Se describe un método para investigar la capacidad de células de la planta de cultivo de punta, incluyendo tubos de polen, pelos de la raíz y musgo protonemata, para alargar a través de espacios estrechos (~ 1 μm) en un dispositivo de microfluidos.
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Artículo de método
Desarrollo de dispositivos microfluídicos para estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en espacios extremadamente pequeños
En este artículo
Resumen
Resumen
In vivo, células de la planta creciendo de punta necesitan superar una serie de barreras físicas; sin embargo, los investigadores carecen de la metodología para visualizar el comportamiento celular en esas condiciones restrictivas. Para solucionar este problema, hemos desarrollado cámaras de crecimiento de la punta de crecimiento de células de vegetales que contienen una serie de brechas estrechas, fabricado de micro (~ 1 μm) en un sustrato de poly-dimethylsiloxane (PDMS). Este material transparente permite al usuario monitorizar procesos de alargamiento de punta en celdas individuales durante la penetración de microespacios por proyección de imagen de Time-lapse. Usando esta plataforma experimental, observamos cambios morfológicos en los tubos de polen como penetraron los microespacios. Capturamos los cambios dinámicos en la forma de un núcleo vegetativo fluorescencia etiquetada y espermatozoides en un tubo de polen durante este proceso. Además, hemos demostrado la capacidad de pelos radicales y musgo protonemata para penetrar el espacio μm 1. Esta plataforma en vitro puede utilizarse para estudiar cómo individuales las células responden a espacios físicamente limitados y puede proporcionar penetraciones en los mecanismos de crecimiento de la punta.
Introducción
Después de los granos de polen germinan en un estigma, cada grano produce un solo tubo de polen que transporta espermatozoides el óvulo y la célula central en el óvulo para la fertilización doble. Tubos de polen alargado a través del estilo y eventualmente alcanzar el óvulo detectando múltiples señales de orientación a lo largo de la manera1. Durante la elongación, tubos de polen se encuentran una serie de barreras físicas; la pista que está llena de células y tubos de polen debe entrar en el minuto abertura micropilar del óvulo para llegar a su destino (figura 1A)2. Por lo tanto, tubos de p....
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Protocolo
1. fabricación de la Microdevice PDMS para examinar el crecimiento tubos de polen y musgo Protonemata
Nota: Se utilizó un instrumento Fotolitografía maskless para preparar moldes PDMS en obleas de silicio. Los detalles sobre el funcionamiento del sistema se omiten en este manuscrito. Una técnica de fotolitografía estándar9 usando un photomask puede usarse para crear los moldes PDMS se describe en este manuscrito.
- Vierta 11 g de mezcla de los polímero PDMS (elastómero base: curado agente a una relación de 10:1) en cada molde de 4 pulgadas.
- Desgasificar el molde preparado en el paso 1.1 durante 20 m....
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Resultados
Como se ilustra en la figura 1, las células vegetales creciendo de punta encuentran una serie de barreras físicas a lo largo de sus trayectorias de crecimiento in vivo. Microfluídicos en vitro de la célula cultura plataformas presentadas en este estudio permitió la examinación el cultivo de punta de procesos en tres tipos de células de la planta (tubos de polen, pelos de la raíz y musgo protonemata) a través de las lagunas artificiales de 1 .......
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Discusión
Varios pasos críticos en el protocolo deben seguirse exactamente para obtener los resultados presentados arriba. En primer lugar, el PDMS vidrio y capa inferior plato las superficies deben ambos ser tratadas con plasma una suficiente cantidad de tiempo antes de la adhesión. De lo contrario, la capa PDMS localmente puede separarlo de la superficie de cristal mientras que la punta de crecimiento de las células atraviesan el microgaps. Otro paso crucial en el protocolo de pelos y musgo protonemata es la esterilización de lo.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Agradecemos a H. Tsutsui y D. Kurihara por facilitarnos las plantas transgénicas, como el T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato y la línea de a. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectivamente. Este trabajo fue financiado por el Instituto de transformación biomoléculas de la Universidad de Nagoya y la red de la ciencia de planta avanzada de Japón. Apoyo financiero para este trabajo fue proporcionada por subvenciones de la Agencia de tecnología y ciencia de Japón (no de la concesión del proyecto de ERATO. JPMJER1004 para T.H.), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (Nos. JP16H06465 y JP16H06464 para T.H.) y la sociedad japones....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog | Medium Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sacarosa | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| Plato con fondo de vidrio de 50 mm | Matsunami Glass D210402 | ||
| Plato con fondo de vidrio de 35 mm | Iwaki | 3971-035 | |
| Cuchilla quirúrgica | Feather | No.11 | |
| punzones de biopsia Harris | Uni-Core | ||
| Gel puntas | de carga Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Microscopio invertido | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No hay número de catálogo disponible para este microscopio personalizado | |
| Software de imagen MetaMorph | Molecular Devices |
Referencias
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).....
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Reimpresiones y permisos
