fiji/ImageJ, así como una aplicación de hoja de cálculo, la base para la función de autocorrelación espacial de fluctuación de intensidad puede ser descrita como (Eq 1):

figure-introduction-1     

donde F representa la transformada de Fourier; F−1 lo contrario Fourier transforma; F * su conjugado complejo; y el desfase espacial variables ε y η. En el ICS espacial, como se describe en este protocolo, la función de autocorrelación se puede calcular utilizando un 2D fast Fourier transform algoritmo7,9. La autocorrelación en cero separación espacial conocido como cero lag, g11(0,0), proporciona la inversa media del número de partículas presentes por área de la viga del microscopio. Puede obtenerse ajustando la función de autocorrelación espacial para una función Gaussiana bidimensional (Eq 2):

figure-introduction-2     

Como los píxeles capturados dentro de una imagen se encuentran dentro de un área de juego y estas mediciones no se extienden al infinito, el término g∞ se utiliza como un desvío para tener en cuenta las correlaciones espaciales largo alcance dentro de la imagen. Para agregados de tamaño molecular, ω es la función de punto de difusión del microscopio y descrito por el ancho en el medio máximo de la función de autocorrelación espacial. El área contenida dentro de la función de punto de extensión del instrumento se puede calibrar mediante el uso de perlas fluorescentes resolución sub.

Para el protocolo de espectroscopia de correlación imágenes descrito, la autocorrelación y funciones matemáticas requeridas para completar el ICS se realizan utilizando la plataforma de procesamiento de imágenes de código abierto, Fiji10, una distribución del ImageJ programa11,12. Fiji/ImageJ utiliza la transformación de Fourier rápida preinstalada en la función FFT matemáticas. Esta función reduce el tiempo de cálculo necesario de este cálculo reduciendo el intervalo de datos por un factor de dos en cada dimensión13. Como la función de autocorrelación 2D es aproximadamente simétrica en x, eje y, un diagrama de Perfil de sola línea a través de la imagen de autocorrelación puede utilizarse para medir la autocorrelación crudo como una función de rezago espacial. Elimina cualquier ruido cero lag antes de más cálculo, con la consiguiente amplitud de autocorrelación (valor máximo de g(0)T) corregida para el fondo con la expresión (Eq 3):

figure-introduction-3     

donde Ies la intensidad media de una región de fondo excluyendo la célula . La densidad de cluster, o densidad de los objetos fluorescentes, es definida por (Eq 4):

figure-introduction-4    

En el protocolo descrito en este documento, lo más simplemente el cálculo de la densidad de cluster (CD), con la asunción basada en la observación de que una función de autocorrelación normalizada decaerá en un valor a 1.0 con el aumento de rezago espacial. Con máximo desfase espacial, hay no más cualquier correlación de fluorescencia valores de intensidad y así sin una correlación los cálculos en esta región son computando el valor de una intensidad multiplicada por esta intensidad que posteriormente se divide por el Plaza de esa intensidad, que por definición es igual a 1.0. Por lo tanto, densidad de clúster desde una función de autocorrelación normalizada puede ser computado restando 1.0 de la función de autocorrelación normalizada antes de tomar su recíproco (Eq 5):

figure-introduction-5     

Calibración adicional de la zona de la viga se puede realizar para cuantificar el número de grupos dentro de la zona de la función de punto de extensión del instrumento. Esta calibración debe realizarse con las mismas condiciones ópticas utilizadas durante el análisis de espectroscopia de correlación de imágenes.

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Protocolo

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1. siembra de células adherentes para el experimento de la proyección de imagen

  1. Semilla de 10.000 células de carcinoma epidermoide A431 por bien durante la noche (O/N) en 300 μL de medios de Eagle modificado medio/nutrientes mezcla F-12 (DMEM/F-12) de Dulbecco con 10% Suero Fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina y 1% GlutaMAX en 8 cámaras de imagen diapositiva apto para lentes de objetivo de inmersión de aceite de alta resolución (por ejemplo, NuncTM Lab-TekTM cámaras cubreobjetos).
  2. Estimulan la agregación de receptores en las células A431 con agregado de ligando de EGF de 100 ng/mL en los medios de comunicación durante 10 min a temperatura ambiente (RT).

