Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.
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Artículo de método
Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Pacientes con síndrome de Sjögren, una enfermedad autoinmune que afecta las glándulas exocrinas, desarrollan inflamación de la glándula salival y han reducido la producción de saliva. Del mismo modo, la producción de saliva está comprometida seriamente en pacientes que reciben radioterapia para cánceres de cabeza y cuello. Modelos de roedores, desarrollados para imitar estas condiciones clínicas, facilitan la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y permitan el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, la capacidad precisa, reproducible y varias ocasiones medir la función de la glándula salival en modelos animales es fundamental. Basándose en procedimientos previamente descritos en la literatura, que cumple estos criterios y se utilizó para evaluar la función de la glándula salival en ratones se desarrolló un método. Una ventaja adicional de este nuevo método es que se domina fácilmente y tiene poca variación inter-operador. Función de la glándula salival se evalúa como la cantidad (peso o volumen) o (mL/min) de la saliva producida en respuesta a la estimulación de la pilocarpina. La recogida de la saliva es una buena fuente para el análisis de contenido de proteína, las concentraciones de inmunoglobulinas y otras biomoléculas.
Introducción
Las glándulas salivales producen la saliva en respuesta a una variedad de estímulos neurológicos y mecánicos1. Los estímulos son llevados a través del sistema nervioso simpático y parasimpático a los receptores adrenérgicos y colinérgicos en la glándula. La pilocarpina es un agente colinérgico, párr simpaticomimético que actúa predominantemente sobre los receptores muscarínicos. En las glándulas salivales, induce la producción de saliva actuando sobre el receptor muscarínico M31. La producción de saliva tras la administración de pilocarpina es un indicador de la capacidad de responder a la estimulación de las glándulas salivales y es comúnmente usada como una medida de la función de la glándula salival.
Medición precisa de la producción de saliva es importante en el estudio de enfermedades de las glándulas salivales como síndrome de Sjögren2 y lesión por radiación después de tratamiento de cáncer de cabeza y cuello3. Varios métodos se han desarrollado para medir la producción de saliva de roedores. Estos incluyen directa canulación del conducto excretor salival4, colección de saliva desde la cavidad bucal bajo vacío5y colección mediante tubos capilares de cristal6 o una micropipeta7,8, 9. dirigir la canulación del conducto salival proporciona la más precisa y pura saliva. Sin embargo, este es un procedimiento técnicamente difícil, y el potencial para causar lesión ductal excluye colecciones repetitivas saliva del mismo animal. Recogida de saliva bajo vacío puede llevar a resultados variables debido a la sequedad de la saliva del tubo. Esta pérdida es aún más exagerada en ratones con disminución de la salivación. Capillares de vidrio permiten la recogida de saliva para análisis posteriores, sin embargo, cambios en la viscosidad de la saliva secretada en el estado enfermo impide eficiente llenado del tubo capilar. Además, intenta barrer la cavidad bucal para recoger saliva residual puede provocar lesiones. El método de pipeta permite la colección completa, y para el mismo operador, es notablemente consistente entre experimentos. Sin embargo, por razones desconocidas, este método muestra una variación significativa entre los diferentes operadores. Por lo tanto, para permitir comparaciones apropiadas, resulta imprescindible que el operador mismo realiza todos los experimentos relacionados con un proyecto específico. Claramente, esto representa una gran desventaja para un laboratorio.
Para superar estos problemas, se desarrolló un procedimiento que combina métodos de recolección de saliva se utilizan para los seres humanos y roedores. El método del hisopo, que se describe a continuación para medir el volumen de saliva inducida por la pilocarpina es simple, reproducible, no influenciado por el operador y puede realizarse varias veces en el mismo animal. Además, permite recoger la saliva para el posterior análisis de las proteínas, inmunoglobulinas o de otras biomoléculas.
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Protocolo
El protocolo que se describe a continuación fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y uso y sigue las normas éticas establecidas por los institutos nacionales de salud. Todos los datos presentados en este informe se generaron mediante el uso de ratones femeninos que fueron 10-12 semanas de edad. Se utilizaron las siguientes cepas de ratones: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S y F1 (B6XA/J). Todos los ratones fueron alojados en jaulas de barrera (a 5 animales por jaula) en condiciones libres de patógenos específicas y proporciona alimento y agua ad libitum.
