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Artículo de método

Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis

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DOI:

10.3791/57279

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3 de abril de 2018

 ,  ,  , 
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para obtener el lípido gotitas índice (LD) para estudiar la dinámica de triacilgliceroles en las células cultivadas en experimentos de alto rendimiento. El ensayo de índice de LD es un método sencillo y fiable que utiliza BODIPY 493/503. Este ensayo no es necesario dispendious extracción o análisis de la microscopia.

Resumen

El artículo muestra cómo implementar el ensayo de índice de LD, que es un ensayo de microplacas sensible para determinar la acumulación de triacilgliceroles (etiquetas) en gotitas del lípido (LDs). Índice de LD se obtiene sin extracción. Permite medir el contenido de LDs en experimentos de alto rendimiento bajo diferentes condiciones tales como crecimiento en ricos o media de nitrógeno agotado. Aunque el método fue descrito por primera vez estudiar el metabolismo de la gota de lípido en Saccharomyces cerevisiae, fue aplicado con éxito a los basidiomicetos Ustilago maydis. Curiosamente, y debido a LDs son organelos filogenéticamente conservados en las células eucariotas, el método puede aplicarse a una gran variedad de células, de levadura para células de mamífero. El índice de LD se basa en el ensayo de recuperación de líquido de la fluorescencia (LFR) de BODIPY 493/503 bajo condiciones de amortiguamiento, mediante la adición de células fijadas con formaldehído. Yodo de potasio se utiliza como un extintor de la fluorescencia. La relación entre la fluorescencia y las laderas de la densidad óptica se denomina índice de LD. Pendientes se calculan a partir de las líneas rectas que se obtienen cuando BODIPY fluorescencia y densidad óptica a 600 nm (OD600) se grafican contra la adición de la muestra. Datos óptima calidad se refleja por coeficientes de correlación igual o superior a 0,9 (r ≥ 0.9). Muestras múltiples se pueden leer al mismo tiempo como se puede implementar en una microplaca. Desde BODIPY 493/503 es un lipofílico fluorescente tinte particiones en las gotitas de lípidos, puede ser utilizado en muchos tipos de células que se acumulan de LDs.

Introducción

Gotitas del lípido (LDs) son cuerpos de grasa intracelulares ubicuos compuesto por un núcleo de lípidos neutros, principalmente etiquetas y ésteres de esterol (SE). El núcleo está rodeado por una monocapa de fosfolípidos que interactúa con las proteínas como enzimas implicadas en la síntesis de lípidos neutros, como el diacilglicerol acil-transferasa, carboxylase del acetilo-CoA y acil-CoA sintasa1perilipin. Debido a su comportamiento dinámico, la monocapa de fosfolípidos también contiene triacilglicerol lipasas que hidrolizan etiquetas y SE2. Dependiendo del tipo de célula y organismo, almacenados lípidos neutros pueden utilizarse para generar energía y sintetizan fosfolípidos y moléculas de señalización. En levaduras y otros hongos, el contenido de LDs cambia en respuesta a variaciones en la relación nitrógeno/carbono en los medios de cultivo, lo que indica que la disponibilidad de nitrógeno disminuida podría ser la clave para aumentar la producción de lípidos neutros3,4 ,5. La producción de grandes cantidades de etiquetas en la levadura tiene un uso potencial en la biotecnología como fuente de biocombustibles y en la industria alimentaria. Algunos lípidos almacenados contienen altas proporciones de ácidos grasos poli-insaturados, como omega 3 y omega 6, con importancia nutricional y dietética 6,7,8,9,10 , 11. LDs de células de mamíferos, incluyendo células humanas, también contienen etiquetas y ésteres de colesterol. La monocapa de fosfolípidos interacciona con los mamíferos homólogos de las proteínas se describe en la levadura Sud y con una proteína adicional, perilipin, que está ausente en S. cerevisiae12. Uno propuso el papel de la monocapa de fosfolípidos y las proteínas asociadas es estabilizar la estructura del LDs y permitir la interacción de LDs con organelos como mitocondrias, retículo endoplasmático, peroxisomas y vacuolas, principalmente para el intercambio de lípidos 13,14. Curiosamente, en los seres humanos, LDs parecen intervenir en patologías como diabetes tipo 2, ateroesclerosis, esteatohepatitis, enfermedad coronaria, en el cual hay un aumento en su número 15,16,17 . Algunos tipos de virus utilizan LDs como plataformas para ensamblar los viriones 2,18,19.

