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Artículo de método

Un método para definir los efectos del enriquecimiento ambiental sobre la biodiversidad de microbioma de Colon en un modelo de Tumor de Colon murino

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DOI:

10.3791/57182

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28 de febrero de 2018

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1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

En este artículo

Resumen

Enriquecimiento ambiental (EE) es un entorno de alojamiento de los animales que se utiliza para revelar los mecanismos que subyacen a las conexiones entre el estilo de vida, estrés y enfermedad. Este protocolo describe un procedimiento que utiliza un modelo de ratón de tumorigenesis colon y EE definir específicamente alteraciones en la biodiversidad de la microbiota que puede afectar la mortalidad de animales.

Resumen

Varios estudios recientes han demostrado los efectos beneficiosos de vivir en un ambiente enriquecido en la mejora de la enfermedad humana. En ratones, enriquecimiento ambiental (EE) reduce tumorigenesis activando el sistema inmune del ratón, o afecta a la supervivencia animal de cojinete de tumor mediante la estimulación de la respuesta de reparación de herida, incluyendo diversidad mejorada del microbioma en el microambiente del tumor. Aquí es un procedimiento detallado para evaluar los efectos del enriquecimiento ambiental sobre la biodiversidad del microbioma en un modelo de tumor de colon murino. Precauciones con respecto a la cría de animales y consideraciones para la integración de Colonia animal genotipo y ratón se describen, que en última instancia afectan biodiversidad microbiana. Teniendo en cuenta estas precauciones puede permitir la transmisión de microbioma uniforme más y por lo tanto aliviará los efectos del no tratamiento dependiente que pueden confundir los resultados del estudio. Además, en este procedimiento, cambios de la microbiota se caracterizan mediante secuenciación de ADNr 16S del ADN aislado de heces recogidas del colon distal tras enriquecimiento ambiental a largo plazo. Desequilibrio de microbiota intestinal se asocia con la patogenia de la inflamatoria intestinal enfermedad y cáncer de colon, sino también de obesidad y diabetes entre otros. Lo importante, este protocolo para el análisis de EE y microbioma puede ser utilizado para estudiar el papel de la patogenesia de microbioma a través de una variedad de enfermedades donde existen modelos de ratón robusto que puede recapitular la enfermedad humana.

Introducción

Estudios de enriquecimiento ambiental (EE) utilizan parámetros complejos de vivienda para afectar la estimulación social (viviendas grandes jaulas, grandes grupos de animales), estimulación cognitiva (chozas, túneles, materiales de anidación, plataformas) y actividad física (correr ruedas). EE se ha utilizado por muchos laboratorios para entender los efectos del aumento de la actividad y mejora las interacciones sociales y cognitivas en el inicio de la enfermedad y la progresión usando una amplia gama de modelos de ratón, incluyendo alopecia inducida por barbería, enfermedad de Alzheimer, El síndrome de Rett y enfermedad tumoral y digestivo varios modelos1,2,3,4,5,6.

Se han desarrollado varios modelos de ratón para estudiar tumorigenesis de colon en ratones. Quizás el modelo más bien definido es el ratón de ApcMin . El ratón de ApcMin fue desarrollado en el laboratorio de William Paloma en 19907y se ha utilizado como un modelo de ratón de mutaciones en el gen APC que están comúnmente asociados con cáncer colorrectal humano. A diferencia de los seres humanos que las mutaciones APC , ApcMin ratones desarrollan principalmente pequeños tumores intestinales, con muy rara ocurrencia de tumores de colon. Sin embargo, un alelo Tcf4Het con una sola mutación heterozigótica de nocaut knockin en Tcf4, enormemente aumenta tumorigenesis de colon cuando se combina con el alelo ApcMin del8. Recientemente, este modelo de ratón de tumorigenesis de colon se ha utilizado para determinar los efectos de la EA en la tumorigénesis de colon6. En el Bice et al. estudio, los efectos fisiológicos y fenotípicos de la EA en machos y hembras de cuatro líneas de ratón diferente (wild-type (WT), Tcf4Het / + Apc+ / +, Tcf4+ + ApcMin / +, y Tcf4 Het / + APCMin / +)) se definieron. Quizás el hallazgo más interesante fue que EE aumenta significativamente la vida de hombres y mujeres animales de con tumores de colon. Esto demostró que la EE puede reducir por lo menos algunos de los síntomas asociados con la tumorigénesis de colon y mejorar la salud animal. Notable, esta vida útil mejorada en varones no es consecuencia directa de la tumorigénesis reducida y en su lugar estaba ligado a la iniciación de una respuesta, incluyendo mejorado microbioma biodiversidad6de cicatrización tumor.

