Aquí, Divulgamos un protocolo que requiere sólo tres reactivos y 7 min de tratamiento y es conveniente para la generación rápida de datos SSR de calidad en el análisis genético de tinción de plata sencilla y de bajo costo.
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Artículo de método
Un rápido plata tinción protocolo permite Simple y detección eficiente de marcadores SSR utilizando un Gel de poliacrilamida no desnaturalizantes
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Repetición de secuencia simple (SSR) es uno de los marcadores más eficaces utilizados en investigación genética animal y vegetal y programas de mejoramiento genético molecular. Plata es un método ampliamente utilizado para la detección de marcadores SSR en un gel de poliacrilamida. Sin embargo, los protocolos convencionales para la tinción de plata son técnicamente exigente y requiere mucho tiempo. Como muchos otros laboratorio biológico técnicas, protocolos de tinción de plata han sido constantemente optimizadas para mejorar la eficiencia de detección. Aquí, Divulgamos un simplificado plata tinción que significativamente reduce los costos de reactivos y mejora la claridad de la resolución y la imagen de detección. El nuevo método requiere de dos pasos principales (impregnación y desarrollo) y tres reactivos (nitrato de plata, hidróxido de sodio y formaldehído) y sólo 7 minutos de procesamiento para un gel de poliacrilamida no desnaturalizantes. En comparación con protocolos previamente divulgados, este nuevo método es más fácil, más rápido y utiliza menos reactivos químicos para detección de SSR. Por lo tanto, este protocolo de tinción de plata simple, bajo costo y efectiva beneficiará a Cartografía genética y selección asistida por marcador por una generación rápida de datos de marcadores SSR.
Introducción
El desarrollo de marcadores basados en PCR ha revolucionado la ciencia de la genética de plantas y cría1. Marcadores (SSR) repetición de secuencia simple están entre los marcadores de ADN más versátiles y más utilizados. Su genoma amplio cobertura, abundancia, especificidad de genoma y repetibilidad son algunas de las ventajas de los marcadores SSR además de su herencia codominante para la detección de genotipos heterocigotos2. Varios estudios han utilizado marcadores SSR para investigar la diversidad genética, rastrear ancestros, construir mapas de ligamiento genético y mapa de genes para rasgos económicamente important....
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Protocolo
1. preparación de los productos PCR de marcadores SSR
- Preparar todos los productos químicos y reactivos para reacciones de PCR, incluyendo ADN de plantilla (30 ng/μL), mezcla principal de 2 × PCR (contiene 2 × tampón PCR, 0,4 mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl2, 0.1 U/μl de Taq ADN polimerasa y colorantes), 10 μm de cada uno adelante y atrás cartillas y agua destilada o desionizada (dH2O).
Nota: Los marcadores SSR utilizados en el presente estudio fueron PT51333 (adelante secuencia cartilla: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' y primer retroceso secuencia: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') y PT50903 (adelante secuencia cartilla: 5 ' - AAAT....
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Resultados
Los amplicones PCR fueron producidos usando los correspondientes pares de cartilla SSR en Col China de flores y tabaco. Después de la electroforesis, los geles de poliacrilamida fueron manchados con el anterior protocolo, que detecta claramente los patrones de bandas de los marcadores SSR (figura 1) de tinción de plata.
Para comparar la eficiencia de detección de protocolos de tinción de plata difer.......
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Discusión
El lavado del gel después de la impregnación es un paso crítico. Volumen de agua y tiempo de lavado puede causar la extirpación incompleta de la solución de impregnación en la superficie de la placa y el gel y resultar en un fondo oscuro. El momento adecuado del desarrollo es otro paso clave, desarrollo excesivo puede resultar en un fondo marrón oscuro con imagen de bajo contraste de fragmentos de ADN. Además, el paso de impregnación afecta significativamente la eficiencia tinción de fragmentos de ADN. Aunque extendiendo.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias naturales en Guangdong de China (2015A030313500), la plataforma de investigación Provincial, clave internacional cooperativa y los principales científicos investigación proyecto de Guangdong educación superior (2015KGJHZ015), la ciencia y Plan de tecnología de administración de monopolio de tabaco de Guangdong (201403, 201705), la ciencia y tecnología Plan de Guangdong de China (2016B020201001), el proyecto de formación de innovación nacional para estudiantes de pregrado (201711078001). Mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar infor....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mezcla maestra de PCR (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, EE. UU | . # 170-8200 | |
| DL500 Marcador de ADN | Takara Bio Inc., Japón | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | # 77-86-1 | |
| Ácido bórico | Sangon Biotech Shanghai, China | # 10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China | #6381-92-6 | |
| Acrilamida | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Persulfato de amonio | Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silano | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehído | Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China | #50-00-0 | |
| Fábrica | reactivos químicos NaOH Guangzhou, China | #1310-73-2 | |
| Ácido acético | Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China | #497-19-8 | |
| Fábrica de reactivos químicos de etanol de Guangzhou, China | #64-17-5 | ||
| HNO< sub>3 | Guangzhou Fábrica de reactivos químicos, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome negro T(EBT) | Tianjin DaMao Fábrica de reactivos químicos, China | #1787-61-7 | |
| Bandeja de plástico | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China-TS-1 | ||
| Shaker | Qilinbeter JiangSu, | China-BenQ | |
| M800 Scanner | BenQ, | ||
| alimentación | Beijing Liuyi Instrument Factory, China-High | ||
| en todos los sistemas de gel verticales, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electroforesis Co., Ltd, China | - |
Referencias
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.
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Reimpresiones y permisos