1. preparación
- Para preparar una solución de clorhidrato de pilocarpina, pesan 10 mg de compuesto y disolver en 1,776 mL de solución salina isotónica estéril con un vórtex, para dar una solución stock de 5,63 mg/mL. No hay necesidad de esterilizar esta solución. Pero si lo desea, filtrarla por un filtro de 0.2 μm. Almacenar esta solución en múltiples alícuotas en un congelador de-80 oC hasta por 3 meses. Cada helado es de un solo uso. Una vez descongelado, no vuelva a congelar la solución de pilocarpina.
- Tomar 0,6 mL de los tubos del microfuge y cuidadosamente perforar un pequeño agujero en la parte inferior de cada tubo con una aguja de calibre 18 climatizada. Coloque estos tubos en tubos de 2 mL. Los tubos no necesitan ser estériles.
- Usando una hoja de afeitar afilada, estéril, cortar esponjas absorbentes cilíndricos en trozos de unos 2 cm de longitud. Cortar cada 2 cm diagonal para dar 2 torundas de forma cónicas. Coloque una torunda en cada uno de los tubos de microcentrífuga de 0.6 mL.
- Pesar el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL que contiene el hisopo seco.
- La transferencia de los ratones que se estudiarán en una nueva jaula limpia con botellas de agua. Mantener los ratones sin alimentos durante al menos 2 h antes del inicio de la colección de saliva para evitar que las partículas de alimentos contaminen la saliva recogida.
Nota: No es necesario tener 1 ratón por jaula para este procedimiento. Sin embargo, el número de ratones en cada jaula depende de reglas específicas de la institución y de uso animal. - Justo antes del final de 2 h, preparar la solución de pilocarpina de trabajo (0,0563 mg/mL) diluyendo la solución madre 100 x en solución salina estéril. No es necesario más filtro esterilizar esta solución. Mantenga siempre la solución de trabajo de la pilocarpina en el hielo.
Nota: La tabla 1 muestra la cantidad de pilocarpina que se inyecta para un rango de peso corporal de ratón para darle una última dosis de 0,375 mg/kg peso corporal.
2. procedimiento
- Peso de cada ratón y determinar la dosis de la mezcla anestésica para cada ratón utilizando la tabla 1. Inyectar el primer ratón con el volumen adecuado de la mezcla anestésica por vía intraperitoneal. Ajuste el temporizador durante 2 min (mayoría de las cepas de ratón en este protocolo de ir a dormir por 2 min). Asegúrese de que el ratón correctamente está anestesiado por la falta de caminar cuando se coloca sobre una superficie plana. Si el ratón está caminando todavía, espere 2 minutos adicionales antes de proceder al siguiente paso. Aplique una gota de lubricante pomada oftálmica en ambos ojos para evitar que se sequen.
Nota: En la tabla 1, la dosis de la mezcla anestésica es 0,007 mL/g de peso corporal. El rango óptimo para este procedimiento es 0.006 a 0.008 mL/g de peso corporal. Sin embargo, después de 4 minutos, si el ratón está todavía caminando o exhibir movimientos espasmódicos, consultar con el veterinario institucional para aumentar adecuadamente la dosis del anestésico. - Determinar la dosis de pilocarpina para el ratón utilizando la tabla 1 e inyecte la cantidad apropiada por vía intraperitoneal. Ajustar el temporizador de 2 minutos y colocar el ratón en el tubo de limitador de 50 mL hasta que la cabeza y las orejas sobresalen el extremo cortado. Coloque el tubo en un ángulo de 45 grados, con la cabeza hacia abajo y la superficie ventral hacia arriba. Con cinta adhesiva el tubo a la Junta Directiva de procedimiento para guardarlo de la mudanza.
