Method Article

Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo

DOI:

10.3791/57183

⸱

April 12th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Huashan Hospital, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo presenta un procedimiento general para evaluar en vitro si angiogénesis tumoral clásico existe en los hemangioblastomas (HBs) y su papel en HBs. Los resultados destacan la complejidad de la neovascularización de la HB y sugieren que esta forma común de angiogénesis es solamente un mecanismo complementario en la neovascularización de la HB.

Abstract

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La inactivación del gen de supresor de tumor von Hippel-Lindau (VHL) desempeña un papel crucial en el desarrollo de hemangioblastomas (HBs) en el sistema de nervioso central (SNC) humano. Sin embargo, el origen citológico y el proceso evolutivo de HBs (incluyendo el neovascularization) siguen siendo polémicas, y anti-angiogénesis para la BVS-HBs, basados en el clásico HB angiogénesis, han producido resultados decepcionantes en ensayos clínicos. Un obstáculo importante para la traducción clínica exitosa de tratamiento vascular es la falta de un conocimiento profundo del neovascularization en este tumor vascular. En este artículo, presentamos un procedimiento general para evaluar en vitro si angiogénesis tumoral clásico existe en HBs, así como su papel en HBs. Con este procedimiento, los investigadores pueden comprender la complejidad de la neovascularización de la HB con precisión e identificar la función de esta forma común de la angiogénesis en HBs. Estos protocolos pueden utilizarse para evaluar la terapia vascular más prometedor para los tumores, que tiene alto potencial traslacional para tratamiento de tumores o para ayudar en la optimización del tratamiento anti-angiogénico para HBs en el futuro las traducciones. Los resultados destacan la complejidad de la neovascularización de la HB y sugieren que esta angiogénesis forma común es solamente un mecanismo complementario en la neovascularización de la HB.

Introduction

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(HBs) los hemangioblastomas son tumores vasculares benignos que se encuentran exclusivamente en el sistema de nervioso central (SNC) humano. Se desarrollan en pacientes con enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) o lesiones esporádicas. BVS-HBs son difíciles de curar a través de tratamiento quirúrgico debido a la frecuente repetición y lesiones múltiples que resultan de esta genética desorden1. Aunque la inactivación del gen supresor VHL tumor se ha considerado la causa principal de la tumorigénesis de BVS-HBs, el origen citológico (incluyendo el neovascularization) y el proceso evolutivo de HBs siendo polémico en gran parte2. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos biológicos de HB-neovascular puede proporcionar ideas útiles sobre las estrategias más prometedoras vasculares para BVS-HBs.

La investigación reciente ha sugerido que HB-neovascularización es similar a la vasculogénesis embriológico3,4,5. Clásico factor de crecimiento endotelial (VEGF)-angiogénesis mediada que origina el endotelio vascular y que es conducido por pérdida de la BVS de la función dio lugar a la proliferación y la formación neovascular, que ha sido desafiado6. En 1965, Cancilla y Zimmerman encontró, utilizando microscopía electrónica, que HBs se originaron en el endotelio7. Más tarde se encontró que las células del estroma se derivan vasoformativas elemento8. En 1982, Jurco et al encontraron que las células del estroma son de origen endotelial9. Por lo tanto, la hipótesis de que las células endoteliales vasculares humanas son las células originales de neovascularización de la HB10. Aunque es mejor utilizar los cultivos primarios de células HB de cirugías pacientes VHL, nuestra investigación anterior indicó que cultivos primarios de HB no son estables, y las líneas celulares no pueden ser establecido3. Por otra parte, los cultivos primarios en el entorno 3D no pudieran identificar el origen citológico de neovascularización de HB porque incluyen los progenitores de HB-vascular ingredientes10,11. Por lo tanto, como un modelo primitivo y clásico de las células endoteliales, las células endoteliales vasculares humanas (HUVEC) podían servir como modelo celular alternativo para HBs.

El ensayo de despunte de esferoide es un nuevo modelo en tejido ingeniería12,13. En este papel, un cocultivo de colágeno-basado 3D sistema en vitro con el esferoide brotación ensayo fue desarrollado, con una meta para evaluar si la angiogénesis tumoral clásico existe en HBs, así como su papel en HBs.

