Method Article

Generación y el aislamiento de células de ciclo celular detenido con los Karyotypes complejos

DOI:

10.3791/57215

⸱

April 13th, 2018

 ,  , 
1Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploide conduce a inestabilidad genómica, que eventualmente produce células ciclo celular detenido con los karyotypes complejos. Este artículo proporciona un método simple y conveniente para aislar células aneuploides con los karyotypes complejos que dejan de dividirse.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mala segregación cromosómica conduce a aneuploidía, una condición en la cual las células albergan un número cromosómico desequilibrado. Varias líneas de evidencia indican fuertemente que aneuploide desencadena inestabilidad genómica, en última instancia generar células con los karyotypes complejos que detención su proliferación. Aislamiento y caracterización de las células que los karyotypes complejos son cruciales para estudiar el impacto de un número cromosómico desequilibrado en fisiología celular. Hasta la fecha, se han establecido ningún método fiable aislar esas células aneuploides. Este documento ofrece un protocolo para el análisis de células aneuploides y enriquecimiento con los karyotypes complejos utilizando técnicas de cultivo de tejido estándar, de bajo costo. Este protocolo permite analizar varias características de células aneuploides con los karyotypes complejos incluyendo su fenotipo secretor asociados a senescencia inducida, propiedades proinflamatorias y capacidad para interactuar con las células inmunes. Porque las células cancerosas a menudo albergan los desequilibrios en el número de cromosomas, es crucial para descifrar cómo aneuploide afecta la fisiología de la célula en las células normales, con el objetivo último de descubrir tanto sus pro - y anti - tumorigenic efectos.

Introduction

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Provocar errores en el proceso de segregación cromosómica aneuploide, una condición caracterizada por un número de cromosomas no es múltiplo del haploide1,2,3,4. Aneuploides karyotypes estrés de replicación de disparador que genera aún más inestabilidad genómica5,6,7,8,9,10, aumenta complejidad del cariotipo y en última instancia conduce a la detención del ciclo celular de una subpoblación de células10. El propósito del método presentado aquí es generar y separar tal una subpoblación de células de ciclismo. Mediante el empleo de técnicas de cultivo de tejido barato, este protocolo facilita el aislamiento y caracterización de células aneuploides ciclo celular detenido con los karyotypes complejos. Estas células se denominan células de ArCK (detenido con cariotipo complejo) y sus homólogos ciclismo euploides como controles.

Este protocolo es el primero en ser establecido para este propósito y permite el aislamiento y profundizar el estudio de líneas de ArCK incluyendo pero no limitado a, su senescencia inducida y el fenotipo secretor asociada a la senescencia (spas), sus pro-inflamatoria características y su capacidad para interactuar con las células inmunes. El método presentado aquí se ha desarrollado en las células humanas transformadas, inmortalizadas, pero no ha sido probado en líneas de cáncer. Algunas células transformadas pueden ser insensibles a la detención del ciclo celular debido a la supresión de uno o múltiples vías; por lo tanto, más validación debe realizarse en otras líneas celulares.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Condición de la cultura

Línea celular de hTERT RPE-1 fue cultivado en modificado Eagle Medium de Dulbecco (Tabla de materiales) suplementado con 10% Suero Fetal Bovino y 2 mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Las células se incubaron a 37 ° C con 5% CO2 en un ambiente humidificado. El protocolo que se describe a continuación ha sido desarrollado utilizando platos de 10 cm y todos los datos técnicos registrados se refieren a los platos. Si utiliza platos diferentes, la escala hacia arriba o hacia abajo en consecuencia.

1. sincronización de las células RPE-1

  1. Utilice las células recién descongeladas que no han sufrido más de 15 pasos para todos los experimentos. El día 1, descongelar y dispensar ~2.5 - 5.0 x 105 1 RPE células hTERT en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm. Añada 8 mL de medio de cultivo estándar e incubar durante la noche. Determinar el número de celular utilizando un contador de célula estándar (por ejemplo un hemocitómetro).
    Nota: La densidad celular se refiere a condiciones de crecimiento de las células RPE-1. Condiciones de crecimiento pueden variar entre diferentes líneas celulares; considerar ajuste en consecuencia.
  2. En el día 2, sincronizar las células en la frontera de G1/S aspiración medio de crecimiento regular y añadiendo medio 8 mL que contiene timidina 5 mM.
    Nota: Concentración de timidina y la duración del tratamiento pueden variar a través de diferentes líneas celulares. Es recomendable realizar experiencias piloto para determinar las mejores condiciones para las líneas de la célula ser probado.
  3. El día 3, 24 h después de agregar el medio timidina (paso 1.2), lanzamiento del bloque de la timidina por medio de aspiración y lavar las células 3 veces con PBS 1 x. Añada 8 mL de medio de crecimiento regular y devolver las placas a la incubadora.