Nota: Tabla 1 proporciona dosis de ratones más de 17 g, como este procedimiento no se ha intentado en ratones debajo de 17 g de peso. - Al final de 2 minutos, suavemente inserte un par cerrado de micro fórceps de disección en la boca y levante la mandíbula inferior hacia arriba para abrir la boca. Empujar la pinza 1-2 mm más en la boca, asegurándose de que la lengua se ve apoyada en el brazo superior de las pinzas. Con otro par de Pinzas finas, mantener el hisopo seco previamente pesado cerca de su extremo cónico.
- Deslice suavemente el extremo cónico de la esponja en la boca. Retirar las pinzas dejando la punta de la torunda en la cavidad bucal.
- Sujete el extremo más ancho de la torunda que se extiende fuera de la boca y girar para permitir que la superficie máxima de contacto con la boca. Mantener el hisopo en esta posición durante 15 minutos.
Nota: Esto asegura que el hisopo permanezca en la boca para la duración de la colección. Tenga en cuenta que el extremo cónico de la torunda actúa como una mecha y la parte más ancha de la esponja permanece fuera de la boca. - Al final de 15 minutos, suavemente gire el hisopo para recoger cualquier saliva que no ha sido absorbida y colocar el hisopo mojado en el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL. Cierre el tubo y colóquelo en el tubo de 2 mL a hielo.
Nota: En este momento, la mucosa oral aparece completamente seca. El ratón puede ahora mover hacia atrás en su jaula para la recuperación de la anestesia. - Transferir el ratón en la jaula. Coloque bolitas de alimento húmedo en la jaula después de la recolección de saliva para ayudar a la rehidratación más rápida.
Nota: Los ratones se despiertan dentro de 10 minutos después del final de la colección. Inyección subcutánea de solución salina isotónica con 0.2 mL se puede administrar también para acelerar la recuperación. - Proceder al próximo ratón. Todos los ratones deben ser vigilados hasta que han recuperado completamente y son ambulatorios.
3. las mediciones
- Al final de todas las colecciones, pesar los tubos 0.6 mL con el hisopo mojado. Calcular la diferencia entre el peso húmedo y peso seco para obtener el peso de saliva producida. Coloque el tubo de 0.6 mL con saliva en el tubo de 2 mL.
- Cortar las tapas de los tubos de 2 ml. Luego, centrifugar los tubos de 2 mL por 2 min a x 7500 g, a 4oC en una micro centrífuga para recuperar la saliva. Medir el volumen de saliva obtenido usando una micropipeta.
- Los resultados se expresarán como saliva peso (mg)10 sobre 15 minutos o como una relación de peso de saliva (mg) / peso (g) del ratón.
Nota: Si se ha medido el volumen de saliva extraída de la torunda, expresar los resultados como el volumen de saliva recuperado (mL) o el cociente del volumen de saliva (mL) peso (g) de ratón.
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Resultados
En los sistemas de modelo experimental de ratón, la capacidad de producir saliva en respuesta a la estimulación de la pilocarpina se utiliza como un indicador de la función de la glándula salival. La producción de saliva se midió en ratones hembra de 11 semanas de edad C57BL/6 por el método de esponja. En la figura 1A, los resultados se expresan como la cantidad de saliva (mg) recogido después de cada vez mayor dosis de pilocarpina. A la dosis de 1 mg/kg de p...
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Discusión
La producción de saliva es un proceso complejo y está influenciada por muchos factores. Por lo tanto, la función de la glándula salival en animales de laboratorio de medición puede ser un desafío. Un desafío adicional es que mediciones repetidas de la función de la glándula salival en el mismo animal son necesarias para establecer el inicio de la enfermedad o para demostrar la recuperación después del tratamiento.
El método de hisopo que se describe en este informe es técnicamente fácil de rea...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Agradecimientos
El estudio fue apoyado por una subvención de los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Dental e investigación craneofacial (DE025030).
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Materiales
. . fuerte .
fuerte . . . . de. .