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Protocol

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Este método fue realizado según las directrices aprobadas y regulaciones de la investigación ética Comité de Huashan Hospital, Universidad de Fudan. Correspondientes medidas de seguridad estándar se siguieron en cada paso. Una presentación esquemática, por favor consulte la figura 1.

1. cultura y construcción del plásmido de la célula

  1. Habitualmente, mantener las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en Dulbecco de modificado medio del águila (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina en un 5% humidificado incubadora de CO2 a 37 ° C.
  2. Digerir PLKO.1 plásmido con ApaI y EcoRI para la síntesis del fragmento de shRNAs. Garantizar que la secuencia de oligonucleótidos del vector de shRNAs BVS CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14.
  3. Luego, mezcle 20 sistema µΜ delantero 5 μl de oligo, 5 μl de oligo reverse, 5 μl de 10 x buffer de NEB y 35 μl de ddH2O junto (el volumen total es de 50 μL). Calienta la mezcla a 98 ° C por 4 minutos y poco a poco enfriar a temperatura ambiente unas horas.
  4. Ligar los oligos recocido y PLKO.1 plásmido junto con T4 ligasa a 4 ° C para pasar la noche. 16 h más tarde, añadir 5 μl de mezcla de ligadura en competentes DH5α células de 25 μl. Luego, la plásmidos ligada con éxito de la pantalla y verificar el fragmento insertado por la secuencia.

2. infección y paquete de lentivirus

  1. En total, mezclar 10 μg del vector PLKO.1-shVHL o PLKO.1-shScramble, 7,5 μg de plásmido psPAX2 de embalaje y 2,5 μg de envolvente plásmido pMD2.G en 500 μl del medio DMEM sin suero fetal bovino (FBS) durante 25 minutos.
  2. Añadir 7 mLDMEM sin SFB a la solución preparada anteriormente.
  3. La cultura 293 células FT en DMEM sin FBS en un platos de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro. Asegúrese de que el número de células 293 pies es 1 x 107 usando un contador de células.
  4. Añadir 1 mL de la solución preparada anteriormente en el soporte de células 293 pies para transfección.
    Nota: La línea celular de 293 pies se deriva de la línea celular de 293F y estable expresan el antígeno T grande de SV40. Por lo tanto, es un huésped adecuado para la producción de lentivirales.
  5. Reemplazar el medio de cultivo con DMEM con 10% FBS después de 6 h.
  6. Recoger los medios de comunicación con una pipeta a las 48 h después de transfección.
    Nota: El virus existe en DMEM con 10% FBS. Las células muertas flotan en el medio. Utilizar membrana estéril de 0,45 μm para filtrar las células muertas e impurezas. Por lo general, no hay necesidad para revisar la multiplicidad de infección (MOI). Se trata de establecer una línea estable de células. En el último paso, todas las células vivas sin éxito infección morirán por puromicina. El grupo de shScramble y las células HUVEC están el grupo de control. Asegúrese de que todas las células HUVEC mueren con la concentración de puromicina usado por 72 h. Cada pozo tiene el mismo número de células.
  7. La cultura las células HUVEC en los medios de comunicación lentivirales para 72 h. Luego, añadir puromicina a los medios de comunicación de las células HUVEC en una concentración de 2 μg/mL para las células HUVEC uso de 24 h. sin ningún tratamiento como el grupo de control. Asegúrese de que todos los de control las células mueren por este tiempo.
    Nota: Las células vivas representan una línea celular estable de células precipitación BVS y shSramble. La densidad de placas es 5.000/pozo en placas de 96 pocillos.

3. generación de esferoides de células endoteliales

  1. Trypsinize las células HUVECs y resuspender en medio DMEM con 10% FBS. Con un número moderado de células en una placa de cultivo de 10 cm, añadir 1 mL de EDTA typsin.
  2. Las células en una placa de 96 pocillos de fondo redondo 3D, con una densidad celular de 1 × 103 células/pozo de la semilla. Uso de un bien que puede acomodar un esferoide de 0,50 μL para suspender el esferoide. Contar las células mediante un sistema de contador celular siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Incube las células a 37 ° C y 5% CO2 continuamente durante 72 h. En estas condiciones, asegurarse de que las células suspendidas forman los esferoides celulares automáticamente. Vuelva a colocar la mitad de medio de cultivo después de 36 h.

