Aquí, Divulgamos un protocolo que requiere sólo tres reactivos y 7 min de tratamiento y es conveniente para la generación rápida de datos SSR de calidad en el análisis genético de tinción de plata sencilla y de bajo costo.
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Artículo de método
Un rápido plata tinción protocolo permite Simple y detección eficiente de marcadores SSR utilizando un Gel de poliacrilamida no desnaturalizantes
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Resumen
Resumen
Repetición de secuencia simple (SSR) es uno de los marcadores más eficaces utilizados en investigación genética animal y vegetal y programas de mejoramiento genético molecular. Plata es un método ampliamente utilizado para la detección de marcadores SSR en un gel de poliacrilamida. Sin embargo, los protocolos convencionales para la tinción de plata son técnicamente exigente y requiere mucho tiempo. Como muchos otros laboratorio biológico técnicas, protocolos de tinción de plata han sido constantemente optimizadas para mejorar la eficiencia de detección. Aquí, Divulgamos un simplificado plata tinción que significativamente reduce los costos de reactivos y mejora la claridad de la resolución y la imagen de detección. El nuevo método requiere de dos pasos principales (impregnación y desarrollo) y tres reactivos (nitrato de plata, hidróxido de sodio y formaldehído) y sólo 7 minutos de procesamiento para un gel de poliacrilamida no desnaturalizantes. En comparación con protocolos previamente divulgados, este nuevo método es más fácil, más rápido y utiliza menos reactivos químicos para detección de SSR. Por lo tanto, este protocolo de tinción de plata simple, bajo costo y efectiva beneficiará a Cartografía genética y selección asistida por marcador por una generación rápida de datos de marcadores SSR.
Introducción
El desarrollo de marcadores basados en PCR ha revolucionado la ciencia de la genética de plantas y cría1. Marcadores (SSR) repetición de secuencia simple están entre los marcadores de ADN más versátiles y más utilizados. Su genoma amplio cobertura, abundancia, especificidad de genoma y repetibilidad son algunas de las ventajas de los marcadores SSR además de su herencia codominante para la detección de genotipos heterocigotos2. Varios estudios han utilizado marcadores SSR para investigar la diversidad genética, rastrear ancestros, construir mapas de ligamiento genético y mapa de genes para rasgos económicamente importantes3,4.
Productos PCR de marcadores SSR comúnmente son separados usando la electroforesis del gel de poliacrilamida o agarosa y entonces visualizado con tinción de plata o bajo luz UV después de la tinción con bromuro de etidio. Tinción de plata de fragmentos de ADN en geles de poliacrilamida es más sensible que los otros tinción métodos5,6 y ha sido ampliamente utilizado para detectar fragmentos de ADN como marcadores SSR7.
Como muchas técnicas de laboratorio biológico, tinción plata de geles de poliacrilamida ha mejorado constantemente desde su ser reportada por primera vez como una técnica de visualización de fragmento en 19798. La técnica fue modificada inicialmente para la detección de fragmentos de ADN por Bassam et al. 6 en 1991 y luego mejorado por Sanguinetti y compañeros de trabajo9 en 1994. El método se ha optimizado aún más en el pasado pocas décadas6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. sin embargo, la mayoría de estas versiones actualizadas de los protocolos tiene algunas desventajas como la alta demanda técnica y largo proceso de un tiempo de fijación y montaje6, que limitan la aplicación de estos protocolos7, 11. Un protocolo óptimo que combina el bajo costo con alta eficiencia de la detección del fragmento de ADN es urgente para la aplicación rutinaria de plata coloración en la investigación biológica.
Además, gel de poliacrilamida se puede dividir en geles de poliacrilamida de desnaturalización y no desnaturalizar, y tanto pueden ser utilizados para la detección de marcadores SSR utilizando el método de tinción de plata. El efecto y cuya resolución no difieren significativamente, pero los geles de poliacrilamida no desnaturalizantes son fáciles de procesar y tomar menos tiempo16.
Sobre la base de la investigación anterior15, el objetivo del presente estudio es describir un protocolo en detalle para la detección rápida, fácil y de bajo costo de marcadores SSR en un gel de poliacrilamida no desnaturalizantes de tinción de plata optimizado.