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Productos químicos para la recolección de saliva | |||
| pilocarpina | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, EE. UU | B21410 | Diluido en solución salina isotónica estéril. Almacene alícuotas de un solo uso de 100X en stock a -80oC |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| >Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL de clorhidrato de ketamina + 0,5 mL de xilacina + 8,5 mL de solución salina isotónica estéril estéril en un vial estéril. Se puede utilizar durante 3 meses. | ||
| Zetamina (clorhidrato de ketamina) | Vet One, Boise, Idaho, EE. UU | C3N VT1 | El stock es de 100 mg/mL |
| Anased (xilazina) | Med-Vet International, Mettawa, IL, EE. UU | RXANASED-20 | El stock es de 20 mg/mL |
| Solución salina estéril isotónica | Vet One, Boise, Idaho, EE. UU | 501032 | Utilizado como diluyente |
| Lágrimas artificiales (ungüento oftálmico lubricante) | Henry Schien, Dublin, OH, EE. UU | . 48272 | Se utiliza para evitar que los ojos se sequen durante el procedimiento |
| Nombre | >Empresa | >Número de catálogo | Comentarios |
| Materiales para la recolección de saliva | |||
| SalivaBio Hisopo infantil | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, EE. UU. | N/A | Hisopos envueltos individualmente Tubos |
| polipropileno de 50 ml | VWR, Radnor, PA, EE. UU | . 89004-364 | Corte la parte inferior del tubo. Asegúrese de que el borde de corte sea liso. |
| Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml | VWR, Radnor, PA, EE. UU | . 87003-290 | Haga agujeros en la parte inferior del tubo con agujas de calibre 18 calentadas Tubos de |
| microcentrífuga de 2 ml | VWR, Radnor, PA, EE. UU | . 87003-298 | |
| Jeringas de insulina con agujas fijas de forma permanente | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EE. UU | . 324702 | |
| Agujas de bisel regulares de | calibre 18Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU. | 305195 | |
| Hoja de bisturí estéril #11 | Integra York Inc PA, EE. UU. | 4-311 | |
| Pinzas de microdisección | Roboz, Gaithersburg, MD, EE. UU. | RS-5139 | Punta angular dentada de 0,8 mm, 4" de longitud |
| Cinta de etiquetas | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU | SC-224487 | |
| Temporizador de 3 canales | Amazon.com, Seattle, WA, EE. UU | B06W2KCYVN | |
| Balanza analítica | Mettler Toledo, Columbus OH, EE. UU | ||
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| >Químicos/ reactivos para inducir la disfunción salival | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, EE. UU | TLRL-b5lps | Disolver en agua libre de endotoxinas y almacenar la solución madre a 5 mg/mL . diluir en HBSS estéril 100 ug/mL - inyectar 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adyuvante | Thermo Scientific | 77161 | Diluir 1:1 en solución salina estéril. Inyectar por vía intraperitoneal 0,1 mL/ratón |
| Antisuero anti-Ro52 de conejo | Generado en el laboratorio | Inmunización de conejos con Ro52 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Chemicals/ Kits para análisis de saliva | |||
| lisozima salival fuerte | |||
| EnzChek Kit de ensayo de lisozima | Sondas moleculares, Eugene, OR, EE. UU | E-22013 | Utilizado según las instrucciones del fabricante |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Estimación > IgA salival | |||
| ratón | Southern Biotech, Birmingham, AL, EE. UU | . 0106-01 | Normas para ELISA sándwich - rango de 30 ng/mL a 0,5 ng/mL |
| IgA anti-ratón de cabra sin etiquetar | Southern Biotech, Birmingham, AL, EE. UU | . 1040-01 | Capa de 1 ug/mL en tampón de bicarbonato |
| IgA anti-ratón de cabra HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, EE. UU | . 1040-05 | Anticuerpo de detección utilizado en sustrato TMB con dilución 1:4000 |
| Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EE. UU. | 555214 | Utilizado según las instrucciones del fabricante | |
| Immulon 4HBX Microtitulación de 96 placas de pocillos | Thermo Scientific, Rochester, NY, EE. UU | . 3855 | |
| Name | Company | >Número de catálogo | Comments |
| Estimación de proteínas salivales | |||
| Bio-Rad Protein Assay Colorante Reactivo Concentrado | BioRad, Hercules, CA, EE. UU | 5000006 | Para la estimación de proteínas según las instrucciones del fabricante |
Referencias
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