Este protocolo proporciona un resumen de los procedimientos para el aislamiento de ARN para los perfiles transcriptómicos de nodo de linfa tejidos de animales grandes, incluyendo pasos en la identificación y extirpación de los ganglios linfáticos de ganado y la fauna, métodos de muestreo para proporcionar consistencia en varios animales y consideraciones más resultados representativos para la conservación de la colección y procesamiento de análisis de ARN.
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Artículo de método
Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales
En este artículo
Resumen
Resumen
Animales grandes (ganado y vida silvestre) sirven como importantes reservorios de patógenos, incluyendo Brucella, Salmonella, Mycobacterium bovisy e. coliy son útiles para el estudio de la patogenia y diseminación de las bacterias en hospederos naturales. Con la función clave de la respuesta inmune del huésped de los ganglios linfáticos, ganglios linfáticos tejidos sirven como una fuente potencial de RNA para análisis transcriptómico aguas abajo, para evaluar los cambios temporales en la expresión génica en las células en el transcurso de una infección. Este artículo presenta un resumen del proceso de la colección de nodos de linfa, tejido muestreo y posterior procesamiento del ARN en ganadería, con ganado bovino (Bos taurus) como un modelo, ejemplos adicionales de bisonte americano (bisonte del bisonte de ). El protocolo incluye información sobre la ubicación, identificación y extirpación de ganglios linfáticos de múltiples sitios claves en el cuerpo. Además, se presenta una metodología de toma de muestras de biopsia que permite una consistencia de muestreo a través de múltiples animales. Se discuten varias consideraciones para la preservación de la muestra, incluyendo la generación de ARN adecuado para aguas abajo metodologías como la secuencia de RNA y RT-PCR. Debido a los retrasos inherentes en grandes animales vs ratón tiempo estudia, se presentan los resultados representativos de bisonte y los tejidos bovinos del nodo de linfa para describir el curso temporal de la degradación en este tipo de tejido, en el contexto de una revisión de anterior trabajo metodológico en la degradación del RNA en otros tejidos. En general, este protocolo servirá a ambos investigadores veterinarios comenzando proyectos de transcriptoma en muestras de animales grandes y a biólogos moleculares interesados en aprender técnicas para el muestreo de tejido en vivo y en vitro procesamiento.
Introducción
Secuenciación del RNA análisis del transcriptoma de los ganglios linfáticos proporciona la oportunidad de caracterizar la respuesta inmune de los animales a una variedad de patógenos. Si bien esta metodología se ha utilizado extensivamente en ratones, análisis han ampliado recientemente en grandes mamíferos1,2. Ganadería y grandes ganglios animal puede utilizarse para caracterizar las respuestas de host a una infección, no sólo para su uso en vacunas o estudios de susceptibilidad genética y para la identificación de dianas para el desarrollo de fármacos, sino también como sistemas modelo para estudios en seres....
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Protocolo
Los procedimientos de autopsia animal representados aquí están cubiertos bajo protocolos IACUC aprobados en el Centro Nacional de enfermedades animales, Ames, IA. Todos los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices aprobadas para el cuidado de los animales y el bienestar.
1. planificación previa antes de la autopsia
- Antes de la autopsia, prepare los siguientes materiales para su transporte a la suite de necropsia:
- tubos de microcentrífuga de 1.5 ó 2 mL llenan de ~ 1.0 mL de solución de preservación de RNA, en un contenedor de transporte o rack. Asegúrese de seguir las instrucciones del fabricante para e....
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Resultados
El uso de las consideraciones presentadas en este artículo (pasos 1-4 del Protocolo) ayudará a la recuperación del ARN de muestras animales grandes que es conveniente para un análisis posterior en estudios de expresión génica de host. Se evaluó la calidad de RNA para aplicaciones posteriores mediante varias medidas estándar. Para espectrofotometría, un260/A280 ratio proporciona una medida de la contaminación de la proteína, y un260/A230 ratio proporciona otra forma de evaluació.......
