Anticuerpos que se unen a los receptores de blanco en la superficie celular pueden conferir conformación y alteraciones clustering. Estos cambios dinámicos tienen implicaciones para caracterizar el desarrollo de fármacos en las células diana. Este protocolo utiliza la microscopia confocal y espectroscopia de la correlación de imagen a través de ImageJ/FIJI para cuantificar el grado de agrupamiento en la superficie celular del receptor.
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Artículo de método
Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopia confocal proporciona una metodología accesible para capturar las interacciones celulares esenciales para la caracterización y el desarrollo de los agentes marcados con sondas fluorescentes. Con los avances recientes en droga citotóxica anticuerpo basado en sistemas de entrega, comprensión de las alteraciones inducidas por estos agentes en el ámbito de agregación del receptor y de internalización es de vital importancia. Este protocolo utiliza la metodología bien establecida de immunocytochemistry fluorescente y la distribución de FIJI de código abierto de ImageJ, autocorrelación incorporado y funciones matemáticas de la imagen, para realizar la correlación espacial de la imagen Espectroscopia (ICS). Este protocolo quantitates la intensidad fluorescente de receptores etiquetados en función de la zona de la viga del microscopio confocal. Esto proporciona una medida cuantitativa del estado de agregación de la molécula blanco en la superficie celular. Esta metodología se centra en la caracterización de las células estáticas con potencial para ampliar en las investigaciones temporales de la agregación del receptor. Este protocolo presenta una metodología accesible para proporcionar la cuantificación de la agrupación los eventos que ocurren en la superficie de la célula, utilizando bien establecido técnicas y aparatos de proyección de imagen no especializado.
Introducción
El desarrollo de anticuerpos terapéuticos ha demostrado un éxito notable en el tratamiento de varios tipos de tumor1. Los avances recientes de conjugados de anticuerpos-drogas (ADC) como mecanismos de entrega para los compuestos citotóxicos ha ampliado los requisitos para la comprensión de la dinámica de las interacciones del anticuerpo: receptor en la célula superficial2. Tras la selección exitosa de un anticuerpo para el receptor de superficie celular, estos complejos pueden inducir patrones de agregación similares a los observados en las interacciones de ligand: anticuerpo3. Alteraciones en la ....
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Protocolo
1. siembra de células adherentes para el experimento de la proyección de imagen
- Semilla de 10.000 células de carcinoma epidermoide A431 por bien durante la noche (O/N) en 300 μL de medios de Eagle modificado medio/nutrientes mezcla F-12 (DMEM/F-12) de Dulbecco con 10% Suero Fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina y 1% GlutaMAX en 8 cámaras de imagen diapositiva apto para lentes de objetivo de inmersión de aceite de alta resolución (por ejemplo, NuncTM Lab-TekTM cámaras cubreobjetos).
- Estimulan la agregación de receptores en las células A431 con agregado de ligando de EGF de 100 ng/mL en los medios de comunicación durante 10 min a tem....
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Resultados
Un experimento de espectroscopia de correlación de imagen exitosa depende de la correcta aplicación de los controles de tratamiento. Estos grupos de tratamiento incluyen la examinación de la fluorescencia en ningún anticuerpo primario y no grupos de tratamiento de anticuerpo secundario. Una vez que la configuración óptima láser confocal se establece para un experimento, deben capturar imágenes de estos grupos de control para confirmar la ausencia de fluorescencia no específica dentro de l.......
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Discusión
La técnica de espectroscopia de correlación de imagen (ICS) que describimos en el presente Protocolo utiliza microscopios confocales estándar sin la necesidad de detectores especializados. La técnica ICS descrita utiliza métodos de inmunocitoquímica bien establecidos a prever el muestreo rápido de múltiples condiciones de tratamiento para el análisis estadístico mayor. Esta metodología lo hace con una ligera reducción en la precisión absoluta en comparación con técnicas alternativas a la sola molécula basada en la correl.......
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Divulgaciones
Andrew M Scott tiene apoyo de farmacia AbbVie, EMD Serono y Daiichi-Sankyo Co de financiación de la investigación y tiene una consultoría y participación de los productos farmacéuticos de Ciencias de la vida. Los autores no tienen otras afiliaciones pertinentes o compromiso financiero con cualquier organización o entidad con interés financiero en o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en manuscrito aparte de los revelados.
Agradecimientos
Los autores reconocen el apoyo financiero del NHMRC 1084178 de becas y subvenciones 1087850, 1030469, 1075898 (AMS), cáncer Australia, Ludwig Cancer Research, John T Reid confía, cura Fundación de cáncer de cerebro, La Trobe University y la Agencia de cáncer de Victoria. Fondos del programa de apoyo infraestructura operativa proporcionada por el gobierno de Victorian, Australia también es reconocido.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nunc Lab-Tek II Cubreobjetos con cámara - 8 pocillos | ThermoFisher Scientific | 155409 | |
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Suero fetal bovino | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| Enzima TrypLE Express (1x), sin rojo fenol | ThermoFisher Scientific | 12604021 | |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Suplemento GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Cabra anti-anti-humano IgG (H+L) Anticuerpo secundario adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11013 | |
| TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µ m | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Cetuximab | Merck Serono | 3023715501 | |
| Parafilm M 38mx100mm | Merck Millipore | BRND701605 | |
| 16% Paraformaldehído (formaldehído) solución acuosa | ProSciTech | C004 | |
| EGF humano recombinante | R& Sistema D | 236-EG |
Referencias
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
- Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14(2016).
- Sorkin, A., Waters, C. M.
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Reimpresiones y permisos
