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Tinción negativa de EM es una técnica poderosa para la visualización de estructura macromolecular, pero diferentes técnicas de tinción pueden producir resultados diferentes de una manera dependiente de la muestra. Aquí se describen varios métodos de tinción negativa en detalle para proporcionar un flujo de trabajo inicial para hacer frente a la visualización de sistemas difíciles.
Tinción negativa la microscopia electrónica (EM) permite la observación relativamente simple y rápida de macromoléculas y complejos macromoleculares mediante el uso de contraste que realza el tinte reactivo. Aunque limitado en su resolución a un máximo de ~ 18-20 Å, mancha negativa EM es útil para una variedad de problemas biológicos y también proporciona un medio rápido de determinar muestras para microscopia del cryo-electrón (cryo-EM). Tinción negativa está el método directo; la muestra se adsorbe sobre un sustrato, luego una mancha se aplica, borrada y secada para producir una fina capa de mancha densa del electrón en el cual las partículas se encajan. Muestras individuales pueden, sin embargo, comportarse de manera marcadamente diferente bajo diferentes condiciones de tinción. Esto ha llevado al desarrollo de una gran variedad de técnicas de preparación de sustratos, reactivos y rejilla lavar y borrar las técnicas de tinción negativas. Determinar la técnica más adecuada para cada muestra individual se debe hacer sobre una base caso por caso y un microscopista debe tener acceso a una variedad de diferentes técnicas para lograr los resultados de tinción negativa más alta calidad. Cuentan con protocolos detallados para dos métodos de preparación de sustrato diferentes y tres diferentes técnicas Blot, y se muestra un ejemplo de una muestra que muestra resultados muy diferentes dependiendo del método utilizado. Además, se describe la preparación de algunos reactivos de tinción negativa común y dos novela basada en la serie de los lantánidos las manchas, con la discusión sobre el uso de cada uno.
A pesar de la reciente atención a la resolución revolución resultantes de avances significativos en el cryo-Electrón microscopia1 (cryo-EM), negativo mancha EM sigue siendo una técnica poderosa y un componente crucial de la caja de herramientas de electrónica microscopistas. Tinción negativa sigue siendo el mejor método de evaluación rápida de una muestra antes de optimizar condiciones de cryo-red2. El alto contraste y la velocidad de preparación de red de muestras negativas de teñido es ideal para evaluar la pureza de la muestra, la concentración, la heterogeneidad y flexibilidad conformacional3. Muchas estructuras biológicamente informativas resultado de reconstrucciones de tinción negativa, a pesar de la resolución de la técnica se limita a ~ 18 Å de resolución4,5,6, y algunas muestras dan mejores resultados en la mancha que cryo-EM para una variedad de razones7.
En mancha negativa EM, la partícula de interés es fijado por adsorción sobre la superficie de una cuadrícula de EM y envueltos por una matriz amorfa de mancha densa del electrón compuesta. Se produce un alto contraste relativo entre el fondo y las partículas de interés, con la partícula siendo menos electrón denso que el circundante mancha8. Las partículas aparecen como áreas claras debido a su poder de dispersión de electrones bajo en comparación con la densa mancha circundante, que dispersa los electrones más y aparece más oscura. Características Lógicas subestructurales de partículas pueden deducirse de la examinación detallada de imágenes resultantes como mancha será penetrar en cualquier grieta y producir contraste irregular detalle9.
El proceso de tinción negativa comienza con la preparación de un sustrato de soporte en el que se capturan las partículas de la muestra y la capa de manchas secas apoyado. El sustrato de apoyo más utilizadas es una capa de carbono amorfo, a veces apoyada por una fina capa de polivinilo (e.g. Formvar) o polímero de nitrocelulosa (e.g. colodión). Estos sustratos pueden ser adquiridos comercialmente o preparados interno utilizando los protocolos que se describen a continuación.