Debido a las implicaciones de la Sud en patologías humanas y su potencial uso biotecnológico, la exacta determinación experimental de formación mormona es una tarea importante. Este artículo describe un ensayo confiable basado en la recuperación de la fluorescencia (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 1-difluoro-4, 3, 5, 7, 8-r:-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), para obtener un valor relativo del contenido de lípidos neutros en las células. Con este análisis, es posible seguir la dinámica de la acumulación de lípidos neutros en hongos como U. maydis y S. cerevisiaey también en células de mamífero, sin necesidad de extracción de lípidos 20. El método fue aplicado por primera vez en S. cerevisiae para identificar las proteína fosfatasas y quinasas implicadas en la regulación del metabolismo de los lípidos. Esto fue posible sin la extracción o purificación de la proteína21,22. LFR también se ha utilizado para establecer la dinámica de formación de LDs en macrófagos peritoneales23. El uso de BODIPY 493/503 tiene algunas ventajas sobre otros tintes de lípido neutral como Nilo rojo. BODIPY 493/503 es altamente específico de lípidos neutros y tiene un espectro de emisión estrecho, facilitando la detección simultánea de señales de tintes como proteína fluorescente roja o Mito-tracker, cuando las muestras son analizadas por microscopia confocal. Por desgracia, BODIPY 493/503 es sensible al fotoblanqueo, pero este proceso puede evitarse mediante el uso de un reactivo de antiquenching durante la exposición a luz24.

Para llevar a cabo el ensayo LFR en células de levadura, son cultivadas en las condiciones nutricionales deseadas y alícuotas son retiradas en diferentes momentos. A continuación, las células son fijadas con formaldehído, que preserva la integridad de LDs para meses cuando las células son almacenadas a 4 ° C. Otras técnicas de fijación deben evitarse, sobretodo las de metanol o acetona frío, puesto que conducen a la degradación de mormones dentro de las células24. Para medir el índice de LD, formaldehído-fija las células se suspenden en agua para obtener una concentración definida. Luego, se añaden a una solución que contiene el fluoróforo BODIPY 493/503 apagada por KI, y cuando el fluoróforo entra en la célula y se asocia con la mormona, hay una recuperación de su fluorescencia. Concomitante a la medida de la fluorescencia (485 nm/510 nm), la concentración de células se cuantifica midiendo la densidad óptica a 600 nm. Cada muestra se lee cuatro veces añadiendo subsecuentes partes alícuotas de 5 μl de una suspensión celular de formaldehído-fija al mismo bien. Espacios en blanco de fluorescencia y absorbancia son adquiridos antes de la adición de las células. La calidad de los datos de absorbancia y la fluorescencia son evaluados mediante la determinación de la linealidad de las mediciones: si r < 0.9, los datos se descartan. El valor de r es importante porque básicamente la intensidad de la fluorescencia debe producir una respuesta lineal a las concentraciones de células cada vez mayor. Si la concentración de células es demasiado alta, la linealidad se pierde. El ensayo LFR proporciona un método rápido, sencillo y económico para seleccionar el fenotipo deseado de LD en experimentos de alto rendimiento. Después de seleccionar las condiciones deseadas, el contenido de LD de células individuales puede ser estudiado mediante microscopía confocal, usando el mismo formaldehído-fija las células teñidas con BODIPY, proporcionando una imagen de LDs en la célula. Sus etiquetas y el contenido SE pueden ahora más analizadas por cromatografía en capa fina.

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Protocolo

1. preparación de Buffers y soluciones

  1. Para preparar 1 L de fosfato tampón salino (PBS, pH 7), disolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 en 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con ácido clorhídrico y luego añadir agua para un volumen final de 1 L. PBS puede ser hecho como un 10 x solución y almacenado a temperatura ambiente.
  2. Para preparar 10 mL de solución de fijación, añadir 1 mL de formaldehído al 37% para 9 mL de PBS para alcanzar una concentración final de 3,7%. Preparar esta solución antes de usar.
    PRECAUCIÓN: Use guantes para manejar la solución de formaldehído.
  3. Para preparar la solución de amortiguamiento (500 mM), disolver 8,3 g de KI en 100 mL de agua destilada. Preparar esta solución antes de usar y almacenar a temperatura ambiente.
  4. Para preparar la solución madre de BODIPY 10 mM, disolver 10 mg de BODIPY 493/503 en 3,8 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Guardar alícuotas μl 100 en la oscuridad a-70 ° C.
  5. Para preparar la solución de enfriamiento μm 5 BODIPY, añadir 1 μl de 10 mM BODIPY 493/503-2 mL de 500 mM apaga solución. Para el análisis LFR, se requiere una concentración final de 5 μm de BODIPY.
  6. Para preparar la solución mineral, Añadir 0,06 g de H3BO3, 0,14 g de MnCl2-4 H2O, 0,4 g de vivencias20,04 g de Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g de FECLAS3-6 H2O y 0,4 g de CuSO 4-5 H2O a 1 L de agua destilada.
  7. Para preparar la solución de sal, añadir 16 g de KH2PO4, 4 g de Na2para que4, 8 g de KCl, 2 g de MgSO4, 1 g de CaCl2y 8 mL de solución mineral 1 L de agua destilación.
  8. Para preparar el medio mínimo sin una fuente de nitrógeno para U. maydis FB2 (a2b2), añadir 10 g de glucosa y 62,5 mL de solución de sal a 1 L de agua destilada, según Holliday, et al. 31. ajustar el pH a 7.0 y luego distribuir 100 mL del medio en frascos de 250 mL y esterilizarlas. Esterilizar autoclave durante 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) en el ciclo líquido o filtro.
  9. Para preparar la levadura peptona dextrosa medio (YPD), añadir 5 g de levadura extracto, 2,5 g de peptona, y 5 g de glucosa a 1 L de agua destilada. Distribuir 100 mL de la solución en frascos de 250 mL y esterilizarlas. Esterilizar autoclave durante 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) en el ciclo líquido o filtro.