Se han publicado varios estudios específicos de EE con resultados interesantes. Sin embargo, desde un punto de vista técnico, resultados importantes a menudo no son traducibles a otros laboratorios. Mantener idénticas metodologías EE entre distintos laboratorios es un tema muy complejo, no sólo por dispositivos de enriquecimiento y vivienda usada, pero también ropa de cama, alimentos, ventilación, cría, genética, actividad en la sala y Protocolo de animales requisitos, entre otros9,10,11. Un ejemplo es la integración animal, donde los animales deben estar estable integrados en la colonia de ratón, por lo tanto normalizar la composición genética del fondo y la dieta, para evitar efectos relacionados no tratamiento. Además, muchos estudios EE se han completado antes de la realización de la importancia de la microbioma en enfermedad y la forma en que las prácticas de cría de ratón comunes pueden afectar la composición del microbioma intestinal10,12.

Colocación de estrategia y animales de cría en EE puede aumentar el estrés si no se realiza correctamente. Desde estudios EE utilizan gran número de animales machos y hembras y varios genotipos, montaje experimental puede ser difícil dado el requisito para los animales de varias camadas para combinarse. Por lo tanto, una cría y destete estrategia fue desarrollado para permitir la combinación de animales destetados del genotipo correcto de diferentes camadas. La razón primaria de esto era normalizar la microbiota entre camadas y a reducir el estrés cuando los animales fueron trasladados al ambiente experimental. El microbioma se transmitió desde la presa10. Diversidad microbiana a la Colonia, las hembras fueron compradas en laboratorios Jackson e integradas en la colonia durante un mes antes de que la experimento comenzó9,10,12. Normalizar más biodiversidad de microbioma entre animales, las hembras fueron alojadas conjuntamente antes de la cría. Después de cría, viviendas comunales durante la crianza y la capacidad para escapar de cachorros de enfermería mejoraron los niveles de estrés de la atención materna13,14, posiblemente favorecer la normalización del microbioma. Para evitar que EE no relacionadas con efectos sobre el microbioma, esta casa común de todos los animales experimentales prevenir estrés adicional y luchando que se produjo cuando la combinación de varios machos de diferentes camadas en una jaula experimental. Finalmente, se incluyeron números iguales de animales de todos los genotipos en las jaulas. Esto proporcionó la oportunidad para la biodiversidad de la microbiota mejorada a través de genotipos y quitado la contribución de coprofagia (tendencia del animal a consumir heces) o posibles diferencias conductuales específicas de genotipo al estudio general.

Este protocolo proporciona una estrategia que amplía estudios previos de EE para incluir aspectos conocidos de la investigación microbioma, incluyendo integración de microbiota animal y transmisión de Colonia para la normalización de la microbiota, para permitir a más poblaciones de microbioma uniforme entre los animales de experimentación. Teniendo en cuenta estas precauciones es esencial debido a la capacidad de tratamiento no relacionados con microbiota diferencias para confundir los resultados del estudio. Eliminación de EE no relacionadas con cambios microbiota permitirá a los investigadores definir específicamente el papel de la EA en la composición de la microbiota durante el desarrollo de la enfermedad y la progresión.

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Protocolo

Todos los métodos aquí descritos fueron realizados según protocolos aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Utah.

1. diseño y EE y Control configuración de jaula

Nota: Para referencia, se ilustra un esquema del diseño experimental (figura 1).

