Method Article

Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

DOI:

10.3791/57258

⸱

January 25th, 2018

 , 
1Department of Biology, California State University, Northridge

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una especie de cultivo importante y se ha convertido en un modelo de leguminosas para los estudios de vías genéticas y bioquímicas. Por lo tanto, es importante establecer un sistema de expresión eficaz de genes transitorios en soja. Aquí, Divulgamos un protocolo simple para la preparación de protoplastos de soja y su aplicación para el análisis funcionales transitorios. Hemos encontrado que jóvenes unifolioladas hojas de plántulas de soja resultaron en grandes cantidades de protoplastos de alta calidad. Mediante la optimización de un método de transformación mediada por PEG-calcio, logramos eficiencia alta transformación mediante protoplastos unifolioladas soja. Este sistema proporciona un modelo eficiente y versátil para el examen de mecanismos complejos de regulación y señalización en células de soya vivo y puede ayudar a mejor entender diversos procesos celulares, fisiológicos y de desarrollo de las leguminosas.

Introduction

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Protoplastos son células vegetales que han quitado las paredes celulares. Como sostienen la mayoría de características y actividades de las células vegetales, protoplastos son un buen modelo de sistema para observar y evaluar diversos eventos celulares y son herramientas valiosas para el estudio de hibridación somática1 y2de la regeneración de la planta. Protoplastos han sido también ampliamente utilizados para planta transformación3,4,5, ya que las paredes celulares lo contrario bloquearía el paso de DNA en la célula. Protoplastos poseen algunas de las respuestas fisiológicas y los procesos celulares de las plantas intactas, ofreciendo por lo tanto, valor fundamental en la investigación básica para el estudio de proteína subcelular localización6,7,8, de9,de las interacciones proteína-proteína10y promotor actividad11,12,13 en viven las células.

El aislamiento de protoplastos de plantas primero fue divulgado en 196014 y los protocolos de aislamiento y transformación de protoplastos se han desarrollado y optimizado. Un procedimiento estándar de aislamiento protoplasto implica el corte de hojas y digestión enzimática de las paredes celulares, seguido por separación de protoplastos liberados de restos de tejido no-digerido. Estrategias de transformación incluye electroporación15,16, microinyección17,18y polietilenglicol (PEG)4,5,19 métodos basados. Una amplia gama de especies se han divulgado éxito para el aislamiento del protoplasto, incluyendo cítricos20, Brassica21, Solanaceae22 y otras plantas ornamentales familias23,24. Tipos de tejidos diversos se utilizan en varias especies, un sistema de expresión transitoria en el protoplasto de mesófilo de Arabidopsis (TEAMP) aislado de hojas de la planta modelo Arabidopsis thaliana ha sido bien establecida25 y ampliamente adoptado para diversas aplicaciones.

Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una de las más importantes proteínas y aceite de cultivos de26. A diferencia de Arabidopsis y arroz, obtención de plantas transgénicas de soja se sabe para ser algo difícil y baja eficiencia. Tumefaciens de la agrobacteria-mediada por la infiltración ha sido popularmente utilizada para estudios de expresión transitoria del gen en las células epidérmicas en tabaco27 y plántulas de Arabidopsis28,29, mientras que Agrobacterium rhizogenes ha sido utilizado para la transformación de las raíces pilosas en soja30. Enfoques de silenciamiento génico inducido por virus han sido utilizados para la desregulación de los genes del blanco31,expresión32 y transitorio33 de manera sistémica. Protoplastos proporcionan una alternativa versátil y valiosa a estos enfoques. Protoplastos pueden obtenerse materiales sobre tierra de soja y permiten la expresión del transgen rápida y sincronizada. Sin embargo, desde el éxito inicial aislamiento de protoplastos de soja en el 198334, ha habido informes limitados en el uso de protoplastos en soja35,36,37, 38, principalmente debido a la relativamente baja producción de protoplastos de soja.

