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Artículo de método

Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical

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DOI:

10.3791/57283

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7 de mayo de 2018

 ,  ,  , 
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describe un protocolo para exponer quirúrgicamente y estabilizar la glándula salival submaxilar murina intravital imagen usando microscopia intravital vertical. Este protocolo es fácilmente adaptable a otras glándulas exocrinas de la cabeza y región del cuello de los ratones y otros roedores pequeños.

Resumen

La glándula salival submaxilar (SMG) es una de las tres glándulas salivales mayores y es de interés para muchos campos distintos de investigación biológica, como Inmunología, oncología, odontología y biología de la célula. El SMG es una glándula exocrine conformada por células epiteliales secretoras, miofibroblastos, células endoteliales, los nervios y matriz extracelular. Procesos celulares dinámicos en la rata y el ratón SMG anteriormente han sido reflejados, sobre todo usando invertido sistemas multi-photon microscopio. Aquí, describimos un protocolo sencillo para la preparación quirúrgica y la estabilización del SMG murino en ratones anestesiados para imágenes en vivo con los sistemas vertical microscopio del multi-photon. Presentamos juegos imagen representativa intravital de endógeno y eventualmente transferido células fluorescentes, incluyendo el etiquetado de los vasos sanguíneos o los conductos salivales y segunda harmónica para visualizar colágeno fibrilar. En suma, nuestro protocolo permite para preparación quirúrgica de glándulas salivales de ratón en los sistemas de microscopía vertical, que comúnmente se utilizan para la proyección de imagen intravital en el campo de la inmunología.

Introducción

Saliva es secretada por las glándulas exocrinas para lubricar el alimento, proteger las superficies mucosas del tracto oral y entregar las enzimas digestivas, así como sustancias antimicrobianas1,2. Además de las glándulas salivales menores se entremezclan en la submucosa oral, hay tres sistemas bilaterales de glándulas mayores que parótida, sublingual y submaxilar, se denominará según su ubicación1,2. Las células epiteliales en forma de pirámide, organizada en sacos en forma de matraz (acinos) o semilunas que están rodeadas por células mioepiteliales y una membrana del sótano, secretan los componentes serosos y mucosos de saliva1. Estrecho espacio luminal de los acinos drena en los conductos intercalados, que se unen en conductos estriados hasta que finalmente se unen en un conducto excretor único1. El conducto excretor principal del SMG se llama conducto de Wharton (WD) y se abre en la carúncula sublingual3,4. El compartimiento epitelial SMG por lo tanto representa una estructura altamente arborized con múltiples terminales terminal, que se asemeja a un paquete de uvas1,5,6. El intersticio SMG está compuesto por vasos sanguíneos y linfáticos embebidos en tejido conjuntivo7 que contiene nervios parasimpáticos8 y5de la matriz extracelular. Glándulas salivales normales de humanas y roedores también contienen células T, macrófagos y células dendríticas9, así como las células plasmáticas que secretan inmunoglobulina A (IgA) en la saliva9,10. Debido a sus múltiples funciones en salud y enfermedad, el SMG es un tema de interés para muchos campos de investigación biológica, incluyendo odontología4Inmunología11, Oncología12,8de fisiología y biología celular 3.

Proyección de imagen de interacciones y procesos celulares dinámicos es una poderosa herramienta en la investigación biológica13,14. El desarrollo de tejido profundo imágenes e innovaciones inmicroscopes basado en óptica no lineal (RNE), que se basan en la dispersión o absorción de fotones múltiples por parte de la muestra, ha permitido para examinar directamente los procesos celulares en los tejidos complejos13 ,15. Absorción de fotones múltiples implica la entrega de la energía de excitación total por los fotones de baja energía, que excitación del fluoróforo confines al plano focal y por lo tanto permite una penetración más profunda del tejido con fotodaño reducida y ruido fuera de foco excitación de13,15. Este principio se emplea por microscopia de dos fotones (14:00) y permite obtener imágenes de muestras fluorescentes en profundidades de hasta 1 mm15,16. Mientras comercialmente disponibles 14:00 las configuraciones se han convertido en fácil de usar y confiable, el principal desafío para la proyección de imagen intravital es exponer y estabilizar el órgano Diana de ratones anestesiados, especialmente para la proyección de imagen de serie de lapso de tiempo. Varios métodos para la corrección de deriva digital después de adquisición de datos han sido publicaron17,18 y recientemente desarrollado "VivoFollow", un sistema de corrección automática que contrarresta la deriva lenta del tejido en tiempo real usando un computarizado de la etapa19. Sin embargo, es aún crítico para alta calidad de imagen para reducir al mínimo el movimiento del tejido, especialmente los movimientos rápidos causados por respiración o del latido del corazón19. Se han publicado procedimientos de preparación y estabilización de múltiples órganos, incluyendo médula espinal20, hígado21, piel22, pulmón23y24de nodo de linfa. Además, los modelos para la proyección de imagen de la glándula salival rata han sido desarrolladas3,25 y perfeccionado para intravital proyección de imagen de alta resolución de murine que SMG adaptada a un microscopio invertido configuración26, 27 , 28.