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Protocolo
1. preparación de los productos PCR de marcadores SSR
- Preparar todos los productos químicos y reactivos para reacciones de PCR, incluyendo ADN de plantilla (30 ng/μL), mezcla principal de 2 × PCR (contiene 2 × tampón PCR, 0,4 mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl2, 0.1 U/μl de Taq ADN polimerasa y colorantes), 10 μm de cada uno adelante y atrás cartillas y agua destilada o desionizada (dH2O).
Nota: Los marcadores SSR utilizados en el presente estudio fueron PT51333 (adelante secuencia cartilla: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' y primer retroceso secuencia: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') y PT50903 (adelante secuencia cartilla: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' y Invierta primer secuencia: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') tabaco y CX-43 (adelante secuencia cartilla: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' y primer secuencia: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') y CX-157 (adelante secuencia cartilla: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' e invertir secuencia cartilla: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') para floración Col de China. - Preparar 10 μl de la mezcla PCR para la amplificación mediante la adición de 2 μl de la plantilla de ADN, 5 μl de 2 × PCR master mix, 0,2 μl de cada cebador forward y cartilla reversa y 2,6 μl de dH2O.
- Realizar la reacción de amplificación de PCR en un termociclador con un paso inicial de 94 ° C por 5 min, seguir por 38 ciclos de 45 s a 94 ° C para la desnaturalización, 45 s a 55 ° C para el recocido de la cartilla y 1 min a 72 ° C durante la extensión y un paso de extensión final de 10 min a 72 ° C; luego almacenar los productos PCR a 4 ° C para su uso posterior.
2. preparación de soluciones de poliacrilamida gel Casting
- Preparar 1 L de 5 x TBE tampón disolviendo 54 g de Tris base y 27,5 g ácido bórico en dH2O, agregar 20 mL de EDTA de 0,5 M (pH 8.0) y ajustar la solución hasta un volumen final de 1, 000 mL con dH2O.
Nota: El buffer TBE puede almacenarse a temperatura ambiente durante meses. - Preparar 2 L de 0,5 x TBE tampón al añadir 200 mL de buffer TBE × 5 dH2O hasta un volumen final de 2 L y almacene a temperatura ambiente.
- Preparar una solución de gel de poliacrilamida no desnaturalizantes 6% disolver 29 g de acrilamida grado de biología molecular y 1 g de grado biología molecular N, N'-Metilenbisacrilamida en buffer TBE × 0,5 hasta un volumen final de 500 mL. Cubrir la botella con papel de aluminio y almacenar a 4 ° C para su uso posterior.
PRECAUCIÓN: Acrilamida es una neurotoxina potente y debe manejarse con cuidado. Siempre lleve guantes cuando peso de polvo y manejo de soluciones que lo contienen. - Preparar una solución 20% amonio persulfato (APS) disolviendo 2 g de APS con dH2O hasta un volumen final de 10 mL. Puede ser almacenado a-20 ° C durante meses.
Nota: Para mayor comodidad, 10 mL de solución al 20% APS puede alícuotas de 1,5 mL o 2 mL de los tubos de centrífuga para el almacenamiento a-20 ° C. Descongelar y mezclar bien antes de usar. - Preparar una solución diluida de bind-silano disolviendo 3 μl de bind silane en 0,997 mL de etanol al 95% que contiene 0.5% de ácido acético. Se puede almacenar a 4 ° C durante semanas.
PRECAUCIÓN: Bind silane es tóxico, lleve guantes al manipular la solución y mantener la habitación ventilada.
3. preparación de geles de poliacrilamida para electroforesis
- Lavar un juego de placas de cristal y los espaciadores con detergente en agua, seguido de un completo enjuague con dH2O. aire seco las placas de ajuste en una placa de la rejilla de secado.
- Dispersar 1 mL de solución de bind-silano sobre la superficie interior de una placa rectangular de vidrio y seco durante 5 minutos.