2. primaria del anticuerpo incubación

  1. Medios de quitar y lavar las células con 300 μL de tampón fosfato salino de temperatura (RT) (1 x PBS) dos veces.
  2. Fijar las células con 200 μL de paraformaldehído al 4% en PBS por 10 min a TA.
    Nota: Para explorar los cambios temporales de la agregación de destino, debe omitirse este paso de fijación.
  3. PFA de quitar y lavar las células con 300 μL de PBS de temperatura dos veces.
  4. Incubar las células con 200 μL de PBS con un anticuerpo primario en una concentración de 10 μg/mL durante al menos 2 h a 4 ° C.
    Nota: Para que los cálculos de ICS sea válido, todos los receptores presentes en la superficie de la célula deben etiquetarse con anticuerpo primario. Esto requiere experimentos preliminares con una serie de diluciones de cada anticuerpo primario (1:10, 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 500 1:1, 000, etc.) a realizar. Concentración óptima del anticuerpo primario se determina mediante análisis de intensidad de fluorescencia versus densidad de cluster. La concentración primaria seleccionada se produce cuando la densidad de cluster mesetas con el aumento de las concentraciones de anticuerpo primario antes de un aumento en la densidad de cluster como resultado de la Unión de anticuerpos no específicos. El anticuerpo primario se puede diluir en medios libres de suero si se realiza un experimento de imágenes del curso del tiempo.
  5. Después de finalización de tiempo de incubación deseado, lavar las células con 300 μL de PBS RT dos veces.
  6. Bloque de la muestra con 5% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante al menos 2 h a 4 ° C.
    Nota: Muestras fijadas son bloqueadas rutinariamente durante la noche (O/N) a 4 ° C.

3 incubación del anticuerpo secundario

  1. Preparar un stock 10 μg/mL con la etiqueta fluorescente de anticuerpo secundario (por ejemplo Alexa Fluor 488 IgG) en PBS. 2 μg/mL de Hoechst 33342 puede incluirse en esta dilución para permitir el descubrimiento de la mayor muestra en el microscopio.
    Nota: Para los experimentos de Time-lapse, PBS pueden ser intercambiado por los medios libres de suero.
  2. Quitar 5% BSA/PBS de las células e incubar con la solución de anticuerpo secundario por 2 h a 4 ° C, mientras que la protección de las muestras de la luz ambiental.
  3. Sobre la terminación del tiempo de incubación del anticuerpo secundario, lavan las células con 300 μL de PBS (dos veces) y almacenar a 4 ° C, proteger de la luz ambiental.
  4. Para evitar la evaporación, envolver los bordes de la diapositiva de cámara con parafilm.

4. confocal microscopía de muestras

Nota: Los valores utilizados para el análisis confocal serán diferente dependiendo del equipo y fluoróforos utilizados en el experimento individual. Instrumentos confocales modernos proporcionan mecanismos para el ahorro de todos los parámetros de imagen utilizados en el experimento en el formato de archivo de imagen nativa del instrumento. Es importante que estos valores se registran para proporcionar replicación apropiado de condiciones experimentales a través de diferentes periodos de adquisición de datos.

  1. Durante la proyección de imagen de señales fluorescentes, evitar sobresaturación. Utilizar una imagen ver tabla que proporciona una representación de color falso de la saturación de píxeles y reducir ganancia del detector y laser de potencia por consiguiente. Instrumentos mas confocales incluyen una opción análoga o un ajuste de "indicador de rango" en el software de adquisición para esto.
  2. Minimizar la exposición de fluoróforo de interés para la potencia del láser. El uso de una tinción de ADN etiquetado como Hoechst 33342 proporciona un mecanismo fácil para detectar y colocar la muestra en el campo de visión antes de colección.
  3. Realizar el análisis iniciales de la muestra en baja resolución y si el software permite una rápida velocidad de exploración. Esto limitará el fotoblanqueo posible de la muestra.
  4. Aumentar la resolución de la captura y lenta la velocidad de exploración cuando esté listo para recoger datos de la imagen.
  5. Si el instrumento confocal permite, recopilar datos mediante un fotón que cuenta modo.
    Nota: Si no está disponible en el instrumento de conteo de fotones: asegurar niveles de grises son lineales durante la adquisición de la imagen.
  6. Coloque el alfiler para cada línea del láser utilizada a 1 unidad de Airy (AU).
  7. Línea de uso o marco de promedio durante la adquisición de la imagen (x4) para reducir el detector asociado ruido.
    Nota: En esta variante de ICS como sólo un punto del tiempo es tiempo de la adquisición no es experimental factor limitante.
  8. Para selección de colección imagen altos aumentos, objetivo de alta apertura numérica, como un objetivo de Plan-Apochromat, máxima resolución y corrección de las aberraciones esféricas y cromáticas (los ejemplos incluyen Plan-Apochromat 100 X o 63 X /1.40 Objetivos del aceite).
  9. Sobremuestrear el tamaño de los píxeles capturados dentro de la imagen. Es aconsejable que cada píxel capturar una región de 50 x 50 nm. Para ICS eficaz, tamaño del pixel debe ser menos de 0.1 x 0.1 μm2 por píxel. Esto se logra por una combinación de zoom para explorar un área relativamente pequeña y seleccionando un formato de imagen relativamente grandes (por ejemplo, 1024 x 1024 o 2048 x 2048 pixeles).
  10. Se centran en la superficie apical o basal de la célula en una región tan plana como sea posible. Varias celdas pueden recogerse en las regiones de interés procesados individualmente durante análisis ICS y una imagen.
  11. Capturar una región de fondo libre de células con la misma configuración del instrumento que se utilizará para la normalización de la muestra.