2. generación de aneuploides células por interferencia con la actividad de la quinasa mitótica Mps1

  1. El día 3, 6 h después del lanzamiento del bloque de la timidina (paso 1.3; Esto es aproximadamente 3-6 h antes de entrar en las células de mitosis), medio de aspirar, lavar una vez con PBS 1 x y reemplazar con medio que contiene 500 nM reversine (inhibidor de la Mps1).
    Nota: Entrar en las células RPE 1 mitosis 9-12 h después de timidina lavado10,11. Sin embargo, cinética del ciclo celular varía entre diferentes líneas celulares. Por lo tanto, es crucial para determinar las cinéticas en experiencias piloto mediante la realización de análisis de ciclo celular por métodos establecidos (p. ej., mediante la medición de DNA contenido vía FACS análisis). Además, la concentración de trabajo óptimo de inhibidor de la Mps1 puede variar entre las líneas celulares. Experimentos anteriores con células RPE1 han tenido éxito usando reversine en una concentración de trabajo de 500 nM10,11,12. Es recomendable realizar experiencias piloto para determinar la concentración óptima para la línea celular a probarse.
  2. El día 4, 12 h después del tratamiento de reversine (aproximadamente 6 h después de las células en mitosis), reversine medio de aspirar y lavar las células 3 veces con PBS 1 x. Añada 8 mL regular crecimiento medio a la placa y volver a las células a la incubadora.

3. eliminación de células aneuploides ciclismo y enriquecimiento de la población de ArCK

  1. El día 6, unos 72 h después de entrar en las células de la primera mitosis (paso 2.2; Esto es unos 66 horas después de reversine lavado-hacia fuera, que corresponde a unos 2-3 ciclos de la célula), medio de aspirar, lavar una vez con PBS 1 x y sustituir con medio que contiene 300 nM nocodazole.
    Nota: El trabajo reciente ha demostrado que las células RPE-1 que los cariotipos aneuploides son genómicamente inestables y detención su proliferación sobre 2-3 ciclos de celular después de las primeras mitosis defectuosa10. Sin embargo, esta cinética puede variar entre diferentes líneas celulares. Por lo tanto, es crucial para llevar a cabo experiencias piloto para determinar el tiempo adecuado para la eliminación de células aneuploides de ciclismo.
  2. En el día 7, 12 h después del tratamiento del nocodazole, Aspire mediano y añadir 3 mL de 1 x PBS a la placa. Sacudir las células mitotic golpeando el lado de la placa. Gire la placa entre cada golpecito para permitir incluso eliminación de las células mitotic.
  3. Para asegurar la completa eliminación de las células mitotic, repita el proceso de batido para múltiples rondas (3 - 5 veces recomendados), aspirando y agregar 3 mL de 1 x PBS entre cada ronda.
  4. Tras sacudir, aspirar suavemente cualquier líquido que se adherido a la tapa o el borde de la placa. Brevemente, Compruebe la placa bajo un microscopio con un aumento X 10. Asegurar que se observan pocas células mitóticas. Si más de cinco células mitóticas se observan con objetivo de 10 X, repita otra ronda de shake.
    Nota: Las células Mitotic aparecen redondeadas y pueden ser parcialmente separadas tras Agitar. Es crucial para asegurar la eliminación completa de células mitóticas antes de exponer las células a la siguiente ronda del nocodazole tratamiento. No hacerlo puede conducir a la muerte celular mitótica o resultar en la generación de células tetraploides.
  5. Tras final sacudir, lavar las células una vez con 5 mL de PBS 1 x. Añadir a medio 8 mL que contiene 330 nM nocodazole en la placa e incubar durante 12 h.
  6. Repita nocodazole tratamiento/shake-off (pasos 3.1-3.5) cada 12 h hasta que no las células mitóticas se observan después de la incubación. Por lo general, se recomiendan 4-5 rondas de tratamiento/shake.
    Nota: La información proporcionada aquí consulte las células RPE-1. El número de rondas de tratamiento/shake puede variar entre diferentes líneas celulares. Para evitar la exposición prolongada e innecesaria para nocodazole es crucial para determinar cuidadosamente, en un experimento piloto, el número de rondas necesarias para la eliminación eficaz y completa de células aneuploides de ciclismo.
  7. Después de 4-5 rondas de nocodazole tratamiento/shake (pasos 3.1-3.6), añadir 10 mL de medio de crecimiento regular e incubar. Deje reposar 12-24 h antes de su uso futuro de manipulación o ensayo de las células.
    Nota: Tras última sacudida, las células restantes de la placa son ciclo celular detenido y, como se muestra recientemente10, albergan los karyotypes complejos. Estas células se denominan células de ArCK (detenido con cariotipo complejo). Es recomendable realizar ensayos en las poblaciones de ArCK dentro de una semana de aislamiento.
  8. Opcionalmente, para evaluar el porcentaje de células detenidas con los karyotypes complejos, recoger y contar las células de cada batido usando un contador de células estándar.