  1. Configurar control (NE) y jaulas EE (figura 2).
    1. Para configurar NE jaulas, use jaulas de la autoclave control convencional (tabla 1) que carecen de dispositivos de enriquecimiento.
    2. Para jaulas grandes, perfore un agujero de cada jaula lo suficientemente grande para acomodar un ojal y túnel (Tabla de materiales).
    3. Para configurar cachorro cría y jaulas EE, conectar dos jaulas grandes para autoclave con un túnel seguro ojal esterilizada y 2 plataformas esterilizadas para aumentar el espacio (tabla 1). Por experimentos EE, proporcionan funcionamiento ruedas, túneles, iglús, chozas, bolas de arrastre esterilizada y jerarquización material dentro de las jaulas EE.
    4. Colocar jaulas EE y NE en un estante ventilado para proporcionar ventilación igual.
      Nota: Dos grandes jaulas con 2 plataformas (tabla 1) permiten un máximo de 12 mujeres embarazadas por cachorro cría configuración15 (ver Tabla de materias, paso 3.2 en el documento y tabla 2).
    5. Ratones de alimentación ad libitum había irradiado chow estándar y agua de ósmosis inversa en autoclave.
    6. Proporcionar ratones con material estéril de la cama.
      Nota: Todas las manipulaciones de jaulas vacías y jaulas con animales deben realizarse en la campana para evitar la contaminación. Para la manipulación de la jaula de jaulas grandes, cubrir el agujero en la jaula con una película adhesiva.
  2. Preparar los animales para la cría. Grupo de hembras 2 meses de edad 15 de la casa en una sola jaula grande (tabla 1) durante 2 semanas antes del apareamiento. Por separado de la casa 2 meses de edad machos littermate durante 2 semanas antes del apareamiento.
    Nota: El número de hembras para la cría es dependiente en el experimento y el número de animales requerido. En este estudio, se utilizaron 15 hembras para obtener 12 hembras tapadas, que es la máxima cantidad permitida en el cachorro cría de configuración descrito en 1.1.2 (tabla 2).
  3. Para la cría, combinar animales padre y presa, 1 macho por 2 hembras. El primer cheque por la mañana debe ser tapones vaginales, que pueden ser un signo visual que los animales han acoplado durante la noche.
    Nota: Casa machos y hembras juntas hasta que cada mujer ha metido. Un tapón vaginal se puede identificar visualmente, si es externo.
    1. Para detectar tapones internalizados, se inserta una sonda en la abertura vaginal y si el enchufe vaginal está presente, la sonda no se inserta fácilmente (16; vea la sección 4.3.6).
      Nota: Grabar la mañana que un enchufe se detecta como 1/2 día, ya que el acoplamiento se produjo en la noche.
    2. Una vez que las hembras tienen tapones vaginales, transferirlos a un cachorro grande cría en jaula para alojamiento en grupo con otras hembras fecundadas (configuración en el paso 1.1.2 sin dispositivos de enriquecimiento).
    3. Reemplazar aparearon hembras con nuevo fecundada ubicado las hembras para el apareamiento y continuar apareamiento para obtener un número máximo de camadas en un período de 7 días.
      Nota: Todos los animales deben tener una fecha de entrega dentro de 7 días entre sí.
  4. Permitir que las hembras embarazadas dan a luz en grupo de viviendas que camadas todos son criados dentro de un gran cachorro cría de jaula (configuración en el paso 1.1.2 sin dispositivos de enriquecimiento).
    1. Seguimiento de fechas de nacimiento y número de crías y comenzar a cachorros de genotipado a los 7 días de edad.
      1. Tatuaje de cachorros en estado de alerta a los 7 días de edad con un número de código para identificarlas13,17.
      2. Limpiar el dedo con etanol al 70% y suavemente inserte un dispositivo de micro-tatuaje con tinta en la superficie cutánea paralela a la del dedo del pie17 (véase Tabla de materiales).
      3. Recoger tejido con tijeras para genotipificación de las puntas de la cola mediante la incisión de un pedazo pequeño de tejido de recién nacidos de 7 días - la vieja.
    2. Aislar ADN genómico de tejidos y realizar PCR utilizando un método convencional de HotSHOT como se describe en 18.
    3. Animales separados por sexo a los 14-21 días en jaulas grandes con las madres.
      Nota: Asegurar que las crías mayores son capaces de alimentarse de sus propios, y que los cachorros más jóvenes continúan enfermera hasta edad suficiente para alimentar sus propios.
    4. A los 21-28 días, distribuir animales masculinos y femeninos por separado por genotipo en entornos NE o EE, asegurándose de mantener proporciones iguales de cada genotipo por jaula (figura 2A).
      Nota: Asegúrese de que el número total de animales en cada jaula NE o EE se basa en el número máximo permitido por la IACUC (tabla 2). Las jaulas NE tienen a más de 5 animales (tabla 2). En jaulas EE, para la estimulación social, no menos de 20 y con las limitaciones de espacio, se deben permitir no más de 41 animales en la jaula EE (tabla 2).

2. la muestra colección en 16 semanas de edad

  1. Comenzar colección de heces 1 a 2 días previos al sacrificio y recoger por separado taburete en el día del sacrificio durante la disección con instrumentos estériles.
    Nota: Taburete que recoge al mismo tiempo 1-2 días antes de la recogida puede ayudar a evitar la pérdida de muestra debido a la posibilidad que ningún taburete está presente en el momento de la recogida.
    1. Para recoger heces de animales vivos, cuidadosamente scruff el animal en una jaula limpia. Recoger heces utilizando pinzas estériles en un tubo de microcentrífuga estéril.
      Nota: Los animales normalmente eliminará heces cuando inmovilizado, lo que permite el rápido taburete colección directamente en un tubo de microcentrífuga estéril. Si un animal no defecar inmediatamente cuando inmovilizado, lo coloca en una jaula limpia y espere a que el animal defeque (típicamente hasta 1 h).
    2. Recoger heces en el día del sacrificio.
      1. Para euthanizing el animal, colocar al animal en una campana de cristal que contiene un recipiente pequeño con una bola de algodón empapada en isoflurano. Una vez que cese de respiración se observa (generalmente después de 2 min), pone al animal sobre su parte posterior para permitir la disección del colon.
      2. Aplicar etanol al 70% para el abdomen de ratón.
      3. Levantar la piel anterior a la apertura uretral con pinzas, use tijeras para cortar a lo largo de la línea media ventral hasta llegar a la caja torácica y cortar desde la base de la primera incisión hacia cada pierna. Pliegue de la piel y utilice tijeras para cortar a través de la pared peritoneal en el mismo patrón.
      4. Utilice pinzas para agarrar el colon distal en el ano a disecar y separar el colon distal del recto. Mientras tira verticalmente del colon con pinzas, use tijeras para cortar a través del mesenterio para liberar el colon.
      5. Cortar el colon justo por debajo del ciego y colocar sobre papel de filtro. Utilice pinzas para levantar la tapa del tubo de colon, abriendo el lumen para permitir que un lado de tijeras abiertas para ser insertado. Cortado longitudinalmente, distal a proximal y abocinado abierto los dos puntos a lo largo.
      6. Recoger heces desde el colon distal en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando pinzas estériles.
  2. Almacenar heces en un tubo de microcentrífuga a-80 ° c hasta el momento de aislamiento de ADN bacteriano.
    Nota: En el día del sacrificio, además de las heces, recoger otras muestras tales como sangre entera, suero, plasma, normal y el tejido del tumor de colon y el intestino, microsomas, tejido adiposo, etcetera. a preguntas de dirección definida en el estudio.