4. ensayo de angiogénesis in vitro

  1. Descongelar la solución gel a 4 ° C y diluir con el medio de suero reducido en una proporción de dilución de 1:5.
  2. Chupar los esferoides de medio de cultivo DMEM con una micropipeta. Después de lavar los esferoides con 5 mL de medio de suero reducido, suspender los esferoides suavemente y con cuidado el gel diluido. Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire.
  3. Incorporar 300 μL de líquido mezclado en una placa de la pozo 15. Después de incubación a 37 ° C y 5% CO2 para 1 h, añadir 400 μL del medio reducido suero a cada pozo. Llene de agua estéril alrededor de los pozos para generar un ambiente humidificado para dificultar la evaporación.
  4. Después de eso, la cultura la placa a 37 ° C en 5% CO2 en el 100% de humedad durante 1 hora.
  5. Cuidadosamente aspirar el medio viejo y sustituirlo por 600 μl del medio de suero reducido con suplementos de crecimiento celular endotelial de 1% en cada pozo.
  6. Después de 12 h o 24 h, tomar imágenes en un microscopio de luz invertido (40 *).

5. Análisis de datos

  1. Subir las imágenes a una plataforma de análisis de imagen en línea para obtener datos de la longitud del brote (Tabla de materiales).
  2. En la página web, crear una cuenta de correo electrónico.
  3. Luego subir las imágenes haciendo clic en el botón subir.
  4. Descargar el resultado haciendo clic en el botón de descarga.
    Nota: El software genera los datos y la imagen procesada. Los datos contienen cinco partes: brote acumulado, longitud de brotes promedio, la desviación estándar de longitud de brotes, área de brote y esferoide. En la imagen procesada, cada parámetro se contornea en un color diferente para facilitar la identificación en la imagen procesada: rojo representa brotes de esqueleto, el número de brotes de amarillo, azul el brote estructura final brote blanco y naranja esferoide.

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Results

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Imágenes originales son tomados por microscopio de luz invertida. Las imágenes típicas del grupo control y el grupo de la BVS se muestran en la figura 2-A1 y figura 2-A2. La longitud de brote del grupo de control es más corta que el del grupo VHL.

Después de subir las imágenes, la plataforma online ofrece análisis de resultados directam...

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Discussion

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Recientemente, varios campos de investigación de la biología vascular fueron estimulados por el estudio del endotelio angiogénicos15. En este artículo, hemos desarrollado un esferoide endotelial brotación técnica como un modelo experimental para estudiar la formación de vasos que origina la pérdida del gen VHL de función en las células endoteliales manipuladas para identificar moléculas de nuevo candidato de la cascada angiogénica. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer informe para...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo fue financiado por becas del Comité de Shanghai de ciencia y tecnología (15411951800, 15410723200). Los autores desean agradecer al Prof. YuMei Wen y Prof. Chao Zhao de la Universidad del Departamento de microorganismo patógenos de Fudan para su asistencia técnica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
célula endotelial de la vena umbilical humanaFudan IBS Cell CenterFDCC-HXN180
dulbecco' Es un águila modificada' s medio Gibco11995040
suero fetal bovinoGibco 
PLKO.1-puro vectorAddgene#8453
empaquetamiento plásmido psPAX2 Addgene#12260
plásmido de envoltura pMD2.GAddgene#12259
3D de fondo redondo placas de 96 pocillosS-BioMS-9096M
matrigelBD Biosciences354234
medio Opti-MEMGibco31985-070medio de suero reducido 
Placa de 15 pocillosIbidi81501Las burbujas de aire en el gel se pueden reducir equilibrando el μ – Desliza la angiogénesis antes de usarla dentro de la incubadora durante la noche
suplementos para el crecimiento de células endotelialesSciencell#1052
Placa de cultivo de 10 cmCorningScipu000813
PuromicinaGibcoA1113802
typsin-EDTAGibco25200056
Sistema Automatizado de Contador de Células  BioTech
 Winmasishttp://mywim.wimasis.com 
26400044Software de análisis de imágenes

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
  2. Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
  3. Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
  4. Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102(2014).
  5. Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
  6. Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
  7. Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
  8. Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
  9. Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
  10. Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
  11. Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
  12. Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
  13. Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
  14. Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
  15. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  16. D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).
  17. Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
  18. Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
  19. Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019(2014).
  20. Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
  21. Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
  22. Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
  23. Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
  24. Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
  25. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).

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