Después se prepara el sustrato de apoyo, la muestra puede ser aplicada, y el exceso de solución de borrado de. Las muestras deben suspenderse en un tampón adecuado para la tinción negativa. Es mejor evitar el uso de tampón fosfato y altas concentraciones de sal, que pueden dar lugar a precipitados cristalinos que pueden ocultar a la muestra. Agentes reductores, detergentes, sacarosa, glicerol y altas concentraciones de nucleótidos deben evitarse también como también afectar a la tinción de calidad4. Cuando no se puede cambiar la composición del tampón, lavar la superficie de la rejilla de la EM con agua o un tampón más adecuado después de la adsorción y antes de la tinción puede reducir la formación de búfer relacionados con artefactos y mejorar en general el tinción de fondo. Si se sospechan de artefactos de búfer, puede ser informativo a la mancha un sólo buffer grid para determinar si los componentes del buffer son la fuente de los artefactos observados.
Después de la muestra es adsorbida y borrada y lavada si es necesario, se aplica un reactivo de tinción. Una variedad de reactivos se han encontrado para ser eficaces manchas negativas (tabla 1), pero la mancha debe ser elegida para la muestra. Un 'halo' de mancha formas alrededor de la partícula debido a ambos el desplazamiento de las moléculas de colorante por las regiones hidrofóbicas de la proteína y de repulsión por carga grupos. Por lo tanto, debe elegirse la mancha para que el estado de protonación de cualquier potencial grupos cargados en la proteína es la misma que la mancha en el pH de trabajo. Frente a las cargas en la superficie de la proteína puede contribuir a una tinción positiva del efecto, que aunque no es una técnica útil en la su propia derecha10 en el ámbito de este documento. Los reactivos de tinción negativa más comúnmente usados son acetato de uranilo y formato de uranilo. Estas manchas tienen un tamaño de grano relativamente fino (4-5 Å)9 y proporcionan imágenes de mayor resolución sobre otras manchas como fosfo-volframatos (Å tamaño de grano de 8-9)9,11, amonio molibdato11y algunos basados en la serie de los lantánidos las manchas12. Formiato y acetato de uranilo actúan también como un fijador, conservando muchas de las interacciones de proteínas en una escala de tiempo de milisegundos de13, aunque el pH bajo de la mancha y su propensión a precipitar a pH fisiológico puede ser perjudicial para algunas muestras14 . A pesar de su utilidad, las sales de uranilo también presentan retos logísticos que son tóxicos y ligeramente radiactiva, que puede requerir especial manipulación, el almacenamiento, y requisitos de la disposición, que lleva a algunos usuarios a buscar alternativas no radiactivas.
Hay una gran variedad de métodos descritos para la preparación de sustrato, aplicación de muestra y la coloración de rejillas EM. El método más adecuado a utilizar es dependiente de la muestra y puede ser difícil de determinar al abordar un nuevo sistema. Este manuscrito describe dos métodos de preparación de sustrato y tres métodos Blot; lado borrar cajón5y15de lavado rápido. Borrar de lado es el más simple de los métodos descritos. El método de cajón y el método de lavado rápido son más difíciles de implementar, pero limitar el tiempo de contacto de la muestra con la película de soporte antes de la fijación y se han demostrado para mejorar la formación de artefactos de tinción para algunas de las muestras5. El objetivo de este manuscrito es así para proporcionar un flujo de trabajo inicial para hacer frente a la visualización de sistemas un reto por tinción negativa EM.