Aquí, describimos un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento de protoplastos de soja y su aplicación para estudios de expresión génica transitoria. Utilizando hojas unifolioladas jóvenes de plántulas de soja, hemos sido capaces de obtener grandes cantidades de protoplastos vitales dentro de unas horas. Además, hemos optimizado un método de transformación mediada por PEG-calcio que es simple y de bajo costo para entregar ADN en protoplastos de soja con alta eficiencia.

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Protocol

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1. crecimiento de las plantas

  1. Sembrar semillas de soja de 5-10 (Williams 82) en una maceta de 13 cm en el invernadero bajo condiciones de día largo (16 h de luz en 1.500 μmol m-2 s-1) a 25 ° C en la mezcla de suelo personalizados para soja (el 1: relación 1:1 de arena de tierra, perlita y torpedo).

2. preparación de plásmido ADN

  1. Utilizando una pipeta estéril o palillo de dientes, elige una sola Colonia o stock de glicerol congelados de e.coli con el plásmido que contiene el gen de interés e inocular en medio líquido de 20 mL Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 mL.
  2. Incube el frasco a 37 ° C durante la noche en un agitador. Recoger las bacterias por centrifugación de la suspensión a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos y descartar el sobrenadante. Extraer y purificar el plásmido siguiendo el procedimiento del fabricante de un kit de preparación de plásmido.

3. aislamiento protoplasto

  1. Cortar hojas unifolioladas recientemente ampliadas de plántulas de soja 10 - viejo (figura 1).
    Nota: Selección de hojas en una etapa de desarrollo apropiada es la clave del éxito para la preparación del protoplasto de soja. Utilice únicamente hojas sólo ampliados en las primeras etapas del desarrollo. Las hojas maduras, paredes celulares convertido en más difícil de digerir.
  2. Con una cuchilla de afeitar nueva, retire la nervadura central de las hojas unifolioladas y luego corte los restos en 0.5-1 mm tiras.
    Nota: Dos hojas unifolioladas digeridos en 10 mL de solución de enzima dará suficientes protoplastos para transformaciones más de 10.
  3. Con un par de pinzas, transferencia de la hoja las tiras inmediatamente y con cuidado en 10 mL de solución recién preparada de la enzima (tabla 1) en un tubo de 15 mL. Vacío infiltra la hoja tiras durante 15 min a temperatura ambiente.
  4. Incube las tiras de la hoja en la solución de enzima con agitación suave (40 rpm) bajo condiciones de poca luz para 4-6 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución de enzima convierte amarillo-verde protoplastos son liberados. Comprobar la solución de enzima/protoplastos bajo el microscopio (X10).
    Nota: El lanzado protoplastos son esféricos formado, mientras que las células sin digerir tienen forma oval o irregular.
  5. Transferir 10 mL de solución en un tubo de 50 mL de enzima/protoplasto vertiendo suavemente y añadir 10 mL de solución de W5 (tabla 1) a temperatura ambiente para detener la digestión. Invierta suavemente el tubo varias veces. Vierta suavemente la solución de enzima/protoplastos en una malla de nylon limpio 75 μm colocada encima de un tubo de 50 mL para remover los tejidos de la hoja sin digerir.
  6. Centrifugue la solución a través de flujo de enzima/protoplastos a 100 x g en el tubo de 50 mL durante 1-2 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL sin perturbar el pellet de protoplasto.
  7. Suspender los protoplastos y diluir a una concentración de 2 x 105 mL-1 en la solución de W5 refrigerada a 4 ° C por conteo de protoplasto en un hemacitómetro bajo el microscopio (x10). Mantenga los protoplastos en el hielo durante 30 minutos.
  8. Centrifugar la suspensión a 100 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente y suavemente Retire la solución de W5 con una pipeta de 1 mL sin perturbar el pellet de protoplasto. Resuspender los protoplastos en la solución MMG (tabla 1) en una concentración de 2 x 105 mL-1 a temperatura ambiente.