3. genómica ADN aislado de heces

Nota: Utilizar un kit comercial para aislar ADN microbiano de taburete siguiendo un protocolo de detección de patógenos de heces. Extraer muestras para el congelador de ° c-80 y tienda en hielo seco mientras se pesa.

  1. Transferencia de hasta 220 mg de materia fecal en un tubo de microcentrífuga limpio 1,4 ml de tampón de lisis de taburete de temperatura (RT) (véase Tabla de materiales).
  2. Muestra de Vortex por 1 min a homogeneizar completamente sólidos (figura 2B). Calentar la suspensión a 95 ° c por 5 min a Lisan las bacterias (incluyendo bacterias Gram-positivas).
  3. Muestras de Vortex durante 15 s y luego centrifugar a 20.000 x g durante 1 min para que sedimenten los sólidos de materia fecal. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 2 mL. Añadir una tableta a cada muestra para absorber los inhibidores de la PCR, vórtice, hasta que se disuelva la tableta e incubar la muestra a temperatura ambiente durante 1 minuto.
  4. Centrifugar la muestra a 20.000 x g durante 3 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga. Centrifugue a 20.000 x g durante 3 min alícuota 15 μL de proteinasa K (stock de 20 mg/mL) en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipetear 200 μL de la muestra en el tubo que contiene proteinasa K.
  5. Añadir 200 μL de tampón de lisis cloruro de guanidinio al tubo, vortex durante 15 s (véase Tabla de materiales) e incubar la muestra a 70 ° c por 10 minutos añadir 200 μL de etanol (96-100%) de los tubos y mezclar bien todo con un vórtex.
  6. Una silicona base columna spin en un tubo de recogida de 2 mL y las muestras se aplican a la columna. Cierre la tapa y centrifugar durante 1 minuto a 20.000 x g.
  7. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recogida de 2 mL y agregar 500 μL de tampón de lavado 1 a la columna, la tapa de la columna y centrifugue durante 1 min a 20.000 x g. traslado de la columna a un nuevo tubo de recogida de 2 mL y agregar 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna , cierre la tapa y centrifugar a 20.000 x g durante 3 minutos.
  8. Con la tapa cerrada, la columna de la transferencia a un nuevo tubo de recogida de 2 mL y centrifugar durante un 1 minuto adicional a 20.000 x g para quitar el tampón de lavado residual. Transfiera la columna a un 1.5 mL etiquetado tubo de microcentrífuga y eluir la muestra mediante la adición de 200 μL de tampón de elución que contiene EDTA a la membrana (véase Tabla de materiales).
  9. Cierre la tapa e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto centrifugar la muestra durante 1 min a 20.000 x g. descarte la columna.

4. DNA concentración determinación y preparación de muestras para PCR

Nota: Utilizar un fluorómetro y un ensayo fluorescente dsDNA comercialmente disponibles para determinar la concentración de ADN genómica de cada muestra (véase Tabla de materiales). El tinte fluorescente específicamente debe atar la DNA trenzada doble.

  1. Preparar una dilución 1: 200 de cada muestra (1 μl de cada muestra en 199 μl dsDNA mezclar principal) y un 1:50 dilución de estándares. Analizar en un fluorómetro usando el ajuste de dsDNA.
    Nota: Un alto volumen de ADN en la polimerización en cadena puede ser inhibitorio, por lo tanto, el volumen de ADN utilizado debe no ser más del 10% del volumen final de la PCR. Un fluorómetro permite una medición precisa de la DNA en la muestra, como sólo ADN al tinte fluorescente se fluorescencia, eliminando la posible contribución de contaminantes a la concentración final de ADN calculada. Este nivel de cuantificación precisa es esencial para la aplicación de la secuencia descendente.
  2. Preparar plantillas PCR diluidas a 5 ng/μL con el volumen adecuado de 10 mM Tris, pH 8.5 para hacer acciones de plantilla de trabajo de cada muestra.
  3. Almacenar las muestras a-20 ° C.