1. preparación de grillas de EM
2. preparación de los reactivos de tinción negativa
3. adsorción muestras al carbono sustrato y tinción
Todos los reactivos de tinción probados producen Tinción negativa hasta cierto punto, con UF obtención de las muestras con el mayor contraste y partículas más nítidas y más detalladas. Para manchas de lantánido basado profundamente enraizadas de las muestras (figura 1) ErAc y TmAc producción Tinción negativa de calidad equivalente a UA según lo juzgado por el aparente contraste y la nitidez de las partículas teñidas, con TmAc produce más claro, más imágenes nítidas de ErAc. Aunque el mayor tamaño de grano de TmAc se hace evidente en la alta ampliación, cuando las partículas del Virus del mosaico del tabaco (TMV) se tiñeron con TmAc ~ 23 Å repetición de la partícula de la TMV el 1%17 todavía era claramente visible por el ojo y como una línea meridional en el Transformada de Fourier de la imagen raw. Ninguno de las otros lantánidos manchas probadas, ErAc, SmAc o GdAc, fueron capaces de resolver esta función. Medias de clase fueron generados por la extracción de segmentos superpuestos de las partículas TMV donde era visible la repetición helicoidal. Los segmentos extraídos entonces fueron alineados y clasificaron usando RELION18 para visualizar mejor la función periódica (figura 2).
Algunas muestras son especialmente sensibles al método de tinción, como el músculo había derivado C-proteína. Proteína C, que consiste en una cadena flexible de Ig y Fn-como dominios, produce imágenes significativamente diferentes por tinción negativa EM depende del método de tinción utilizado (figura 3). Cuando el método de lado-blotting, se derrumbó anillo-como las estructuras se observan, mientras que cuando manchado el rápido o sacudiendo métodos, proteína C se observa como una serie de dominios que se asemejan a cuentas en un hilo.
| Reactivo de | Concentración | pH | Tipo |
| Molibdato de amonio | 1 - 2% | 5 – 7 | Aniónicos |
| Acetato de Erbio (ErAc) | 1 – 2% | 6 | Catiónico |
| Acetato de gadolinio (GdAc) | 1 – 2% | 6 | Catiónico |
| Tungstato de metilamina | 2% | 6 – 7 | Aniónicos |
| Acetato de samario (SmAC) | 1% | 6 | Catiónico |
| Silicotungstate de sodio | 1 – 5% | 5 – 8 | Aniónicos |
| Fosfotungstato de sodio | 1 -3% | 5 – 8 | Aniónicos |
| Acetato de Tulio (TmAc) | 1 – 2% | 6 | Catiónico |
| Acetato de uranilo (UA) | 1 – 3% | 3-4 | Catiónico |
| Formato de uranilo (UF) | 0.75-1% | 3-4 | Catiónico |
Tabla 1: Algunos reactivos Tinción negativa común.
Figura 1: imágenes de ejemplo del Virus del mosaico del tabaco teñidas con diversos reactivos de tinción negativa (A) 1% UF (B) 2.5% TmAc (C) 2,5% ErAc. (D) 1% UA (E) 2.5% GdAc) y (F) 2.5% SmAc. Barras de escala son 100 nm. Imágenes representativas de múltiples repeticiones con múltiples áreas reflejadas por repetición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Virus del mosaico del tabaco de tinción con acetato de Tulio (A) alta ampliación de área de una micrografía de TMV teñidas con 1% TmAc. Barra de escala es de 20 nm. (B) de la clase media de los segmentos extraídos de TMV. (C) transformada de Fourier de la imagen en reflejos de línea de capa panel A muestra en ~ 23 Å. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: efectos de borrar el método en la conformación de la proteína C. (A) proteína C tinción con UA utilizando el método de la mancha blanca /negra de lado (B) método de cajón. Barra de escala del panel superior es de 50 nm, barra de escala inferior de panel es de 20 nm. Imágenes representativas de múltiples repeticiones con múltiples áreas reflejadas por repetición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este manuscrito describe varios métodos para la tinción negativa de muestras para microscopía electrónica usando una variedad de coloración de reactivos, incluyendo dos reactivos lantánidos novela (TmAc y ErAc). Muchos de los pasos del proceso de tinción negativa deben ser optimizados para muestras individuales, incluyendo la elección de la mancha, la cantidad de lavado requerida si alguna y la técnica blot. Así, este manuscrito proporciona una base para microscopistas desarrollar sus propios flujos de trabajo para hacer frente a la tinción negativa de sistemas difíciles.
