Se describe un protocolo de cirugía estereotáctica con un dispositivo casero hecho de cabeza fija de reactivos microinjecting en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Esta técnica permite la manipulación genética en las células neuronales de regiones específicas del cerebro de ratón neonatal.
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Artículo de método
Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal
En este artículo
Resumen
Resumen
Muchos genes se expresan en el cerebro embrionario y algunos de ellos se expresan continuamente en el cerebro después del nacimiento. Para tales genes persistentemente expresadas, pueden funcionan para regular el proceso de desarrollo o función fisiológica en el cerebro neonatal. Para investigar las funciones neurobiológicas de genes específicos en el cerebro, es esencial para desactivar genes en el cerebro. Aquí, describimos un método simple de estereotáctica para inactivar genes en el cuerpo estriado de los ratones transgénicos en ventanas de tiempo neonatal. AAV-eGFP-Cre virus fueron microinyectados en el estriado de los ratones de gen reportero Ai14 en día postnatal (P) 2 de cirugía estereotáctica cerebral. La expresión del gen reportero tdTomato fue detectada en P14 estriado, sugiriendo un éxito Cre-loxP mediada por recombinación de ADN en las células AAV-transduced estriada. Más validamos esta técnica por microinjecting virus AAV-eGFP-Cre en ratones P2Foxp2fl/fl . Etiquetado doble de GFP y Foxp2 demostró que las células GFP-positivas carecían de Foxp2 immunoreactivity en P9 estriado, lo que sugiere la pérdida de la proteína Foxp2 en AAV-eGFP-Cre transduced estriado células. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran una canceladura genética efectiva por los virus de AAV-eGFP-Cre stereotaxically microinyectados en poblaciones neuronales específicas en el cerebro neonatal de ratones transgénicos floxed. En conclusión, nuestra técnica estereotáctica proporciona una plataforma fácil y simple para la manipulación genética en el cerebro de ratón neonatal. La técnica no sólo permite eliminar genes en regiones específicas del cerebro neonatal, pero también puede ser utilizado para inyectar drogas farmacológicas, trazadores neuronales, optogenetics genéticamente modificados y chemogenetics proteínas, indicadores de la actividad neuronal y otros reactivos en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal.
Introducción
Los estudios modernos de la estructura y función del cerebro requieren manipulación genética de genes específicos en células neuronales. Para probar las funciones de diferentes genes, ratones transgénicos con alelos del mutante, incluyendo nocaut y knock-in alelos se han generado habitualmente. Neurocirugía estereotáctica para roedores adultos es un método estándar para entregar localmente los medicamentos, virus, marcadores y otros reactivos a regiones específicas del cerebro de roedores1,2. Aplicación de la cirugía estereotáctica cerebral en ratones transgénicos permite manipular genéticamente las funciones ....
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Protocolo
Los protocolos animal aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso comités Universidad Nacional de Yang Ming.
1. preparación del titular de los cachorros neonatales en el aparato estereotáctica
- Hacer la bandeja principal: cortar la parte inferior de un tubo de centrífuga de 1.5 mL (15 mm de largo) en la forma que se adapta a la cabeza de los cachorros neonatales quitando 1/5 de la pared del tubo.
- Tomar una caja de punta de pipeta con el tamaño correcto que encaja con el pedestal del aparato estereotáxicas y quite la cubierta superior. Pegue la cabeza bandeja preparada en el paso 1.1 y un cassette inclusi....
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Resultados
Para el primer conjunto del experimento, nos microinyectados 200 nL de AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, dilución 1/10 en tampón fosfato salino de Dulbecco) que expresan el recombinase de Cre DNA fundido con GFP en P2 estriado de los ratones Ai14. Los ratones Ai14 expresan el gen reportero de tdTomato sobre eliminación Cre-mediada del loxP flanqueado (floxed) cassette STOP (figura 2F). Los cerebros fueron cosechados en P14 de immunosta.......
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Discusión
En el presente estudio, se demuestra un método simple y confiable estereotáctica para inyectar virus AAV en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Microinyectados virus AAV-eGFP-Cre en el estriado de los ratones de reportero Ai14 en P2 y luego analiza la expresión del gen reportero en P14. Encontramos que AAV transduced células GFP-positivas en el cuerpo estriado a nivel rostrocaudal. Por otra parte, casi todas las células GFP-positivas Co expresan el gen reportero tdTomato en células estriatales, lo que sugie.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología concede MOST104-2311-B-010-010-MY3, conceder MOST106-2321-B-010-012, los institutos nacionales de investigación de salud INDH-EX106-10429NI y las áreas de investigación centro Programa Beca de el Ministerio de educación a través del centro de investigación del cerebro, Universidad Nacional de Yang Ming en Taiwán, y Beca Postdoctoral becas MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.) y MOST105-2811-B-010-036 MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aguja PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Cloroformo | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton Jeringa MICROLITER | Hamilton | 80300 | Aguja de 30G apta para tubo de PE10; La aguja de 26G necesita un adaptador de PE20 |
| Tubo de polietileno PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Tubo de polietileno PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Bomba de jeringa de micro caudal | Bomba de precisión más larga Co. | TJ-2A (controlador) y L0107-2A (unidad de accionamiento) | |
| Jeringa 25G | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Instrumentos estereotáxicos estándar | RWD Life Science | 68037 | Sin usar 68030 Adaptador de ratón/rata neonatal |
| Anticuerpo anti-FOXP2 | Abcam | ab16046 | Conejo policlonal a FOXP2, 1:4.000 |
| Anticuerpo anti-RFP | Abcam | ab65856 | Monoclonal de ratón a RFP, microscopio 1:1.000 |
| BX63 Microscopio | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Cabra anti-conejo conjugado Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lote # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Instituto de Ciencias Biomédicas, Academia Sinica, Taiwán | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Hze/J | El Laboratorio de Jackson | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | El Laboratorio de Jackson | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato | Corning CellGro | 21-030-CVR |
Referencias
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1
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Reimpresiones y permisos