figure-protocol-1
Figura 1: esquema general del método utilizado para generar y aislar células aneuploides con cariotipo complejo (ArCK) e imágenes representativas. (A) esquema de ArCK células protocolo de generación y el aislamiento. (B) imágenes representativas de RPE-1 células de hTERT en cada etapa del tratamiento. El último panel (contorneado en color rojo) representa las células aisladas de ArCK. Escala de la barra 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Caracterización de la población de ArCK

  1. Confirman aislamiento exitoso de ArCK población mediante la realización de los ensayos siguientes.
    1. Valorar beta-galactosidasa (el marcador de la senescencia) de tinción utilizando comercialmente disponible kit (véase tabla de materiales).
    2. Medida la secreción de citoquinas proinflamatorias, como CCL2, mediante el empleo de kits disponibles en el mercado (véase tabla de materiales).
    3. Confirman el aumento de los niveles del ciclo celular inhibidores p53, p21, p16 por Western Blot.
      Nota: Para controlar adecuadamente estos ensayos, ArCK poblaciones deben ser comparadas con células ciclismo euploides y aneuploides. El primero es paso bajo, tipo RPE-1 hTERT células creciendo exponencialmente. Este último puede obtenerse induciendo mala segregación cromosómica en RPE-1 hTERT y cosechar las células 72 h después de la primera mitosis aberrante. Para ello, siga el protocolo descrito por encima de las células de 1.1 y de la cosecha de paso justo antes del primer tratamiento nocodazole (paso 3.1).
  2. Realizar secuenciación unicelular para evaluar el cariotipo de las células detenidas.
    Nota: La secuencia sola célula es un método bien establecido para determinar los cambios cromosómicos y las cromosómicos a través de una población celular en el nivel unicelular13. Los procedimientos detallados de cómo realizar la secuencia sola célula pueden encontrarse en otra parte10.

Results

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Este método utiliza un sistema de cultivo de tejidos en vitro para aislar células aneuploides con los karyotypes complejos que detención su proliferación. Esta población se conoce como células de ArCK (arrestado con los Karyotypes complejos). Figura 1A se muestra el esquema del experimento. Tipo ciclismo RPE-1 hTERT células son sincronizadas en la frontera de G1/S con timidina y tratadas con un inhibidor de la Mps1 para inducir la mala segregación de cromosomas. El huso veneno nocodazole se agrega a las células 72 h después de la inducción de la mala segregación de cromosomas. 12 h después del tratamiento nocodazole, las células aneuploides que son todavía capaces de proliferar entrar en mitosis y quedan atrapados en esta etapa del ciclo celular debido a la interferencia con la polimerización microtubular. Estas atrapada células entonces se quitan fácilmente por sacudir apagado suave. El proceso de batido es repetidos 3 - 5 veces para asegurar el retiro completo del ciclismo de las células. Figura 1B muestra las imágenes representativas de las células RPE-1 en cada etapa del tratamiento.

ArCK celdas aparece aumento de los niveles de inhibidores del ciclo celular, tales como p53, p21 y p16 en comparación con ploidía y aneuploides ciclismo las células, como se muestra en la figura 2A. Además, la figura 2B muestra β-galactosidasa positiva tinción en células ArCK en comparación con las células del control euploide, un marcador bien establecido para la senescencia celular.