5. diseño de cebadores para el 16S deseada V regiones

  1. Diseño de cebadores para amplificar selectivamente las regiones de ARNr de 16S V deseadas.
  2. Analizar cartillas con sonda, del proyecto de base de datos Ribosomal19, para determinar la tasa de éxitosa aproximada para varios phyla.
    Nota: Para las regiones V1-V3, el presente estudio utilizado publicado cartillas Bosshard delantero20, que se unen en la posición 8 dentro de la región V1 y 533 reversa21, que se une en posición 533 dentro de la región V3. Primers deben incluir secuencias de proyección Adaptador para la indexación.
  3. Diseño de cartillas, incluyen adaptador secuencias en los extremos 5' de cada primer, como se recomienda para 16S metagenómica secuencia biblioteca elaboración22 (cuadro 3).
  4. Sintetizar estos grandes iniciadores con purificación de cartucho. Reconstituir cartillas desecados y diluir una PCR trabajando acciones a 1 μM a 10 mM Tris, pH 8.5.

6. Amplicon de PCR para amplificar las regiones V con alero adaptador secuencias Unido 22

  1. Configurar el amplicon de mezcla de reacción de PCR como se describe en la tabla 4.
  2. Colocar un sello claro adhesivo de la placa PCR en el plato y ejecute el amplicon PCR utilizando los parámetros en la tabla 5.
  3. (Opcional) Ejecutar productos productos de la PCR en un gel de agarosa o un análisis de ADN de alta sensibilidad que permite la medición cuantitativa del tamaño de amplicón (véase Tabla de materiales).
    Nota: El tamaño del amplicón de este estudio es 550 bp (figura 3A).

7. PCR limpieza usando magnético de perlas 22

  1. Centrifugar la placa PCR amplicon rápidamente a 1.000 x g durante 1 minuto recoger la condensación.
    Nota: Tiras de tubo PCR pueden utilizarse en lugar de placas PCR para minimizar la contaminación. Deseche las tapas del tubo y nunca vuelva a usar.
  2. Vórtice de granos de los granos magnéticos uniformemente dispersarlos, y añadir 20 μL de magnético a cada amplicon PCR, luego pipetear el volumen entero hacia arriba y hacia abajo lentamente 10 veces.
  3. Incubar a RT por 5 min lugar la placa PCR en un soporte magnético por 2 min hasta que los granos magnéticos se recogen y el sobrenadante es claro. Retire y descarte el sobrenadante.
  4. Bolas de lavado con 200 μL fresca 80% etanol mientras que la placa PCR está en el magnético soporte e incube durante 30 s en RT en el soporte magnético. Retire con cuidado el sobrenadante.
  5. Repetir el lavado por segunda vez. Ahora, usar una pipeta fina para quitar cualquier etanol residual de los pocillos y permitir que el aire de secado durante 10 minutos.
  6. Retire la placa de la polimerización en cadena del soporte magnético y añadir 52.5 μL de 10 mM de Tris de pH 8.5 a cada pocillo. Pipeta para arriba y abajo 10 veces suspender cuentas e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
  7. Transferencia de la placa de la polimerización en cadena en el soporte magnético para recoger bolas magnéticas y transferir 50 μL del sobrenadante a una placa PCR limpia. Coloque un sello claro adhesivo de la placa PCR en la placa y conservarlo a-20 ° c hasta una semana.

8. elaboración de un esquema de la placa para el índice de PCR

Nota: Para generar una biblioteca de V1-V3, una segunda PCR se realizó con un índice del kit (véase Tabla de materiales). Un esquema de indexación de predeterminado se utilizó para asignar combinaciones de índice dual único para cada muestra (figura 3B y 23).

  1. Asegúrese de que cada muestra tiene una combinación única de 2 cartillas de índice (es decir, doble indexación).

9. realizar el índice de PCR para fijar códigos de barras a las secuencias de adaptador como descrito 22 .

  1. Transferir 2.5 μL de amplicones de PCR (amplicones limpio) a un lugar en un accesorio de la placa índice para ayudar en la indexación y nueva placa bien 96.
  2. Organizar el índice 1 e índice 2 cartillas como en el ejemplo del gráfico de plato preparado (figura 3B).
    Nota: Señales visuales se proporcionan para evitar confusiones de cartilla: tubos de primer índice 2 deben tener gorras blancas y clara solución, mientras que tubos de primer Índice 1 deben tener tapas de naranja y amarillo solución.
  3. Montar el índice de reacción de la mezcla de PCR como se describe en la tabla 6. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces. Cubra con un sello claro adhesivo de la placa PCR y centrifugue para recoger a 1.000 x g a temperatura ambiente durante 1 minuto.
  4. Ejecute el índice de PCR utilizando los parámetros en la Tabla 7.