5. cálculo de la espectroscopia de correlación de imagen

Nota: La plataforma de procesamiento de imágenes de código abierto, Fiji, una distribución del programa ImageJ, es necesaria para realizar la autocorrelación y funciones matemáticas esenciales para ICS. Esta distribución de ImageJ se recomienda ya que incluye numerosos plugins preinstalados y una arquitectura más fácil de actualización que puede realizar operaciones a través de múltiples experimentos de proyección de imagen.

  1. Instale el programa de Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Carga de los datos adquiridos.
  3. Identificar la región superficial de la membrana apical o basal de la célula de interés y duplicado a tamaño de pixel de 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). «Menú: imagen > duplicar...»
  4. Calcular la intensidad promedio de la zona recortada de interés "menú: analizar > medidas."
  5. Identificar una región de fondo y duplicados para el mismo tamaño de píxel de la membrana superficial de la célula captura (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). «Menú: imagen > duplicar...»
  6. Calcular la intensidad promedio del fondo recortada el área de interés. «Menú: analizar > medidas.»
  7. Restar la intensidad media del fondo de la imagen que contiene la región de interés. "Proceso > Calculadora de imagen > restar."
  8. Realizar el cálculo de autocorrelación. Este cálculo está contenido dentro de la estructura de menú: "proceso > TLC > FD matemáticas."
    1. En la FD matemáticas diálogo cuadro seleccionar: imagen 1: nombre de la imagen recortada, operación como correlación, imagen 2: nombre de la imagen recortada, transformación inversa.
  9. Normalizar la imagen resultante al dividir por el número total de píxeles. «Menú: proceso > Matemáticas > dividir...» (es decir: 64 x 64 pixeles = 4096)
  10. Normalizar otra vez dividiendo la intensidad media de la normalizada recorta cuadrado de área. «Menú: proceso > Matemáticas > dividir...»
    Nota: Esto puede lograrse dividiendo la imagen dos veces por el valor de intensidad media.
  11. Trace una línea a través de la función de punto de extensión.
  12. Trazar el perfil de esta línea para calcular el valor de pico. «Menú: analizar > parcela perfil.»
  13. Calcular los grupos por área de la viga al transferir el valor más alto (resultado de 5.12) a una hoja de cálculo y realizar el siguiente cálculo (Eq 6):
    figure-protocol-1

6. procesamiento de conjuntos de datos ICS de lote

Nota: Se recomienda la creación de una macro de FIJI/ImageJ para replicar los procedimientos descritos en el protocolo anterior. Esto permite el análisis rápido y consistente de múltiples archivos de imagen durante el análisis de espectroscopia de correlación de imágenes.

  1. Establecer un flujo de trabajo ICS de macro grabando cada comando de menú en el protocolo ICS
    «Menú: Plugins > Macros > Registro... ".
  2. Seleccione "Crear" para generar la Macro.
  3. Seleccione "idioma > Macro IJ1."
  4. Guardar la Macro.
  5. Añadir cuadros de diálogo a varios pasos de la macro, ofrecer recordatorios a los operadores de cada función. Cuadros de diálogo también sirven como un método para detener el proceso de análisis para permitir selecciones apropiadas a realizar antes de la transformación posterior (es decir, la región a recortar)
    1. Código de Macro de la caja de diálogo
      title = "Título de la caja de diálogo";
      MSG = "Mensaje de paso del protocolo/caja de diálogo";
      waitForUser (título, mensaje);
      Nota: Eficiencia adicional puede establecerse mediante la suscripción al sitio barra de actualización en el actualizador de FIJI (instrucciones https://imagej.net/BAR). Esto proporciona FIJI "una colección de rutinas ampliamente aplicables" 14. Un tal rutina es encontrar picos. Estructura del menú: "BAR > Análisis de datos > buscar picos." Este script proporciona una rápida de calcular que el valor de pico en el perfil del punto de extensión función.