2. estado y fijación de la célula de la cultura

Nota: Conservar la estructura del LDs mediante la fijación de las células tan pronto como sea posible. La fijación puede realizarse en tubos de microcentrífuga. Las células fijas pueden conservarse a 4 ° C hasta un mes si la deshidratación se evita dejando una fina capa de agua.

  1. Cultivar células de U. maydis bajo condiciones de cultivo relevantes para el estudio. Inicio la cultura con un OD inicial600 de 0.05 (1,15 x 106 células / mL). Incube las células a 28 ° C, 180 rpm por 24 h. Un OD600 de 1 corresponde a 2,3 × 107 células / mL.
  2. En el seleccionado veces, retirar una parte alícuota de las células. De U. maydis, retirar 5 mL cada 2 h durante las primeras 8 h. Después de 8 h de crecimiento, alícuotas de 2 mL son suficientes.
  3. Medir la densidad óptica a 600 nm de cada alícuota.
  4. Centrifugue la suspensión de células a 14.000 x g durante 1 min a 4 ° C utilizando una centrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante.
  5. Suspender el sedimento de las células en 1 mL de tampón de PBS-formaldehído 3,7%. Incube las células durante 15 min a temperatura ambiente.
  6. Después de la incubación, Centrifugue la suspensión de células a 14.000 x g durante 1 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
  7. Lavar el pellet de células dos veces con un volumen similar de agua destilada (1 mL). Centrifugue la suspensión de células a 14.000 x g durante 1 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante después de cada paso de lavado.
  8. Ajustar el precipitado de células 5 OD600 (1,15 x 108 células / mL) con agua destilada agua (ecuación 1).
    figure-protocol-1    Ecuación 1.
  9. Mantener la muestra a 4 ° C hasta su uso.

3. ensayo de recuperación de fluorescencia líquida (LFR)

  1. Encender el espectrofotómetro y abra el software de Skanlt. Haga clic en nueva sesióny seleccione Inicio y, a continuación Varioskan Lux. Seleccione el Protocolo en el árbol de sesión, introduzca los valores para las longitudes de onda de fluorescencia (excitación 485 nm/emisión de 510 nm; densidad óptica 600 nm) y elija ganancia del fotomultiplicador automático. Para ancho de banda de excitación, seleccione 12 nm. En la óptica, seleccione parte superior (excitación de la muestra es de la parte superior del pozo).
  2. Entrar en una agitación suave y continua (300 rpm). Seleccione Ejecutar placay Pausa hasta que la acción del usuario (tiempo utilizado para la adición de la muestra en los pocillos). Repita el protocolo cinco veces. Haga clic en Guardar , escriba un nombre para la sesión en el Campo de nombre de sesión. El protocolo está listo para el análisis de las muestras.
  3. Añadir 200 μL del μm 5 BODIPY - apagó la solución en cada pocillo de una placa de 96 fondo bien negro claro.
  4. Coloque la placa dentro del compartimiento del espectrofotómetro e incubar 5 min a 30 ° C. Desde este punto, proteja la placa de la luz tanto como sea posible.
  5. Haga clic en el botón Inicio y leer la fluorescencia (excitación 485/emisión de 510) y el de OD600 correspondiente a los espacios en blanco.
  6. Añadir 5 μl de la suspensión celular de formaldehído-fija a los pozos durante el tiempo de pausa. Mezclar cuidadosamente las muestras con la pipeta. Poner la placa dentro del espectrofotómetro y haga clic en continuar. Luego, las muestras se procesarán según el protocolo diseñado por encima.
  7. Repetir tres adiciones sucesivas de 5 μl de la suspensión celular. Asegúrese de que las células no precipitan. (Figura 1).