10. purificar PCR Final biblioteca

Nota: Esta PCR limpieza es idéntico al paso 7 arriba y usa bolas magnéticas para realizar PCR Clean-Up del índice de PCR22.

  1. Centrifugar la placa de la polimerización en cadena del paso 10 rápidamente a 1.000 x g durante 1 minuto recoger la condensación.
  2. Vórtice de granos de los granos magnéticos uniformemente dispersarlos, luego añadir 20 μL de magnético a cada amplicon PCR, luego pipetear todo el volumen arriba y abajo lentamente 10 veces para mezclar.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  4. Placa PCR de lugar en un soporte magnético por 2 min hasta que los granos magnéticos son recogidos y sobrenadante es claro. Retire y descarte el sobrenadante.
  5. Bolas de lavado con 200 μL fresca 80% etanol mientras que la placa PCR está en el magnético soporte e incube durante 30 s a temperatura ambiente en el soporte magnético. Retire con cuidado el sobrenadante.
  6. Repetir el lavado por segunda vez.
  7. Después del segundo lavado, utilice una pipeta fina para quitar cualquier etanol residual de los pocillos y permitir que el aire de secado durante 10 minutos.
  8. Retire la placa de la polimerización en cadena del soporte magnético y añadir 52.5 μL de 10 mM de Tris de pH 8.5 a cada pocillo. Pipeta para arriba y abajo 10 veces suspender cuentas e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
  9. Transferencia de la placa de la polimerización en cadena en el soporte magnético para recoger bolas magnéticas y transferir 50 μL del sobrenadante a una placa PCR limpia. Coloque un sello claro adhesivo de la placa PCR en la placa y conservarlo a-20 ° c hasta una semana.
  10. (Opcional) Ejecutar los productos PCR de índice en un gel de agarosa o un análisis de ADN de alta sensibilidad que permite la medición cuantitativa del tamaño de amplicón (véase Tabla de materiales).
    Nota: El tamaño de la biblioteca indexadas final de este estudio fue de 668 bp (figura 3C, D).

11. cuantificar, normalizar y piscina las librerías indexadas para secuenciación

  1. Determinar la concentración de ADN de cada muestra con un fluorómetro y un kit de ensayo fluorescente dsDNA (véase tabla de materiales).
    1. Preparar una dilución de 1: 200 de la muestra (1 μl de cada muestra en 199 μl dsDNA master mix, que incluye buffer y reactivos) para cada una de las muestras indexadas y estándares (190 μl dsDNA amo mezclar y 10 μl de estándar). Analizar en un fluorómetro usando el ajuste de dsDNA.
  2. Tras el cálculo de la concentración de ADN, normalizar las bibliotecas calculando el tamaño promedio de la biblioteca. Esto sumando longitudes de adaptador, índice longitudes y tamaño de amplicón V de cartillas y ver los productos por gel de agarosa para asegurarse de que el tamaño real es similar al tamaño calculado (vea lafigura 3C, 22).
    1. También puede utilizar un análisis de ADN de alta sensibilidad que permite la medición cuantitativa de la integridad del ADN, tamaño de amplicón y concentración (tabla de materiales,D, figura 3).
      Nota: En este estudio, el tamaño promedio de la biblioteca se calculó con base en la suma de longitudes de adaptador, índice longitudes y tamaño de amplicón de V1-V3 de cartillas. El tamaño promedio fue de 668 bp.
    2. Se normalizan las concentraciones de las muestras mediante la fórmula en el cuadro 8.
  3. Diluir las muestras a 4 nM y piscina 5 μL de cada muestra de 4 nM en un solo tubo para la secuencia.

12. la secuencia de la biblioteca mediante un sistema de secuenciación de última generación y analizar los datos

  1. Secuencia de la biblioteca.
    Nota: Para este estudio, la Universidad de Utah alto rendimiento Genomics Core realiza la desnaturalización de la biblioteca y muestra la secuencia (como se describe en 6,22).
  2. Analizar los datos.
    Nota: Para separar los datos de muestras agrupadas, índice Lee identificaron y separado (como se describe en el 22).
  3. Generar archivos FASTQ y utilizar esto para el posterior análisis.

13. analizar los datos secuenciados de la biblioteca de amplicones de 16S

Nota: Este paso se realiza como se describe en Bice et al., 20176.