Aquí, presentamos un protocolo práctico y adaptable para la proyección de imagen intravital de la SMG murino mediante microscopía no lineal vertical, que es comúnmente utilizado para la proyección de imagen intravital en el campo de la inmunología. Para ello, modificamos una etapa de inmovilización empleada ampliamente utilizada para las preparaciones de ganglio poplíteo.

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Protocolo

Todos los trabajos de animales ha sido aprobado por el Comité Cantonal para la experimentación Animal y realiza de acuerdo a las pautas federales.

1. anestesiar el ratón

  1. Use equipo de protección personal, incluyendo guantes y bata de laboratorio.
  2. Mezcla de ketamina y xilacina solución salina a una concentración de trabajo de 20 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente. Inyectar el material de trabajo por vía intraperitoneal (i.p.) en 8-10 μl/g de ratón. Coloque el ratón en la jaula.
    Nota: Este protocolo ha sido probado para los ratones masculinos y femeninos 6 - 40 semanas de edad con antecedentes de C57BL/6.
  3. Preparar la solución de la acepromazina en el 2.5 mg/mL e inyectar 30 μL i.p., 15 min después de la inyección de ketamina-xilacina (75 μg/ratón).
  4. Después de 5-15 min, busque adecuada anestesia y analgesia mediante el control de los reflejos, por ejemplo, reflejo de retirada de la pata o reflejo corneal.
  5. Control de reflejos aproximadamente cada 30 minutos durante toda la duración del experimento. Inyectar por vía subcutánea ketamina/xilacina en 1,5 μl/g de ratón, cada 60 minutos o antes si los reflejos son positivos.
    Nota: No puede utilizarse anestesia inhalatoria como isoflurano con este protocolo, debido a la fijación del ratón.

2. Retire la piel de la zona de corte

  1. Use una afeitadora eléctrica para afeitar una zona que se expande alrededor de 5 mm de caudal de la boca hacia las patas delanteras, que se extiende sobre las mordazas hacia las orejas.
  2. Aplicar Crema depilatoria para la zona depilada con un hisopo de algodón. Cuidadosamente y a fondo Quite después de 3 minutos, por ejemplo, limpiando con los tejidos húmedos.

3. fijar el ratón en el escenario

Nota: Este protocolo utiliza un escenario modificado para requisitos particulares (figura 1) equipado con dos soportes ajustables libremente para cubreobjetos (uno unido a los escenarios con un tornillo, el otro fija permanentemente sobre él); barras ajustables oído estereotáctica; una cadena, que puede ajustarse con un tornillo; un anillo; la calefacción del metal libremente ajustable y un área elevada para colocar el torso del ratón. Esta etapa está modificada de una etapa de ganglio poplíteo, con un añadido soporte stereotactic y un soporte para el cubreobjetos inferior sosteniendo el SMG exteriorizado. Planes detallados o citas de la etapa están disponibles bajo petición.