La elección de la mancha es altamente dependiente de la muestra. Las muestras que son especialmente sensibles a pH bajo pueden ser degradadas por UA o UF, a pesar de las propiedades de fijación de estas manchas19. En estos casos, el lantánido base manchas tales como TmAc o ErAc puede ser más apropiado, aunque el pH global de la preparación debe estar por debajo del punto isoeléctrico de la proteína de la muestra para evitar la coloración positiva. Esto se logra acidificando la tinción con ácido acético, si es necesario. Para las muestras sensibles especialmente bajo pH, aniónicos tungstato o molibdato de manchas pueden ser más eficaces. Aunque estas manchas se han encontrado para inducir la formación de artefactos en algunos casos, tales como la formación de rouleaux en lipoproteína de muestras20. Otra vez, el pH de la mancha puede necesitar ser ajustada, esta vez por encima del punto isoeléctrico de la muestra, para evitar la tinción positiva.
Lavado de la muestra antes de la tinción puede ser necesario si el búfer en el que se mantiene la muestra tiene un alto componente de sal o fosfato. En muchos casos, se puede realizar lavado con agua ultrapura pero para las muestras más sensibles, que pueden degradar o someterse a cambios estructurales cuando se expone a agua sola, puede necesitar lavado se realizará con un buffer volátil de baja fuerza iónica8. Incluso bajo condiciones cuidadosamente controladas, lavado puede resultar en un cambio estructural en la superficie de carbono21.
El método por el cual una cuadrícula está preparada en términos de adsorción de la muestra, el borrar y tinción también significativamente puede afectar lo que se observa. El método más adecuado es por lo tanto, una vez más, muy muestra dependiente. Proteína C, por ejemplo, se observa como una anillo-como la estructura globular tras tinción de lado-blot, pero esto parece ser un artefacto del proceso de tinción, según lo revelado cuando rejillas son preparadas por el método de cajón (o por el método de lavado rápido) (figura 3 ). En los métodos de lavado cajón y rápidos, el tiempo de que la muestra tiene que interactuar con el carbono superficie de apoyo antes de la fijación es mínimo15. La muestra también experimenta menos fuerzas de retroceso menisco a borrar antes de la fijación. Esto significa que los cambios estructurales en la muestra que podría ocurrir en el tiempo de absorción prolongada en la película de carbón o por capilaridad se minimizan. El método de lavado rápido puede utilizarse también para el análisis de tiempo-resolved de especímenes. La muestra puede ser mezclada con un ligando o aditivo en una punta de pipeta para un conjunto de período de tiempo antes de la aplicación a una red o sólo momentáneamente en la superficie de la rejilla antes de fijación dentro de milisegundos.
La profundidad de la mancha debe proporcionar imágenes óptimo de una muestra particular es otra vez dependiente de la muestra2. Si la mancha es demasiado superficial, las moléculas pueden ser dañadas por el haz de electrones, pero si la mancha es demasiado gruesa características estructurales se puede perder. Profundidad de la mancha está influenciada por múltiples factores como la hidrofilia de la superficie de la rejilla, uniformidad de la capa de carbón, la cantidad de tinción aplicada a la red, la duración de la mancha está en contacto con la red antes de borrar, la medida de borrar y el tiempo ta KES para la cuadrícula completamente seco. Una red nunca tendrá una distribución uniforme de la mancha en su totalidad y por tanto es necesario seleccionar cuidadosamente las áreas de la rejilla apropiada para la proyección de imagen. De hecho, rejillas a menudo varían en calidad incluso cuando se prepara el mismo día en las mismas condiciones. Un buen ejemplo de cómo variación en profundidad de la mancha afecta la apariencia de las moléculas y la profundidad de la mancha apropiada para la proyección de imagen se proporciona por Burgess et al.5.