Nota: Si la solución de bind silane no se extiende uniformemente sobre la superficie de la placa, el gel puede ser independiente durante la coloración y resultar en un efecto de coloración insuficiente. - Dispersar 1 mL de repeler-silano sobre la superficie interior de una placa de vidrio con muescas con un bastoncillo de limpiar exceso silano repeler con papel de seda y aire seco durante 5 minutos.
Nota: Si el rechazar-silano uniformemente no cubra la superficie de la placa de vidrio, puede dañar el gel pelando parcialmente. - Montar las placas de vidrio con separadores con la placa dentada en la parte superior y sujete ambos lados de la Asamblea con pinzas de fundición.
- Verter la cantidad adecuada (40 mL) de solución de gel de poliacrilamida no desnaturalizantes 6% a un vaso de precipitados para el conjunto de placa de 33 cm de ancho x 10 cm de altura y espaciador espesor de 1,5 mm, añadir 20 μl de tetramethylethylenediamine (TEMED) y 200 µLfresh 20% APS y mezclar suavemente.
Nota: La cantidad apropiada (40 mL) de solución en gel se calculó a partir del volumen interno de las dos placas con un espesor de los espaciadores (30 cm x 8,5 cm × 0.15 cm). En cuanto a la cantidad de TEMED y el APS para la polimerización del gel, hay una proporción estándar de la solución en gel a TEMED y el APS basado en la referencia17. La solución gel descrita se almacena a 4° C. Si la solución en gel se almacena a temperatura ambiente, 20 μl de TEMED y 100 μl de APS debe utilizarse el 20%. Revuelva suavemente la mezcla de la solución en gel con una vara de vidrio para evitar burbujas de aire en la solución. - Vierta la solución inmediatamente y cuidadosamente en las placas de vidrio montado por el borde de la placa dentada, llenar el espacio casi a la parte superior e inserte el peine. Añadir un pequeño volumen de la solución en gel sobre el peine.
Nota: Mantenga las placas de cristal horizontal para impedir que el gel que se escapa. Eliminar las posibles burbujas con un gancho de la burbuja, si es necesario. - Permita que el gel fijar por 30 min a temperatura ambiente.
Nota: Puede cambiar el tiempo de polimerización con temperatura de la solución en gel y el medio ambiente. - Después de que el gel es completamente polimerización, quite las abrazaderas fundición Coloque el conjunto de la placa en la unidad de tanque de electroforesis con la placa dentada hacia el depósito superior del tampón y usar pinzas para sujetar la placa en la unidad de depósito.
- Vierta 1 L de 0,5 x TBE buffer en cada uno de la parte superior y las cámaras inferiores. Retire el peine y purgar todos los pocillos con buffer con una pipeta o jeringa.
Nota: Asegúrese de que el sándwich de gel en la parte inferior de la placa es totalmente empapado en búfer sin burbujas.
4. correr los geles
- Carga de 1 μl del producto de PCR en cada pozo del gel de poliacrilamida. Cargar una escalera del tamaño de ADN a ambos lados del gel junto con muestras de productos PCR. Fijar la cubierta de seguridad a la cámara de amortiguación superior.
- Conecte los cables a la fuente de alimentación, que empareja el color rojo a rojo y negro con negro. Correr el gel a una tensión constante de 110 V hasta que el tinte llegue a una posición definida, normalmente de ~ 70 min.
Nota: El tiempo de tensión y corriente se puede ajustar según el tamaño de los productos PCR.
5. tinción para la detección de marcadores SSR en un no-Gel de poliacrilamida de plata
- Después de la electroforesis, vaciar el buffer de la cámara alta en un vaso grande a través de la válvula. Separar las abrazaderas laterales, quitar las placas del aparato, cuidadosamente separe la placa de vidrio con muescas a lo largo de un lado con una espátula y asegúrese de que los restos de gel a la otra placa de vidrio recubierta con bind silane.
- Hacer 1 L de solución fresca de impregnación por disolver 1.5 g de AgNO3 en 1 L de dH2O. preparar 1 L de solución fresca desarrollo disolviendo 10 g de NaOH en 900 mL de dH2O, añadir 1 mL de formaldehído al 37% y se ajustan a un volumen final de 1 L con dH2O.