  1. Preparar la fase quitando los soportes para el aro calentador y el soporte extraíble cubreobjetos. Afloje los tornillos de los soportes de barra de oreja y el soporte fijo cubreobjetos. Cinta adhesiva un trozo de Gasa a la zona centro de la escena, que sirve como cama para el ratón.
  2. Utilizar el pegamento (véase Tabla de materiales) para colocar un vidrio de cubierta de 20 mm de diámetro en la parte superior de un soporte metálico cilíndrico (se trata del vidrio de cubierta más baja). Pegar un vidrio de cubierta de 25 mm en la parte inferior del soporte del metal plano (esto será el vidrio superior de la cubierta). Asegúrese de que los vidrios de cubierta traslapo aproximadamente 2-3 mm con soportes de metal y que el resto del vidrio sigue siendo libre de grasa y pegamento.
  3. Coloque el ratón en su parte posterior sobre la gasa, perpendicular a la cuerda tensada, con la cabeza centrada entre las barras de oído.
  4. Fijar las extremidades superiores del ratón en el escenario con cinta quirúrgica.
  5. A continuación, enganchar la cadena en los incisivos frontales superiores y apriete hasta que la mandíbula llegue a una posición horizontal. Usar un fórceps curvo anguloso para estirar un poco la lengua de la boca, que facilita la respiración.
  6. Bien, pero no con fuerza, tirar de la cola y cinta adhesiva en la etapa.
  7. Alinear las barras del oído para lograr un ángulo de aproximadamente 30° entre la barra y el borde de la etapa. Para asegurar este ángulo, utilice una regla de triángulo para dibujar un ángulo de 30° derecha e izquierda de una hoja de papel y coloque la fase transparente en el papel para alinear a los titulares por consiguiente.
  8. Fijar la mandíbula entre las barras de oído moviendo simultáneamente la barra de la izquierda y derecha hacia dentro hasta que la mandíbula es fijo y apriete los tornillos. Observar el movimiento del pecho antes, durante y después de fijar la mandíbula. Reducción o ausencia de respiración indica que las barras se fijan en el cuello, no el hueso de la mandíbula; en este caso, repita el procedimiento de fijación inmediatamente.
  9. Proporcionar calefacción al ratón, por ejemplo, colocando una lámpara de calefacción cerca o una almohada debajo de la etapa.

4. exposición quirúrgica de la glándula salival con un estereomicroscopio

Nota: Los pasos siguientes requieren la utilización de un estereomicroscopio, finas pinzas y tijeras quirúrgicas. Puesto que el procedimiento es terminal, no es necesario mantener las condiciones estériles de operación. Etanol-se limpian los instrumentos es suficiente.

  1. Localizar la posición aproximada del lóbulo derecho de SMG buscando un ligero abultamiento en la piel aproximadamente 15 mm de caudal de la boca y un intermedio de 5 mm de la línea de la mandíbula. Levantar un pliegue de piel pequeño en el centro de la protuberancia y corte creación y apertura de aproximadamente 5 mm de longitud.
  2. Aplicar inmediatamente un anillo 4 mm-alto de grasa para vacío en la piel que rodea el corte. (Usar una jeringa llena de grasa de vacío con una aguja de hipodérmica 25 G blunted).
  3. Llenar el anillo de grasa con una solución salina para asegurar que el tejido permanece húmedo durante la operación.
  4. Bajo el estereomicroscopio, alterar los tejidos siguiendo el siguiente procedimiento: utilizar una pinza fina para sostener firmemente un pedazo de tejido conjuntivo Unido directamente al SMG y utilizar una segunda pinza para tirar de los tejidos distales hasta que rompe. Asegurarse de que algún tejido conectivo queda sujeta al SMG; Esto es deseable ya que permite la manipulación. No tocar la glándula sí mismo con las pinzas, ya que esto puede causar sangrado.
  5. Repita este movimiento de interrumpir tejido conectivo primero encima de la glándula, luego en el lado medial (entre el lóbulo derecho e izquierdo del SMG). No se separan la sublingual de la glándula submaxilar.
  6. Seguir quitar el tejido fino conectivo lateral hacia la izquierda alrededor del SMG (medial al caudal, a distal, rostral).
  7. Asegúrese de que el suministro de sangre, vasos linfáticos eferentes y conducto salival, que se encuentran en un paquete en el sitio de craneal de la glándula, no se rompieron.
  8. Una vez que se interrumpe el lateral del tejido conectivo, utilice pinzas para tirar del tejido conjuntivo atado al extremo caudal del SMG hacia arriba para levantar el extremo caudal del SMG. Alterar el tejido conectivo por debajo del lóbulo SMG, a partir de la caudal y hacia el extremo rostral.
  9. Continuar hasta retirar el tejido conectivo a todos los sitios del SMG (excluyendo el sitio rostral con los vasos sanguíneos principales de alimentación, de drenaje y el WD).