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Figura 2: resultados representativos utilizando células de ArCK. ((A)) Western blot evaluar los niveles de inhibidor del ciclo celular en células de ArCK, aneuploides ciclismo y ploidía. Los niveles de p53, p21 y p16 se determinaron por análisis de western blot. Actinia sirve como un control de carga. (B) β-galactosidasa tinción evaluación del nivel de senescencia de las células de ArCK. Actividad asociada a la senescencia de β-galactosidasa (β-Gal) fue determinada en células euploides y ArCK. Escala de la barra 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esta detención del ciclo celular es una característica prominente de células aneuploides con los karyotypes complejos, como se muestra por el análisis de cariotipo representante de unicelular secuenciación en la figura 3, en el que las células ArCK Mostrar múltiples, pérdidas y ganancias de cromosomas al azar. Este hallazgo está de acuerdo con informes anteriores10.

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Figura 3: Representante secuenciación unicelular de células ArCK. Segmentación parcelas mostrando el karyotype de seis células representativas de ArCK. Segmentación parcelas muestran el número de copia de todos los cromosomas de 1 a X con respecto a una referencia euploide en una escala de2 log (salvaje tipo RPE-1 es una línea celular diploide de origen femenino). Ganancias cromosómicas están resaltadas en rojo, pérdidas del cromosoma en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

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Este novedoso método para generar y enriquecer las células detenidas con los karyotypes complejos (ArCK) permite el estudio de las células que tienen pérdidas o ganancias de cromosomas múltiples y dejan de dividirse. La configuración del método ha sido diseñada para facilitar el aislamiento de células ArCK de una manera rápida y confiable.

El paso más crítico en este ensayo es controlar rigurosamente la línea de tiempo de tratamiento de drogas y, lo más importante, la eliminación de células aneuploides de ciclismo. Para obtener resultados óptimos, el tiempo de tratamiento nocodazole y agitar-off es de particular importancia para garantizar que las células ciclismo se quitan de la placa mientras están todavía redondeado y mitótico, impidiendo la posibilidad de muerte celular mitótica o deslizamiento en G1, creando potencialmente una población tetraploide. No se recomienda que el tiempo de batido se desvía más de dos horas de incubación recomendado nocodazole 12 h.

Estudios futuros sobre ArCK células tienen el potencial para facilitar una comprensión más profunda de cómo karyotypes complejos afectan la fisiología de la célula. En particular, un estudio reciente demostró que las células del sistema inmune son capaces de interactuar con y activación inmune separación de ArCK células10. El método descrito aquí proporciona un excelente punto de partida para la caracterización adicional de las células de ArCK, incluyendo la clarificación de los mecanismos moleculares subyacentes separación inmune en células transformadas y el estudio de la transformación oncogénica cómo puede evitar este mecanismo de vigilancia, una cuestión crucial en el campo14,15.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado en parte por el apoyo del Instituto de Koch (núcleo) 14051 P30-CA de la subvención del Instituto Nacional de cáncer, por los institutos nacionales de salud Grant (CA206157-22 y GM118066) y fondo de investigación de cáncer Curt mármol a Angelika Amon. Angelika Amon es también un investigador del Howard Hughes Medical Institute y el Glenn Foundation para la investigación biomédica. S. S. fue apoyado por el americano italiano cáncer Fundación (AICF), por una beca de investigación del cáncer de acciones Marie Curie y de la Asociación italiana para la investigación de cáncer (AIRC) y por una beca de investigación de cáncer quinquenales de KI. E.M. fue apoyado por una beca de la Howard Hughes Medical Institute.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (Dulbecco' s Águila Modificada Mediana) Thermofisher11995-073
TimidinaSigma AldrichT1859
ReversinaCompañía Química de las Islas Caimán10004412
NocodazolSigmaAldrich M1410
Anticuerpo anti-p53Santa Cruzsc-126
Anticuerpo anti-p21Santa Cruzsc-6246
Anti-p16 anticuerpoBD554079
Senescencia b-Galactosidasa Kit de tinciónde señalización celular 9860
Kit de matriz de citocinas humanas Proteome Profiler R& D SistemasARY005B
Tecnología

References

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