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Discusión
La mayoría de estudios transcriptómico y los protocolos asociados se centran en ratón, rata o post-mortem de muestras humanas. Sin embargo, investigaciones en ganadería y fauna proporcionan una amplia gama de oportunidades para la caracterización de la respuesta inmune a la enfermedad, como aplicable a la medicina veterinaria y, en relación con las enfermedades zoonóticas, de salud pública. Este protocolo proporciona un resumen de las más importantes consideraciones para la extracción de RNA de alta integridad de los tej.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar. Toda la investigación es financiada con fondos intramuros del Departamento de agricultura de Estados Unidos, servicio de investigación agrícola. Todas las referencias a productos específicos se proporcionan con el fin de reproducibilidad experimental y no representan ningún endoso de estos productos por el gobierno federal.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a James Fosse por su excelente trabajo sobre todo videografía y procesamiento de vídeo; Michael Marti por su excelente trabajo en la generación de imágenes digitalizadas de ganado; Lilia Walther por su ayuda con la extracción de RNA y Bioanalyzer funciona; Mitch Palmer y Carly Kanipe por su útil informe y comentarios en imágenes de nodo de linfa; y el cuidado de los animales y el personal veterinario del Centro Nacional de enfermedades animales por todo su trabajo duro y ayuda con la cría de animales y la preparación para necropsias.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de conservación de ARN (utilizamos RNALater para todos los experimentos) | ThermoFisher | AM7020 | |
| tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml o 2 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Bisturíes desechables | Daigger Scientific | EF7281 | |
| Pinzas de tejido, diente de rata | Fisher Scientific | 12-460-117 | Otras pinzas de tejido disponibles, incluidas las de punta curva, borde cónico, etc., dependiendo de las preferencias |
| del usuario Agujas de biopsia con punzón de 3 mm | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| Contenedor de objetos punzocortantes (pequeño y transportable para la necropsia) | Stericycle | 8900SA | muestra el tamaño de 1 cuarto de galón |
| aquí Tablas de cortar o bandejas desechables | Fisher Scientific | 09-002-24A | Disponible en una variedad de tamaños, según las preferencias del usuario |
| Equipo | Varía según el patógeno (guantes, máscaras respiratorias, gafas, etc.) | ||
| Reactivo de extracción de ARN a base de fenol (utilizamos el reactivo TRIzol para todos los experimentos) | ThermoFisher | 15596026 | |
| kit de extracción de ARN basado en columna de sílice (utilizamos el kit PureLink RNA Mini para todos los experimentos) | ThermoFisher | 12183018A | Diseñado para hasta 100 mg |
| etanol 100% de etanol en tejido (200 pruebas para biología molecular) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Homogeneizador de tejidos con tubos de homogeneización cerrados (utilizamos el disociador gentleMACS para todos los experimentos) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Agarosa (General, para electroforesis en gel) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | También se puede hacer desde cero en el laboratorio |
| Formamida desionizada | EMD Millipore | S4117 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Xilenol cianol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Espectrofotómetro UV-Vis (utilizamos el espectrofotómetro NanoDrop) | Dispositivo ThermoFisher | ND-2000 | |
| para la evaluación cuantitativa de ARN (utilizamos el Bioanalyzer, con componentes y protocolos asociados) | Agilent | G2939BA | |
| Kit de extracción de ARN FFPE (utilizamos el kit de aislamiento de ácido nucleico total RecoverAll para tejido fijado en formol e integrado en parafina) | ThermoFisher | AM1975 | |
| Esparcidor de plástico (esparcidor en forma de L) | Fisher Scientific | 14-665-231 | Solo necesario para pruebas de esterilidad para muestras de animales infectados |
| Cuchillos de necropsia | Conceptos de ganadería | WI-0009209 |
Referencias
- Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459(2015).
- Miller, L. C., et al.
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Reimpresiones y permisos
