Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.
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Artículo de método
Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal mediante la generación de respuestas tolerantes a antígenos dietéticos y bacterias comensales mientras que montar una respuesta inmune efectiva a enteropatógeno microbios. Además, ha quedado claro que la inmunidad local intestinal tiene un profundo impacto en la inmunidad sistémica y distante. Por lo tanto, es importante estudiar cómo se induce una respuesta inmune intestinal y lo que es los resultados inmunológicos de la respuesta. Aquí, se describe un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos del intestino inductivo como de Peyer tejido linfoide asociado a intestino y ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y efectoras como la lámina propia y la epitelio intestinal. Esta técnica asegura el aislamiento de un gran número de linfocitos de los tejidos intestinales pequeñas con óptima pureza, viabilidad y mínima contaminación compartimentación dentro de las limitaciones de tiempo aceptable. La capacidad técnica para aislar los linfocitos y otras células inmunes de los tejidos intestinales permite la comprensión de la respuesta inmune a infecciones gastrointestinales, cánceres y enfermedades inflamatorias.
Introducción
El tracto gastrointestinal (GI) tiene muchos pliegues y protuberancias que representa la interfaz más grande separando el cuerpo interno y el ambiente externo. El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal. Está constantemente expuesto a antígenos dietéticos, las bacterias comensales y microbios patógenos. Como tal, debe seguir siendo tolerante a antígenos alimentarios y bacterias comensales conservando la capacidad de generar rápidamente una respuesta inmune efectiva a microbios enteropatógeno1. El sistema inmune intestinal puede dividirse anatómicamente en inducti....
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Protocolo
Todos los experimentos en animales eran realizados de conformidad con las directrices del Instituto Nacional de salud y aprobados por el pedregoso del arroyo Universidad institucional Animal cuidado y uso.
Nota: Asegúrese de que todas las aprobaciones se conceden antes de realizar procedimientos.
1. preparación de la solución
-
HGPG (HEPES, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y gentamicina), 100 ×
- Mezclar 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g de L-glutamina 200 mM (final), 1 × 106 U penicilina (2.000 U/mL final), la estreptomicina 1 g (2 mg/mL final) y gentamicina 2....
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Resultados
Se muestra una representación esquemática del Protocolo (figura 1). Los linfocitos de la mucosa intestinal inductiva y sitios efectores se organizan claramente. Peyer de parches (PP) y nodos de linfa mesentéricos (MLN) contienen linfocitos en áreas bien organizadas de células T y folículos de células B, mientras que el epitelio intestinal contiene linfocitos que se distribuyen más difusamente. La lámina propia (LP) contiene linfocitos difusamente distribuidos.......
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Discusión
Se presenta un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos desde el intestinal mucosa inductivo (MLN y PP) y efectores (compartimiento de LP y IEL). El protocolo ha sido desarrollado para equilibrar la entrada (tiempo) y salida (viabilidad y rendimiento) para maximizar la productividad y resultados. El protocolo también asegura la mínima contaminación compartimentación entre LP y IEL compartimientos.
Varios protocolos para el aislamiento de las células inmunes del intestino de ra.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
B.S.S. es apoyado por subvenciones de NIH (R01 AI076457) y fondos aportados por la Universidad de Stony Brook. Z.Q. es apoyado por los NIH grant (K12 GM102778).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamina | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicilina-Estreptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicina | Life Technologies | 15710-072 | |
| Hidróxido de sodio | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 Life | Technologies | 21870-076 | |
| Bicarbonato de sodio | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Suero fetal bovino | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Solución salina equilibrada de Hanks | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Ditioeritritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Cloruro de calcio hexahidratado | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Colgenasa, Tipo I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG solución madre de gradiente (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Biolegend | 420301 | |
| 70-µ Filtro de células M | Corning | 352350 | |
| 14 mL Tubo de polipropileno de fondo redondo | Matraz Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer | Kimble | 26500R-50mL | |
| Agitador magnético | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Barra agitadora | Fisher Scientific | 14-512-148 |
Referencias
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.....
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Reimpresiones y permisos