7. Protocolo extensiones: Cálculo del área de la viga del microscopio de

Nota: La función de transferencia óptica del microscopio asegura que incluso de tamaño molecular objetos aparezcan como imágenes con un radio de unos 200-300 nm en el plano x-y. El protocolo ICS permite determinación de la función de punto de propagación al realizar los pasos 4-5 de perlas fluorescentes resolución sub. Específicamente:

  1. Montaje de sub-resolución (es decir, < 100 nm de diámetro) bolas fluorescentes en un 8 cámara de proyección de imagen de la diapositiva.
  2. Abalorios de imagen según el protocolo descrito con el microscopio confocal utilizada para experimentos ICS.
  3. Calcular la función ICS de la imagen resultante según los pasos del protocolo 5.1 5.13.
  4. Desde el perfil de trazada, calcular el radio (r) de la viga como la anchura total a mitad de valor máximo de la función ICS.
  5. Calcular el área de la viga (BA) (Eq 7):figure-protocol-2

8. Protocolo extensiones: Cálculo de racimos por unidad de área

  1. Calcular la densidad de cluster (CD) por unidad de área (Eq 8):
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  2. Dividir los grupos por área de la viga (resultado de 5.13) por el área de la viga (resultado de 7,5).

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Resultados

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Un experimento de espectroscopia de correlación de imagen exitosa depende de la correcta aplicación de los controles de tratamiento. Estos grupos de tratamiento incluyen la examinación de la fluorescencia en ningún anticuerpo primario y no grupos de tratamiento de anticuerpo secundario. Una vez que la configuración óptima láser confocal se establece para un experimento, deben capturar imágenes de estos grupos de control para confirmar la ausencia de fluorescencia no específica dentro de l...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La técnica de espectroscopia de correlación de imagen (ICS) que describimos en el presente Protocolo utiliza microscopios confocales estándar sin la necesidad de detectores especializados. La técnica ICS descrita utiliza métodos de inmunocitoquímica bien establecidos a prever el muestreo rápido de múltiples condiciones de tratamiento para el análisis estadístico mayor. Esta metodología lo hace con una ligera reducción en la precisión absoluta en comparación con técnicas alternativas a la sola molécula basada en la correl...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Andrew M Scott tiene apoyo de farmacia AbbVie, EMD Serono y Daiichi-Sankyo Co de financiación de la investigación y tiene una consultoría y participación de los productos farmacéuticos de Ciencias de la vida. Los autores no tienen otras afiliaciones pertinentes o compromiso financiero con cualquier organización o entidad con interés financiero en o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en manuscrito aparte de los revelados.

Agradecimientos

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Los autores reconocen el apoyo financiero del NHMRC 1084178 de becas y subvenciones 1087850, 1030469, 1075898 (AMS), cáncer Australia, Ludwig Cancer Research, John T Reid confía, cura Fundación de cáncer de cerebro, La Trobe University y la Agencia de cáncer de Victoria. Fondos del programa de apoyo infraestructura operativa proporcionada por el gobierno de Victorian, Australia también es reconocido.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nunc Lab-Tek II Cubreobjetos con cámara - 8 pocillosThermoFisher Scientific155409
DPBS, sin calcio, sin magnesioThermoFisher Scientific14190144
Suero fetal bovinoThermoFisher Scientific10099141
Enzima TrypLE Express (1x), sin rojo fenolThermoFisher Scientific12604021
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Suplemento GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061
Cabra anti-anti-humano IgG (H+L) Anticuerpo secundario adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µ mThermoFisher ScientificT7279
CetuximabMerck Serono3023715501
Parafilm M 38mx100mmMerck MilliporeBRND701605
16% Paraformaldehído (formaldehído) solución acuosaProSciTechC004
EGF humano recombinanteR& Sistema D236-EG

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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