Un rápido plata tinción protocolo permite Simple y detección eficiente de marcadores SSR utilizando un Gel de poliacrilamida no desnaturalizantes

Summary

Aquí, Divulgamos un protocolo que requiere sólo tres reactivos y 7 min de tratamiento y es conveniente para la generación rápida de datos SSR de calidad en el análisis genético de tinción de plata sencilla y de bajo costo.

Abstract

Repetición de secuencia simple (SSR) es uno de los marcadores más eficaces utilizados en investigación genética animal y vegetal y programas de mejoramiento genético molecular. Plata es un método ampliamente utilizado para la detección de marcadores SSR en un gel de poliacrilamida. Sin embargo, los protocolos convencionales para la tinción de plata son técnicamente exigente y requiere mucho tiempo. Como muchos otros laboratorio biológico técnicas, protocolos de tinción de plata han sido constantemente optimizadas para mejorar la eficiencia de detección. Aquí, Divulgamos un simplificado plata tinción que significativamente reduce los costos de reactivos y mejora la claridad de la resolución y la imagen de detección. El nuevo método requiere de dos pasos principales (impregnación y desarrollo) y tres reactivos (nitrato de plata, hidróxido de sodio y formaldehído) y sólo 7 minutos de procesamiento para un gel de poliacrilamida no desnaturalizantes. En comparación con protocolos previamente divulgados, este nuevo método es más fácil, más rápido y utiliza menos reactivos químicos para detección de SSR. Por lo tanto, este protocolo de tinción de plata simple, bajo costo y efectiva beneficiará a Cartografía genética y selección asistida por marcador por una generación rápida de datos de marcadores SSR.

Introduction

El desarrollo de marcadores basados en PCR ha revolucionado la ciencia de la genética de plantas y cría¹. Marcadores (SSR) repetición de secuencia simple están entre los marcadores de ADN más versátiles y más utilizados. Su genoma amplio cobertura, abundancia, especificidad de genoma y repetibilidad son algunas de las ventajas de los marcadores SSR además de su herencia codominante para la detección de genotipos heterocigotos². Varios estudios han utilizado marcadores SSR para investigar la diversidad genética, rastrear ancestros, construir mapas de ligamiento genético y mapa de genes para rasgos económicamente important....

Protocol

1. preparación de los productos PCR de marcadores SSR

1. Preparar todos los productos químicos y reactivos para reacciones de PCR, incluyendo ADN de plantilla (30 ng/μL), mezcla principal de 2 × PCR (contiene 2 × tampón PCR, 0,4 mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl₂, 0.1 U/μl de Taq ADN polimerasa y colorantes), 10 μm de cada uno adelante y atrás cartillas y agua destilada o desionizada (dH₂O).
   Nota: Los marcadores SSR utilizados en el presente estudio fueron PT51333 (adelante secuencia cartilla: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' y primer retroceso secuencia: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') y PT50903 (adelante secuencia cartilla: 5 ' - AAAT....

Results

Los amplicones PCR fueron producidos usando los correspondientes pares de cartilla SSR en Col China de flores y tabaco. Después de la electroforesis, los geles de poliacrilamida fueron manchados con el anterior protocolo, que detecta claramente los patrones de bandas de los marcadores SSR (figura 1) de tinción de plata.

Para comparar la eficiencia de detección de protocolos de tinción de plata difer.......

Discussion

El lavado del gel después de la impregnación es un paso crítico. Volumen de agua y tiempo de lavado puede causar la extirpación incompleta de la solución de impregnación en la superficie de la placa y el gel y resultar en un fondo oscuro. El momento adecuado del desarrollo es otro paso clave, desarrollo excesivo puede resultar en un fondo marrón oscuro con imagen de bajo contraste de fragmentos de ADN. Además, el paso de impregnación afecta significativamente la eficiencia tinción de fragmentos de ADN. Aunque extendiendo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mezcla maestra de PCR (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, EE. UU	. # 170-8200
DL500 Marcador de ADN	Takara Bio Inc., Japón	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	# 77-86-1
Ácido bórico	Sangon Biotech Shanghai, China	# 10043-35-3
EDTA-Na2	Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China	#6381-92-6
Acrilamida	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-metileno-bis-acrilamida	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Persulfato de amonio	Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China	#7727-54-0
Bind-silano	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehído	Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China	#50-00-0
Fábrica	reactivos químicos NaOH Guangzhou, China	#1310-73-2
Ácido acético	Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China	#497-19-8
Fábrica de reactivos químicos de etanol de Guangzhou, China	#64-17-5
HNO< sub>3	Guangzhou Fábrica de reactivos químicos, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome negro T(EBT)	Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China	#1787-61-7
Bandeja de plástico	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China-TS-1
Shaker	Qilinbeter JiangSu,	China-BenQ
M800 Scanner	BenQ,
alimentación	Beijing Liuyi Instrument Factory, China-High
en todos los sistemas de gel verticales, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electroforesis Co., Ltd, China	-