5. fijación de la glándula

  1. Confirmar que el anillo de grasa con la solución salina es al menos 4 mm de alto y no fugas (ver paso 4.2).
  2. Instale la cubierta inferior del vidrio (vea el paso 3.2) colocando la barra metálica a su soporte ajustable en altura. Asegúrese de que el titular del cubreobjetos se ajusta a la posición más elevada y no toque el anillo de grasa cuando la etapa. Coloque el titular de la dirección caudal en un ángulo de aproximadamente 60° para el ratón, con el cubreobjetos que cubren aproximadamente dos terceras partes (partes caudales y distales) del lóbulo expuesto. Bajar el vidrio de la cubierta hasta que haga contacto con la glándula.
  3. Completar el anillo de grasa en la parte superior del vidrio de cubierta para formar un nuevo depósito de solución salino.
  4. Tire con cuidado hacia el lóbulo SMG encima el cubreobjetos con pinzas, sólo toca el tejido conjuntivo unido a él (el órgano puede ser movido de un tirón con el sitio de abajo hacia arriba).
  5. Asegúrese de que el anillo de grasa tiene una altura hasta de 4 mm como mínimo y no gotea. Si es necesario, rellenar el depósito de solución salino con 30 G jeringa llena con solución salina.
  6. Asegúrese que el soporte del vidrio de cubierta para el vidrio de cubierta superior esté en su posición más elevada. Utilice el tornillo para sujetar el soporte metálico con el vidrio de cubierta superior 25 mm al titular. Utilice los tornillos ajustables del soporte para colocar el vidrio de cubierta para que el SMG se centra en el medio.
  7. Utilice los tornillos de soporte ajustable para bajar el vidrio de la cubierta superior hasta que toque directamente el SMG. Observar la forma y el color de la glándula durante este paso. Si la superficie de la glándula aparece más grande, o el colorante cambia (por ejemplo de color de rosa a blanco), inmediatamente pone el cristal a una posición más alta para aliviar la presión sobre el SMG.
  8. Compruebe el depósito de solución salino para fugas buscando las burbujas de aire o gotas de solución salina fuera del depósito. Si se detecta una burbuja de aire o fugas, eliminar cubreobjetos y todo grasa y reinicia en el paso 2.
  9. Tornillo cierre los tornillos de fijación.

6. fijación del anillo de calefacción y sonda de temperatura

  1. Introduzca una sonda de temperatura en el depósito y colocarlo cerca de la glándula, luego el cable de la sonda a la etapa de la cinta.
  2. Un anillo de grasa se aplica a la hoja de cubierta superior, con la SMG en el centro (el diámetro del anillo de grasa debe corresponder al diámetro del aro calentador). Coloque el aro calentador encima el cubreobjetos y sellar con grasa. La tubería del anillo de calefacción a la etapa de la cinta.

7. la proyección de imagen

Nota: Utilizamos un sistema de microscopio de dos fotones vertical equipado con un láser sintonizable de Ti:Sa y un microscopio de fluorescencia con objetivos de inmersión en agua 20 X o 25 X. Tiempo real corrección de deriva de tejido durante la adquisición puede ser implementado mediante una etapa automatizada y VivoFollow19. Esto mejora la estabilidad de la adquisición de la imagen, pero no es necesario.