Nota: Utilice guantes y manejar las sustancias químicas y soluciones con cuidado. No es necesario mantener las soluciones y los pasos correspondientes con las soluciones en la oscuridad. - Enjuague cuidadosamente la placa de gel y cristal con amplia dH2O para quitar el tampón de electroforesis, luego coloque la placa con gel hacia arriba en una bandeja de plástico y sumergir el gel en 1 L de solución de impregnación. Coloque la bandeja en una coctelera Boston.
- Agite suavemente la bandeja a 60 rpm durante 3-4 minutos.
Nota: Tiempo de agitación puede ajustarse según el espesor del gel y la concentración de nitrato de plata en la solución de impregnación. - Mueva la placa de la solución de impregnación y colocar en otra bandeja. Enjuague la solución de impregnación residual fuera de la superficie de la placa y el gel utilizando amplia dH2O dos veces por s 3-5 cada.
- Coloque la placa con gel hacia arriba encima de la otra bandeja, sumergir la placa en 1 L de solución de desarrollo, luego agite suavemente la bandeja a 50 r/min ~ 3 min Monitor la aparición de ADN fragmentos y detener el desarrollo cuando el cociente más alto de la señal de ADN fragmentos el ruido de fondo se observa (este paso tarda aproximadamente 3 min).
- Enjuagar la placa y el gel con amplia dH2O dos veces y seque la placa de gel con un papel de tejido.
- Escanear el gel utilizando un escáner adecuado. Una resolución de 300 dpi proporciona una clara visualización de fragmentos de ADN. El gel también puede ser fotografiado con una cámara.
- El patrón de bandas de los marcadores SSR puede anotó basado en los fragmentos de ADN en la imagen.
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Resultados
Los amplicones PCR fueron producidos usando los correspondientes pares de cartilla SSR en Col China de flores y tabaco. Después de la electroforesis, los geles de poliacrilamida fueron manchados con el anterior protocolo, que detecta claramente los patrones de bandas de los marcadores SSR (figura 1) de tinción de plata.
Para comparar la eficiencia de detección de protocolos de tinción de plata difer...
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Discusión
El lavado del gel después de la impregnación es un paso crítico. Volumen de agua y tiempo de lavado puede causar la extirpación incompleta de la solución de impregnación en la superficie de la placa y el gel y resultar en un fondo oscuro. El momento adecuado del desarrollo es otro paso clave, desarrollo excesivo puede resultar en un fondo marrón oscuro con imagen de bajo contraste de fragmentos de ADN. Además, el paso de impregnación afecta significativamente la eficiencia tinción de fragmentos de ADN. Aunque extendiendo...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias naturales en Guangdong de China (2015A030313500), la plataforma de investigación Provincial, clave internacional cooperativa y los principales científicos investigación proyecto de Guangdong educación superior (2015KGJHZ015), la ciencia y Plan de tecnología de administración de monopolio de tabaco de Guangdong (201403, 201705), la ciencia y tecnología Plan de Guangdong de China (2016B020201001), el proyecto de formación de innovación nacional para estudiantes de pregrado (201711078001). Mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades y el empleador.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mezcla maestra de PCR (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, EE. UU | . # 170-8200 | |
| DL500 Marcador de ADN | Takara Bio Inc., Japón | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | # 77-86-1 | |
| Ácido bórico | Sangon Biotech Shanghai, China | # 10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China | #6381-92-6 | |
| Acrilamida | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Persulfato de amonio | Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silano | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehído | Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China | #50-00-0 | |
| Fábrica | reactivos químicos NaOH Guangzhou, China | #1310-73-2 | |
| Ácido acético | Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China | #497-19-8 | |
| Fábrica de reactivos químicos de etanol de Guangzhou, China | #64-17-5 | ||
| HNO< sub>3 | Guangzhou Fábrica de reactivos químicos, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome negro T(EBT) | Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China | #1787-61-7 | |
| Bandeja de plástico | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China-TS-1 | ||
| Shaker | Qilinbeter JiangSu, | China-BenQ | |
| M800 Scanner | BenQ, | ||
| alimentación | Beijing Liuyi Instrument Factory, China-High | ||
| en todos los sistemas de gel verticales, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electroforesis Co., Ltd, China | - |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