4. cálculo del índice de LD

  1. Para cada muestra en la microplaca, trazar un gráfico de fluorescencia y absorbancia contra el volumen de cada adición sucesiva (5 puntos incluyendo el espacio en blanco). En este estudio, utilizar software de Microsoft Excel para los cálculos. Trama de los datos, ingrese el volumen, la fluorescencia y datos de absorbancia en la primera, segunda y tercera columna de la hoja de datos, respectivamente. A continuación, seleccione los datos enteros con el cursor, haga clic en Insertar y seleccione dispersión (XY).
  2. Seleccione los puntos de cada línea en la gráfica e inserte la respectiva Línea de tendencia con el cuadro Mostrar ecuación seleccionado. Anote los valores de las pendientes de dos rectas, según la ecuación 2:
    figure-protocol-2    Ecuación 2
    Donde y = fluorescencia o densidad óptica, x = volumen de muestra (0, 5, 10, 15, 20 μl), m = pendiente de la fluorescencia o la línea de densidad óptica y la b = intersección.
  3. Dividir la pendiente de la línea de fluorescencia por la pendiente de la línea de la densidad óptica para obtener el índice de LD, la ecuación 3.
    figure-protocol-3    Ecuación 3
    Pistas de densidad óptica y el índice de LD corresponde al cociente de la fluorescencia.

5. Análisis de calidad de datos

  1. Calcular el coeficiente de correlación de cada recta: haga clic en el Asistente para la función (fx) y elija Coef.de. Si r < 0.9, descartar los datos y repetir las lecturas. Si r ≥ 0.9, las lecturas es confiable.

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Resultados

LFR, con BODIPY 493/503 como la punta de prueba fluorescente es un método fácil y confiable para estudiar la acumulación dinámica de LDs en U. maydis, independientemente de las condiciones de crecimiento. Cuando las células fueron cultivadas en medio YPD, hubo un aumento en el índice de LD durante la fase exponencial, seguido por un descenso en la fase estacionaria (figura 2A). En cambio, en las células cultivadas bajo hambre de nitrógeno, hubo un au...

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Discusión

LFR es un novedoso método que se aplicó por primera vez estudiar el metabolismo de los lípidos en S. cerevisiae y más tarde fue exitosamente implementado en U. maydis20,21. Aunque el índice de LD no da un valor absoluto de las etiquetas que se acumula en las células, proporciona una idea rápida del contenido en lípidos de las células, y la interpretación de los datos es sencilla cuando se comparan el índice de LD de dos o más condiciones experim...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada a la divulgación

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas de Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (SIP-IPN-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM) y Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP y 256520 GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ Cientistas Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Nosotros gracias a la QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo para el Resumen esquemático. Agradecemos la valiosa ayuda de la microscopía confocal de LDs Dr. Miguel Tapia Rodríguez. Deseamos agradecer a Dr. Bruno Bozaquel Morais por su trabajo pionero en el desarrollo de la técnica en S. cerevisiae que adaptamos para U. maydis.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
EspectrofotómetroVarioskan Lux microplaca multimodo readeD5879Filtro 493/503 o detector monocromador
Placa costarCorning Inc.361596 pocillos, de pared negra/fondo transparente
Placa costarCorning Inc3598Placa de cultivo celular de 96 pocillos, costar
BODIPY 493/503Invitrogen/ ThermofisherD39224,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno
Solución de formaldehídoSigma Aldrich252549reactivo ACS, 37 % en peso en H2O, contiene 10-15% de metanol para evitar la polimerización
Yoduro de potasioSigma Aldrich60399BioUltra, ≥ 99,5% (AT)
FB2 Ustilago maydisATCC 201384Levadura de basidiomiceto
Cloruro de sodioSigma Aldrich746398reactivo ACS, sal inorgánica
Fosfato de potasio monobásicoSigma AldrichP0662Reactivo ACS
Seleccionar extracto de levaduraSigma AldrichY100Mezcla de aminoácidos, péptidos, solubles en agua, vitaminas y carbohidratos para medios de cultivo
N-Z case plusSigma aldrichN4642Hidrolizado enzimático de caseína de leche bovina
GlucosaSigma AldrichG-8270D (+) glucosa
Matraz SkakerPirexCLS4450250-6EAVidrio de borosiicato
ShakerSEV Mé xicoINO650V-7Agitador orbital
Mesa centrífugaEppendorf5415CCentrífuga
Microtubos SigmaAldrichZ606340Eppendorf Puntas
pipetaAxygen scientificT-200-YPuntas de pipeta universales con extremo biselado, 200 microlitros, no estéril
pipeta mLineBiohit7251308 canales, rango de volumen 5-100 uL
de

Referencias

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