  1. Encienda el sistema de microscopía vertical utilizando un software apropiado, proporcionado por el fabricante del microscopio. Sintonizar el Ti:Sa láser a una longitud de onda de excitación 780-900 nm.
  2. Conecte la tubería de calefacción para el aro calentador. Una bomba peristáltica circula agua caliente (calentada por sumergir parte de la tubería en un baño de agua de 80° C) a través del anillo para calentar el SMG.
  3. Conecte la sonda de temperatura con un termómetro digital. Ajustar la velocidad de la bomba peristáltica si la temperatura es no entre 35-39 ° C. Cuanto más rápido trabaja la bomba, cuanto más caliente se pone el objeto y viceversa.
  4. Antes de comenzar la adquisición de la imagen, realizar un control visual de las velocidades de flujo de sangre. Revise cuidadosamente el pasaje de leucocitos a través de los capilares finos o por la inyección de dextrano fluorescente.
    Nota: Dextranos fluorescentes inyectados por vía intravenosa inmediatamente llenará la vasculatura SMG toda cuando el flujo sanguíneo es fisiológico. Esto es casi siempre el caso en este procedimiento.
  5. Para seguir las células inmunes, profundidad imágenes suele ser entre 20-150 μm por debajo de la superficie de la SMG identificado por la señal de generación armónica 2nd . Pilas de grabar imagen de campo de visión de 150-300 μm con píxeles de resolución de aproximadamente 512 x 512 o más alto y z en profundidades de 20-60 μm, con separación de 2-4 μm entre imágenes. Repita pila adquisición cada 20-30 s para una duración total de 20-60 min.
  6. Use el termómetro digital para controlar los niveles de temperatura mínima y máxima después de la adquisición de la secuencia de una imagen. Deseche la secuencia de imágenes si no es el mínimo o máximo en el rango de 37 ± 2 ° C. Rellenar el agua para la inmersión del objetivo entre secuencias de imágenes.
  7. Al final de la sesión de imágenes, eutanasia los ratones por CO2 asfixia bajo anestesia.
    Nota: Esto es de acuerdo a las pautas federales suizos de experimentación con animales; otras directrices para la eutanasia pueden aplicar en otros lugares.

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Resultados

Este protocolo permite la proyección de imagen de casi el todo lado dorsal o ventral del SMG. El campo de visión por lo general también incluye la glándula salival sublingual, que difiere ligeramente del SMG en composición celular4. Ambas glándulas son encapsulados por colágeno fibrilar y subdividen en lóbulos. Más 14:00 sistemas pueden producir una imagen sin etiqueta de colágeno fibrilar midiendo la señal armónica de 2nd , pero generalmente se necesita...

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Discusión

Este protocolo ofrece un enfoque sencillo para obtener imágenes en vivo de murinas submaxilar y sublinguales glándulas salivales mediante microscopía no lineal vertical de uso frecuente en el campo de la inmunología. El método puede adaptarse para la proyección de imagen de otras glándulas exocrinas en la región de cabeza y cuello. Por ejemplo, nuestro laboratorio ha realizado la proyección de imagen de la glándula lacrimal en una manera análoga (no mostrada).

Eliminar el tejido conec...

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Divulgaciones

No hay conflicto de interés declarado.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional Suiza (SNF) proyecto grant 31003A_135649, 31003A_153457 y 31003A_172994 (a joint ventures) y Leopoldina Beca 2011 LPDS-16 (BS). Este trabajo de configuraciones ópticas del "Microscopia Imaging Center" (MIC) de la Universidad de Berna.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Narketan 10 %  (Ketamina) 20ml (100 mg/ml)Vetoquinol3605877535982
Rompun 2% (Xilacina) 25 ml (20 mg/ml)Bayer680538150144
solución salina NaCl 0,9%B. Braun3535789
Prequillan 1% (Acepromazina) 10 ml (10 mg/ml)Fatro6805671900029
Afeitadora eléctricaWahl9818Lo similar
Depilación cremaVeet4002448090656
Durapore Cinta quirúrgica (2,5 cm x 9,1 m y 1,25 cm x 9,1 m)Durapore (3M)1538-1
Durapore Cinta quirúrgica (2,5 cm x 9,1 m y 1,25 cm x 9,1 m)Durapore (3M)1538-0
Super glue Ultra gel, pegamento instantáneoPattex, Henkel4015000415040
Portaobjetos de vidrio para microscopio 20 mm y 22 mmMenzel-Glä ser631-1343/ 631-1344
Grasa para laboratorio 60 g glisseal NBorer (proveedor de VWR)DECO514215.00-CA15
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools (F.S.T)14090-09o similar
Pinzas finasFine Science Tools (F.S.T)11252-20o similar
Bastoncillo de algodónMigros617027988254o similar
Gasa Gazin 5 x 5 cmLohmann y Rauscher18500o similar
Microscopio estereoscópicoLeicaMZ16o similar
Texas Red dextrano 70kDa  Sondas molecularesD1864
Azul en cascada dextrano 10kDainvitrogenD1976
Sistema de dos fotonesLaVision BiotecTrimScope I y IIo similar
Objetivo XLUMPLANFL 20x/0.95 WOlympusn/au otro objetivo de inmersión en agua 
Termómetro digitalFluke95969077651

Referencias

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