4. transformación de protoplasto

  1. Hacer 100 alícuotas de μl de protoplastos (2 x 104 protoplastos en 2 x 105 mL-1) en tubos de microcentrífuga de adherencia baja 1,5 mL utilizando sin cortar puntas de la pipeta de 200 μl. Poner una alícuota a un lado para servir como control negativo. Añadir 10 μl del plásmido (10-20 μg) en cada uno de la alícuota del resto de protoplastos.
  2. Lentamente agregar 110 μl de solución recién preparada de PEG (tabla 1) en la pared interna del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y luego invierta suavemente y gire el tubo hasta que la solución sea homogénea.
  3. Incubar la mezcla de transformación a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  4. Para detener la transformación, poco a poco añadir 400 μL de solución de W5 con el tubo de 1,5 mL a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo hasta que la solución sea homogénea. Centrifugar el tubo a 100 g durante 1-2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante con una pipeta.
  5. Añadir 1 mL de solución de WI (tabla 1) en el tubo y resuspender mediante pipeteo suave 1 - 2 veces. Añadir 1 mL de suero de ternera estéril (vol/vol) de 5% en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 6 a capa de la superficie y evitar que los protoplastos se adhiera a la placa.
  6. Después de unos segundos, desechar el suero con una pipeta. Transferencia de los protoplastos resuspendidos en un pocillo de la placa de cultivo. Cubra la placa con una tapa.

5. protoplasto incubación y cosecha

  1. Incubar los protoplastos a temperatura ambiente durante 1-2 días en la oscuridad.
    Nota: Hemos encontrado que dos días de incubación produce una señal más fuerte de la proteína fluorescente en general comparada con un día incubación, y que la señal de la proteína fluorescente puede durar hasta 3-4 días.
  2. Transferir la solución del protoplasto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja de la adherencia. Centrifugar el tubo a 100 x g por 1-2 min a temperatura ambiente para cosechar protoplastos. Quite el sobrenadante con una pipeta y transferir 10 protoplastos μl sobre un portaobjetos de vidrio.
  3. Observar la señal fluorescente bajo fluorescencia o microscopía confocal. Uso no transforman protoplastos como control negativo (no hay señal debe observarse).

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Results

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Diferentes órganos de soja 10 - viejo fueron probados para la preparación del protoplasto (figura 1) y rendimientos fueron observados bajo el microscopio (figura 2). Las paredes celulares de hipocótilo y epicotyl apenas fueron digeridas, y algunas células se quedaron conectadas entre sí (figura 2B, 2C). En el cotiledón (Figura 2D) y raíz (

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Discussion

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Este protocolo para el aislamiento de protoplastos de soja y la aplicación a los estudios de expresión transitoria ha sido completamente probado y funciona muy bien en nuestro laboratorio. Los procedimientos son simples y fáciles y requieren equipo ordinario y mínimo coste. Nuestro protocolo produce grandes cantidades de protoplastos de uniforme y de alta calidad en comparación con métodos previamente divulgados34,35,36,

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Disclosures

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de genoma de planta de la National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Celulasa CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pectoliasa Y-23BioWorld9033-35-6
CELULASA "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
ManitolICN Biomédica152540
CaCl2FisherC79-500g
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
malla de nyloncarolina652222N
de cultivo de tejidos USAScientificCC7682-7506
Hojas de afeitarFisher12-640
hemacitómetrohausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27104
Kit de minipreparación de plásmidos EZNAOmegaD6942-01
Kit de minipreparación de plásmidos GeneJETCentrífuga Thermo ScientificK0502
5810 Centrífuga5811000827Eppendorf
5424Eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Controlador de pipetasJencons14526-202
Microscopio confocal Zeiss 710ZeissN/A
Tubos de microfuga antiadherentes, sin RNasa, 1,5 mLAmbionAM12450
15 mL DenvilleC1018-P
Tubos de centrífuga de 50 mLDenvilleC1060-P
Serum para terneros recién nacidosThermo Scientific
SoilVivero de Ingram
perlitaVigoro100521091
Torpedo ArenaJKS Ventures
LB Caldo, Lennox (Polvo)FisherBP1427-500
BSA NEB R3535S placas Tubos de centrífuga 16010159

References

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