A pesar de negativas tinción un método muy versátil, rápido y sencillo, no todas las muestras biológicas son susceptibles de visualización por este método. Asambleas frágil pueden contraer o desmontar sobre adsorción, manchas o sequedad en la EM la red22. Tinción negativa puede también conducir a aplanar de las moléculas e inducir recomendado: orientaciones de las moléculas el carbono soporte película7.
Tinción negativa es una valiosa herramienta para la evaluación de las muestras en sí mismo y también antes del análisis de cryo-EM pero muchas de las fuerzas físicas que se encuentra con la muestra durante el proceso son poco conocidos. Por lo tanto, el mejor método a utilizar se muestra altamente dependiente y debe determinarse por ensayo y error, en lugar de autodidacta siguiendo un protocolo fijo.
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Estamos muy agradecidos a Peter Knight para discusiones útiles y revisión crítica del manuscrito. Nos gustaría agradecer a todos los miembros de los laboratorios de Neil Ranson y de Stephen Muench y el personal del laboratorio de bioestructura Astbury para discusiones útiles. Este trabajo fue financiado por el Consejo Europeo de investigación (FP7/2007-2013) / ERC conceder acuerdo 322408. Proteína C fue producida utilizando recursos proporcionadas por una beca de la Fundación británica del corazón (BHF PG/13/83/30485). También agradecemos la confianza de Wellcome para el equipo de financiación para apoyar la microscopia electrónica en Leeds (090932/Z/09/Z y 094232/Z/10/Z). CS es financiado por una subvención de ISSF Wellcome Trust.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Rejillas EM de cobre de malla 200 | Sigma-Aldrich | G4776-1VL | También se pueden utilizar otros materiales y/o tamaños de malla |
| Molibdato de amonio | Sigma-Aldrich | 277908 | |
| Evaporador de carbono | Ted Pella Inc. | 9620 | Cressington 208 o solución de |
| colodión equivalente al 2% en acetato de amilo | Pinzas de presión negativa Sigma-Aldrich | 9817 | |
| Dumont #5 | World Precision Instruments | 501202 | U otras pinzas como prefiera |
| Acetato de Erbio | Sigma-Aldrich | 325570 | |
| Acetato de Gadolinio | Sigma-Aldrich | 325678 | |
| Láminas de mica. 75x25x0.15mm. | AGAR Scientific | AGG250-1 | |
| Portaobjetos de microscopio, blanco esmerilado | Fisher Scientific | 12607976 O equivalente | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 10018130 O equivalente | |
| Pipeta Pasteur (vidrio) | Fisher Scientific | 10343663 | O equivalente |
| Hoja de afeitar | Fisher Scientific | 11904325 | O equivalente |
| Papel de lija | Ferretería | Papel de lija húmedo y seco con grano más fino que 200 (600 sugeridos) | |
| Acetato de samario | Sigma-Aldrich | 325872 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | 1.06462 | |
| Fosfotungstato de sodio | Sigma-Aldrich | P6395 | |
| Malla de acero inoxidable, 150x150 mm (cortado a medida). | AGAR Scientific | AGG252 | |
| Acetato de tulio | Sigma-Aldrich | 367702 | |
| Afilador de cañas de carbono de dos pasos, para cañas de 1/4" | Ted Pella Inc. | 57-10 | O equivalente para el evaporador de carbono utilizado |
| ultrapura | |||
| Acetato de uranilo | Ciencias de la microscopía electrónica | 22400 | |
| Formiato de uranilo | Ciencias de la microscopía electrónica | 22450 | |
| Grasa al vacío | Fisher Scientific | 12719406 | O equivalente |
| Whatman #1 Papel de filtro. | Fisher Scientific | 1001 090 | O |
| equivalente Papel de filtro Whatman #40 | Fisher Scientific 10674122 | O equivalente |
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