  1. Instalar las herramientas de análisis de los datos libremente disponibles (véase Tabla de materiales; 24).
  2. Montar fastq demultiplexan los archivos de los datos secuenciados (como se describe en25,,26). Deseche todas las secuencias desmontadas.
  3. Realizar el análisis después de una de novo abierta unidad taxonómica (OTU) recogiendo protocolo (tal como se describe en el 27).
    1. Bin secuencias en un fichero fastq solo por sampleID y secuencias de grupo con mayor similitud a OTUs, o 97% como se describe en 28. Alinear secuencias representativas de base con la longitud de la secuencia mínima de 150 y 75% identidad29,30. Asignar taxonomía describe28.
      Nota: Muestras pueden ser desechadas y analizaron31, seguido por asignación taxonómica y OTU mesa construcción32.
    2. Crear un archivo de asignación que identifica nombres descriptivos y las características de las muestras para identificación de la muestra y validar la cartografía archivo33,34.
    3. Hacer una red OTU que OTUs se vincula a la descripción de la muestra utilizando un archivo de mapeo35.
    4. Resumiendo taxa a través de parcelas36para calcular resúmenes de taxonomía en términos de abundancia relativa.
    5. Explorar la diversidad alfa de muestras a profundidad secuencia uniforme apropiado para muestras. Para definir la profundidad adecuada para la diversidad alfa, Resumen de cuentas total observadas en cada muestra utilizando el comando de la tabla resumen de bioma, como se describe en el 37.

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Resultados

Varios estudios han demostrado que la práctica de la medicina mente-cuerpo mejora los resultados de salud. De manera similar, en ratones, enriquecimiento ambiental mejora los resultados como mayor vida útil y reparación de tumor de la herida6. Por lo tanto, un procedimiento EE fue desarrollado con el objetivo de definir el papel de la microbiota en este fenotipo mientras que primera normalización del microbioma antes de la iniciación del experimento (

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Discusión

Este procedimiento permite el análisis de la microbiota aislada de heces tras enriquecimiento ambiental de normal o de tumor con animales. Porque estos son grandes experimentos que implican la crianza para obtener muchos animales de diversos sexos y genotipos, normalizando el microbioma entre animales antes del inicio del experimento es esencial evitar que EE no relacionadas con efectos sobre el microbioma biodiversidad.

