Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para obtener el lípido gotitas índice (LD) para estudiar la dinámica de triacilgliceroles en las células cultivadas en experimentos de alto rendimiento. El ensayo de índice de LD es un método sencillo y fiable que utiliza BODIPY 493/503. Este ensayo no es necesario dispendious extracción o análisis de la microscopia.

Resumen

El artículo muestra cómo implementar el ensayo de índice de LD, que es un ensayo de microplacas sensible para determinar la acumulación de triacilgliceroles (etiquetas) en gotitas del lípido (LDs). Índice de LD se obtiene sin extracción. Permite medir el contenido de LDs en experimentos de alto rendimiento bajo diferentes condiciones tales como crecimiento en ricos o media de nitrógeno agotado. Aunque el método fue descrito por primera vez estudiar el metabolismo de la gota de lípido en Saccharomyces cerevisiae, fue aplicado con éxito a los basidiomicetos Ustilago maydis. Curiosamente, y debido a LDs son organelos filogenéticamente conservados en las células eucariotas, el método puede aplicarse a una gran variedad de células, de levadura para células de mamífero. El índice de LD se basa en el ensayo de recuperación de líquido de la fluorescencia (LFR) de BODIPY 493/503 bajo condiciones de amortiguamiento, mediante la adición de células fijadas con formaldehído_. Yodo de potasio se utiliza como un extintor de la fluorescencia. La relación entre la fluorescencia y las laderas de la densidad óptica se denomina índice de LD. Pendientes se calculan a partir de las líneas rectas que se obtienen cuando BODIPY fluorescencia y densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) se grafican contra la adición de la muestra. Datos óptima calidad se refleja por coeficientes de correlación igual o superior a 0,9 (r ≥ 0.9). Muestras múltiples se pueden leer al mismo tiempo como se puede implementar en una microplaca. Desde BODIPY 493/503 es un lipofílico fluorescente tinte particiones en las gotitas de lípidos, puede ser utilizado en muchos tipos de células que se acumulan de LDs.

Introducción

Gotitas del lípido (LDs) son cuerpos de grasa intracelulares ubicuos compuesto por un núcleo de lípidos neutros, principalmente etiquetas y ésteres de esterol (SE). El núcleo está rodeado por una monocapa de fosfolípidos que interactúa con las proteínas como enzimas implicadas en la síntesis de lípidos neutros, como el diacilglicerol acil-transferasa, carboxylase del acetilo-CoA y acil-CoA sintasa¹perilipin. Debido a su comportamiento dinámico, la monocapa de fosfolípidos también contiene triacilglicerol lipasas que hidrolizan etiquetas y SE². Dependiendo del tipo de célula y organismo, almacenados lípidos neutros pueden....

Protocolo

1. preparación de Buffers y soluciones

1. Para preparar 1 L de fosfato tampón salino (PBS, pH 7), disolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄, 0,24 g de KH₂PO₄ en 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con ácido clorhídrico y luego añadir agua para un volumen final de 1 L. PBS puede ser hecho como un 10 x solución y almacenado a temperatura ambiente.
2. Para preparar 10 mL de solución de fijación, añadir 1 mL de formaldehído al 37% para 9 mL de PBS para alcanzar una concentración final de 3,7%. Preparar esta solución antes de usar.
   PRECAUCIÓN: Use guantes para manejar la solución de formalde....

Resultados

LFR, con BODIPY 493/503 como la punta de prueba fluorescente es un método fácil y confiable para estudiar la acumulación dinámica de LDs en U. maydis, independientemente de las condiciones de crecimiento. Cuando las células fueron cultivadas en medio YPD, hubo un aumento en el índice de LD durante la fase exponencial, seguido por un descenso en la fase estacionaria (figura 2A). En cambio, en las células cultivadas bajo hambre de nitrógeno, hubo un au.......

Discusión

LFR es un novedoso método que se aplicó por primera vez estudiar el metabolismo de los lípidos en S. cerevisiae y más tarde fue exitosamente implementado en U. maydis^20,21. Aunque el índice de LD no da un valor absoluto de las etiquetas que se acumula en las células, proporciona una idea rápida del contenido en lípidos de las células, y la interpretación de los datos es sencilla cuando se comparan el índice de LD de dos o más condiciones experim.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Espectrofotómetro	Varioskan Lux microplaca multimodo reade	D5879	Filtro 493/503 o detector monocromador
Placa costar	Corning Inc.	3615	96 pocillos, de pared negra/fondo transparente
Placa costar	Corning Inc	3598	Placa de cultivo celular de 96 pocillos, costar
BODIPY 493/503	Invitrogen/ Thermofisher	D3922	4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno
Solución de formaldehído	Sigma Aldrich	252549	reactivo ACS, 37 % en peso en H2O, contiene 10-15% de metanol para evitar la polimerización
Yoduro de potasio	Sigma Aldrich	60399	BioUltra, ≥ 99,5% (AT)
FB2 Ustilago maydis	ATCC 201384		Levadura de basidiomiceto
Cloruro de sodio	Sigma Aldrich	746398	reactivo ACS, sal inorgánica
Fosfato de potasio monobásico	Sigma Aldrich	P0662	Reactivo ACS
Seleccionar extracto de levadura	Sigma Aldrich	Y100	Mezcla de aminoácidos, péptidos, solubles en agua, vitaminas y carbohidratos para medios de cultivo
N-Z case plus	Sigma aldrich	N4642	Hidrolizado enzimático de caseína de leche bovina
Glucosa	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) glucosa
Matraz Skaker	Pirex	CLS4450250-6EA	Vidrio de borosiicato
Shaker	SEV Mé xico	INO650V-7	Agitador orbital
Mesa centrífuga	Eppendorf	5415C	Centrífuga
Microtubos Sigma	Aldrich	Z606340	Eppendorf Puntas
pipeta	Axygen scientific	T-200-Y	Puntas de pipeta universales con extremo biselado, 200 microlitros, no estéril
pipeta mLine	Biohit	725130	8 canales, rango de volumen 5-100 uL

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