Se describe un protocolo para exponer quirúrgicamente y estabilizar la glándula salival submaxilar murina intravital imagen usando microscopia intravital vertical. Este protocolo es fácilmente adaptable a otras glándulas exocrinas de la cabeza y región del cuello de los ratones y otros roedores pequeños.
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Artículo de método
Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La glándula salival submaxilar (SMG) es una de las tres glándulas salivales mayores y es de interés para muchos campos distintos de investigación biológica, como Inmunología, oncología, odontología y biología de la célula. El SMG es una glándula exocrine conformada por células epiteliales secretoras, miofibroblastos, células endoteliales, los nervios y matriz extracelular. Procesos celulares dinámicos en la rata y el ratón SMG anteriormente han sido reflejados, sobre todo usando invertido sistemas multi-photon microscopio. Aquí, describimos un protocolo sencillo para la preparación quirúrgica y la estabilización del SMG murino en ratones anestesiados para imágenes en vivo con los sistemas vertical microscopio del multi-photon. Presentamos juegos imagen representativa intravital de endógeno y eventualmente transferido células fluorescentes, incluyendo el etiquetado de los vasos sanguíneos o los conductos salivales y segunda harmónica para visualizar colágeno fibrilar. En suma, nuestro protocolo permite para preparación quirúrgica de glándulas salivales de ratón en los sistemas de microscopía vertical, que comúnmente se utilizan para la proyección de imagen intravital en el campo de la inmunología.
Introducción
Saliva es secretada por las glándulas exocrinas para lubricar el alimento, proteger las superficies mucosas del tracto oral y entregar las enzimas digestivas, así como sustancias antimicrobianas1,2. Además de las glándulas salivales menores se entremezclan en la submucosa oral, hay tres sistemas bilaterales de glándulas mayores que parótida, sublingual y submaxilar, se denominará según su ubicación1,2. Las células epiteliales en forma de pirámide, organizada en sacos en forma de matraz (acinos) o semilunas que están rodeadas por células mioepiteliales ....
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Protocolo
Todos los trabajos de animales ha sido aprobado por el Comité Cantonal para la experimentación Animal y realiza de acuerdo a las pautas federales.
1. anestesiar el ratón
- Use equipo de protección personal, incluyendo guantes y bata de laboratorio.
- Mezcla de ketamina y xilacina solución salina a una concentración de trabajo de 20 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente. Inyectar el material de trabajo por vía intraperitoneal (i.p.) en 8-10 μl/g de ratón. Coloque el ratón en la jaula.
Nota: Este protocolo ha sido probado para los ratones masculinos y femeninos 6 - 40 semanas de edad con antecedentes de C57BL/6. - Prepar....
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Resultados
Este protocolo permite la proyección de imagen de casi el todo lado dorsal o ventral del SMG. El campo de visión por lo general también incluye la glándula salival sublingual, que difiere ligeramente del SMG en composición celular4. Ambas glándulas son encapsulados por colágeno fibrilar y subdividen en lóbulos. Más 14:00 sistemas pueden producir una imagen sin etiqueta de colágeno fibrilar midiendo la señal armónica de 2nd , pero generalmente se necesita.......
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Discusión
Este protocolo ofrece un enfoque sencillo para obtener imágenes en vivo de murinas submaxilar y sublinguales glándulas salivales mediante microscopía no lineal vertical de uso frecuente en el campo de la inmunología. El método puede adaptarse para la proyección de imagen de otras glándulas exocrinas en la región de cabeza y cuello. Por ejemplo, nuestro laboratorio ha realizado la proyección de imagen de la glándula lacrimal en una manera análoga (no mostrada).
Eliminar el tejido conec.......
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Divulgaciones
No hay conflicto de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional Suiza (SNF) proyecto grant 31003A_135649, 31003A_153457 y 31003A_172994 (a joint ventures) y Leopoldina Beca 2011 LPDS-16 (BS). Este trabajo de configuraciones ópticas del "Microscopia Imaging Center" (MIC) de la Universidad de Berna.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Narketan 10 % (Ketamina) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xilacina) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| solución salina NaCl 0,9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazina) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Afeitadora eléctrica | Wahl | 9818L | o similar |
| Depilación crema | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Cinta quirúrgica (2,5 cm x 9,1 m y 1,25 cm x 9,1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Cinta quirúrgica (2,5 cm x 9,1 m y 1,25 cm x 9,1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, pegamento instantáneo | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Portaobjetos de vidrio para microscopio 20 mm y 22 mm | Menzel-Glä ser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grasa para laboratorio 60 g glisseal N | Borer (proveedor de VWR) | DECO514215.00-CA15 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools (F.S.T) | 14090-09 | o similar |
| Pinzas finas | Fine Science Tools (F.S.T) | 11252-20 | o similar |
| Bastoncillo de algodón | Migros | 617027988254 | o similar |
| Gasa Gazin 5 x 5 cm | Lohmann y Rauscher | 18500 | o similar |
| Microscopio estereoscópico | Leica | MZ16 | o similar |
| Texas Red dextrano 70kDa | Sondas moleculares | D1864 | |
| Azul en cascada dextrano 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Sistema de dos fotones | LaVision Biotec | TrimScope I y II | o similar |
| Objetivo XLUMPLANFL 20x/0.95 W | Olympus | n/a | u otro objetivo de inmersión en agua |
| Termómetro digital | Fluke | 95969077651 |
Referencias
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R.
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Reimpresiones y permisos
