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Artículo de método

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

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DOI:

10.3791/57290

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20 de febrero de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2UMR7104, Centre National de la Recherche Scientifique, 3U964, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 4Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para la photoconversion de Kaede proteína fluorescente en células endocárdicos de la vida del embrión de pez cebra que permite el seguimiento de células del Canal auriculoventricular durante canal atrio-ventricular y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón .

Resumen

Durante la embriogénesis, las células se someten a cambios dinámicos en el comportamiento de la célula, y descifrar la lógica celular detrás de estos cambios es una meta fundamental en el campo de la biología del desarrollo. El descubrimiento y desarrollo de proteínas de photoconvertible han ayudado grandemente nuestra comprensión de estos cambios dinámicos al proporcionar un método para resaltar ópticamente las células y tejidos. Sin embargo, mientras que photoconversion, Time-lapse microscopía y análisis posteriores han demostrado para ser muy exitosa en descubrir dinámica celular en órganos como el cerebro o el ojo, este enfoque generalmente no se utiliza en pleno desarrollo debido a desafíos planteados por el rápido movimiento del corazón durante el ciclo cardíaco. Este protocolo consta de dos partes. La primera parte describe un método para photoconverting y posteriormente seguimiento de células del Canal auriculoventricular (EdCs) en pez cebra canal auriculoventricular (CAV) y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón. El método consiste en detener temporalmente el corazón con una droga en orden para photoconversion exacto lugar. Corazones están autorizados a reanudar la paliza sobre retiro de la droga y el desarrollo embrionario continúa normalmente hasta que el corazón está parado otra vez para la proyección de imagen de alta resolución de photoconverted EdCs en un punto del tiempo de desarrollo más adelante. La segunda parte del protocolo describe un método de análisis de imagen para cuantificar la longitud de una región photoconverted o no photoconverted en el AVC en embriones jóvenes mediante la asignación de la señal fluorescente de la estructura tridimensional en un mapa bidimensional . Juntas, las dos partes del protocolo permite examinar el origen y el comportamiento de las células que conforman el pez cebra AVC y válvula auriculoventricular del corazón y potencialmente puede aplicarse para el estudio de mutantes, morphants o embriones que han sido tratados con reactivos que interrumpen el desarrollo AVC o válvula.

Introducción

El pez cebra es actualmente uno de los más importantes modelos vertebrados para estudiar los procesos celulares y de desarrollo en vivo. Esto es en gran parte debido a la transparencia óptica de pez cebra y receptividad a la genética, que es un potente modelo para la aplicación de técnicas ópticas genéticamente codificado photoresponsive proteína tecnologías1. Específicas para el estudio del desarrollo del corazón, pez cebra recibe suficiente oxígeno por difusión que incluso mutantes sin latidos del corazón pueden sobrevivir a través de la primera semana de desarrollo, que permitan el análisis de los efectos de los genes del desarrollo y perturbado flujo de sangre en la morfogénesis del corazón no es posible en la mayoría vertebrados2.

El tubo de corazón de pez cebra está formado por 24 horas post fecundación (hpf). Poco después de su formación, el tubo del corazón comienza batiendo activamente. Por 36 hpf, una clara constricción separa la aurícula del ventrículo. Esta región de constricción se llama el canal auriculoventricular (CAV) y las células en esta región el cambio de una morfología escamosa a una morfología cuboidal3. Pez cebra válvula auriculoventricular morfogénesis se inicia alrededor de 48 h post fertilización. 5 días post fertilización, dos valvas se extienden al AVC y prevenir el flujo retrógrado de sangre desde el ventrículo a la aurícula durante el ciclo cardíaco4. Seguimiento de las células durante la formación de AVC y la válvula es un reto como el latido rápido del corazón hace que sea difícil seguir las células vía microscopia Time-lapse tradicional5,6. