Detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana

Summary

Se describe un protocolo para la detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana mediante la Unión del receptor de la clasificación, sortilina, para el primer bucle luminal de la proteína del transportador de glucosa, GLUT4, como ejemplo.

Abstract

Nuestra capacidad para explorar las interacciones proteína-proteína es la clave para entender las conexiones reguladoras en la célula. Sin embargo, la detección de interacciones proteína-proteína en muchos casos se asocia con importantes desafíos experimentales. En particular, clasificación de los receptores interactúan con su carga de proteínas en el lumen de los compartimentos de membrana a menudo en una manera sensible al detergente, haciendo inservible la co-inmunoprecipitación de estas proteínas. Vinculantes de la ordenación del receptor sortilina al transportador de glucosa que GLUT4 puede servir como un ejemplo de interacciones débiles luminales entre proteínas de la membrana. Aquí, describimos un análisis rápido, sencillo y barato para validar la interacción entre sortilina y GLUT4. Para ello, hemos diseñado y sintetizado químicamente el péptido myc-con la etiqueta correspondiente para el epitopo sortilina Unión potencial en la parte luminal del GLUT4. Sortilina etiquetada con seis histidinas fue expresado en células de mamífero y aislada de lysates de la célula usando granos de cobalto. Sortilina inmovilizado en las cuentas se incubó con la solución del péptido a valores de pH diferentes, y se analizó el material eluído por borrar occidental. Este ensayo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de otras interacciones de proteínas sensibles al detergente.

Introduction

GLUT4 es una proteína del transportador de glucosa que se expresa predominantemente en células del músculo esquelético y grasa donde interviene el efecto de la insulina en sangre post-prandial glucosa despacho¹. Una proteína muy estable, GLUT4 es regulada a nivel poste-de translación. En ausencia de insulina, GLUT4 se excluye en gran parte de la membrana del plasma (por lo tanto, baja permeabilidad basal de glucosa) y se localiza principalmente dentro de la célula en vesículas pequeñas de insulina-responsivo (IRVs) y red trans-Golgi (TGN) que probablemente representan el compartimiento de donantes IRV. Administración de insulina, el IRVs se fus....

Protocol

1. manipulación del péptido

1. Diseño y pedidos del péptido
   1. Elegir la secuencia deseada del péptido y añadir una etiqueta, como myc epitopo (EQKLISEED) en su o N - o C-terminal.
   2. Verifique la solubilidad predicha del péptido en agua, utilizando péptidos solubilidad calculadora http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Si la solubilidad es baja, intente añadir otra etiqueta solubles en agua para cambiar el equilibrio de carga.
      Nota: Utilizamos el péptido correspondiente a la primera lazada luminal (LFT) de GLUT4 etiquetadas con el epitopo myc (negrita) en la terminal N (Myc-LFT-GLUT4): LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA de

Results

Lisados fueron preparados del 3T3 L1 las células transfectadas estable con sortilina-myc/su⁵ y desde las células WT 3T3 L1, utilizadas como control negativo. Ambos lysates fueron incubados con abalorios cobalto a pH 6 o pH 8 y lavados muy bien. Granos con proteínas inmovilizadas luego fueron incubados en la solución de Myc-LFT-Glut4. Después de lavados cuidadosos, las proteínas a los granos fueron eluidas con 0.25 M imidazol. Las muestras se sometieron, junto con e.......

Discussion

Sortilina es un receptor evolutivo conservado multi-ligando proteína que participa en ambas señales en la membrana plasmática y en intracelular clasificación eventos^6,7. Sin embargo, la búsqueda de ligandos de sortilina auténtico (algunas de las cuales son proteínas de la membrana luminal o integral) es complicada como la interacción de sortilina con algunos de sus socios de la Unión parece ser sensible a los detergentes. Por lo tanto, una fácil y forma generaliz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Sigma	P8849	para su uso en la purificación de la proteína de la marca de histidina
Salina tamponada con fosfato	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Jeringa de Insulina U-100	BD 329652		26G x 1/2
BCA Kit de Ensayo de Proteínas Pierce		23228
Tampón de lavado	Boston BioProducts	BP-234	Para la purificación de proteínas His-tag
Resina de cobalto HisPur	Thermo Scientific	89964
Tampón de muestra de tricina Bio-Rad		161-0739	con SDS, se debe agregar bMercaptetanol
Elución  Tampón	Boston BioProducts	BP-236	para la purificación de proteínas His-tag con 250 mM de imidazol
Mini-Protean Tris-Tricine geles prefabricados 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Para la separación de péptidos y proteínas pequeñas
Tris/Tricina/SDS tampón de ejecución	Bio-Rad	161-0744
Tampón de transferencia	Boston BioProducts	BP-190	Agregue un 20% de metanol
Membrana de nitrocelulosa  0.45 mm	Bio-Rad	1620115
Albúmina sérica bovina	Sigma	A9647	BSA
Anticuerpo anti Myc	Señalización celular	2272
Péptido de	Genscipt		personalizar el pedido
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374