Coherencia entre NE y EE, se lleva a cabo el proceso de cría para asegura...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a B. Dalley en el centro de genómica de la Universidad de Utah para la secuenciación de la biblioteca y K. Boucher en el centro de Bioestadística de la Universidad de Utah para asesoramiento estadístico y el acceso a estos núcleos técnicos apoyados por el premio del Instituto Nacional del cáncer CA042014 P30. El proyecto descrito fue apoyado por el nacional cáncer Institute subvenciones P01 CA073992 y CA128891 K01 y la Fundación de cáncer Huntsman.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Teklad Diets/Harlan Labs ChowHarlan Labs3980XComida irradiada estándar formulada por el Dr. Mario Capecchi en colaboración con Harlan Labs.
Ropa de cama Cell-Sorb PlusFangman Specialties82010Autoclave antes de su uso.
Sistema de tatuaje AIMS para neonatosAIMSNEO-9https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Se pueden utilizar otros sistemas y tintas de tatuaje de grado animal con resultados similares, incluido el Aramis Micro Tattoo Kit.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Completo con jaula, parte superior de filtro AllerZone y sistema modular de administración de dietaProductos de laboratorio82120ZFCada jaula EE requiere una de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF y 82101ZF, así como dos de 82109ZF. La comida está solo en un lado.
Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device Productoslaboratorio82109ZFCada jaula EE requiere una de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF y 82101ZF, así como dos de 82109ZF. La comida está solo en un lado.
Zyfone One Cage 2100 Jaula 13-7/8" de largo x 19-1/16" de ancho x 7-3/4" de profundidadProductos de laboratorio82100ZFCada jaula EE requiere una de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF y 82101ZF, así como dos de 82109ZF. La comida está solo en un lado.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter topLab Products82101ZFCada jaula EE requiere una de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF y 82101ZF, así como dos de 82109ZF. La comida está solo en un lado.
TúnelBio-ServK3323 o K3332Conecte las jaulas entre sí y utilícelas para el enriquecimiento
Ojal para conectar el túnel a las jaulasFabricado por el Taller de Máquinas de la Universidad de Utahn/aAsegúrese de que el material sea resistente a la masticación y se pueda esterilizar en autoclave
Rueda de vía rápidaBio-ServK3250 o K3251Úselo con iglú de ratón y piso Iglú
ratónBio-ServK3328, K3570 o K3327Uso con rueda y suelo Fast-track
Suelo iglú para ratónBio-ServK3244Uso con iglú para ratón y Fast-Track
Mouse HutBio-ServK3272, K3102 o K3271
Crawl BallBio-ServK3330 o K3329
Bio-hutBio-ServK3352Cabaña de pulpa de madera utilizada para albergar y anidar
Película adhesiva VWR60941-072Úselo para cubrir temporalmente un orificio perforado en una jaula grande para evitar que los ratones escapen
Rack ventilado de flujo laminarTechniplastBio-C36El armario que hemos utilizado en este estudio no se suministra actualmente. El Bio-C36 es muy similar.
Tubo de microfuga de 1,5 mL: libre de ARNasa y ADNasaCualquier proveedor
QIAamp DNA Stool MiniKitQiagen51504Este kit suministra reactivos para 50 preparaciones de ADN. tampón de lisis de heces = ASL; tampón de lisis de cloruro de guanidinio = AL; Tampón de lavado 1 con cloruro de guanidinio = AW1; Tampón de lavado 2= AW2; Tampón de elución con EDTA = AE
Baño de agua (capaz de calentar hasta 95)Cualquier proveedorPara la incubación a 94 grados de muestras de heces para lisar células.
Baño de agua (capaz de calentar a 70 grados)Cualquier proveedorPara la incubación a 70 grados de muestras de heces 
Etanol (200 pruebas)Sigma AldrichE7023
Fluorómetro: QubitThermoFisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA Kit de ensayo de amplio rangoThermoFisher ScientificQ32850
EB Buffer o 10 mM Tris pH 8.5Qiagen19086
Imprimaciones específicas para experimentosCualquier proveedor Grado
PCR aguaCualquier proveedor
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix Kapa BiosystemsKK2601para amplificación de amplicones (1,25 mL permite 100 rxns).
Agarosa para ejecutar geles de diagnósticoCualquier proveedor
TapeStation de alta sensibilidad D1000 Screen Tape TraceAgilent5067-5583TapeStation o Bioanalyzer Los instrumentos son comunes en Institutional Genomics Cores para analizar la calidad de la biblioteca. Alternativamente, se puede utilizar un bioanalizador DNA1000 chip (Agilent, 5067-1504).
Agencourt AMPure XP Perlas magnéticasBeckman CoulterA63880Perlas Magentic para limpieza de PCR: 5 mL limpiarán 250 reacciones de PCR
Soporte magnéticoLife TechnologiesAM10027
Guía de preparación de la bibliotecaIlluminaIllumina. Preparación de la biblioteca de secuenciación metagenómica 16S: Preparación de amplicones del gen de ARN ribosómico 16S para el sistema Illumina MiSeq. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Indexación dual únicaIllumina IlluminaExperiment Manager SoftwareDisponible gratuitamente en:
https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html Nextera XT 96 Index KitIlluminaFC-131-1002Se utiliza para añadir códigos de barras a los amplicones
MicroAmp Optical Placa de reacción de 96 pocillosApplied Biosystems/ThermoFisherN8010560
Accesorio de placa de índice TruSeqIlluminaFC-130-1005
Sello adhesivo de placa transparenteApplied Biosystems/ThermoFisher4360954Applied Biosystems/ThermoFisher Secuenciación de película adhesiva Microamp
por MiSeq con reactivos v3 y lecturas duales de 300 pbIlluminaMS-102-3003
Kit de control PhiXIlluminaFC-110-3001
Proteinasa K (600 mAU/ml)Qiagen19131Equivalente a 20 mg/ml de proteinasa K. Se suministra con el kit QiaAmp Herramientas de
análisis de datosQiimeherramientas del software QIIMELa instalación puede variar según su sistema y el sitio web de QIIME describe varias opciones (http://qiime.org/install/install.html). Para este estudio, se utilizó el paquete de software MacQIIME 1.9.1 (compilado por Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Step 13.2.QiimeFastQ Método de unión ( http://code.google.com/p/ea-utils  ).   Para este estudio se utilizaron extremos pareados de unión múltiple http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Herramientas de línea de comandos para el procesamiento de datos de secuenciación biológica. Análisis de expresión, Durham, Carolina del Norte. (2011).
Paso 13.3.QiimeDe-Novo OTU protocolo de selecciónhttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Paso 13.3.1.Unidades taxonómicas abiertas (OTUs) usando UclustEdgar, R.C. Búsqueda y agrupación en órdenes de magnitud más rápido que BLAST. Bioinformática. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/BTQ461 (2010).
Paso 13.3.1.PynastPynastCaporaso, J.G. et al. PyNAST: una herramienta flexible para alinear secuencias con una alineación de plantilla. Bioinformática. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/BTP636 (2010). 
Paso 13.3.1.PynastPynast_GreengenesDeSantis, T.Z. et al. Greengenes, una base de datos de genes de ARNr 16S verificada por quimera y un banco de trabajo compatible con ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). En este estudio se utilizó la versión 13.3.1 de Greengenes
. Nota: QiimeVarias Bibliotecas Divididas http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Nota: QiimePick de novo OTUs script http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html ;
Paso 13.2.2.QiimeCree un archivo de mapeohttp://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Paso 13.2.2.QiimeValida un archivo de mapeohttp://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Paso 13.3.3.QiimeVincule la OTU a la descripción de la muestra para el archivo de mapeohttp://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Paso 13.3.4.Resumirtaxones a través de parcelashttp://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Paso 13.3.5.Tabla de resumen del biomaQiimehttp://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  En este estudio, todas las muestras se rarificaron a 20.000 OTUs seguidas de un análisis utilizando el script de rarefacción alfa en QIIME.
de de Las los

Referencias

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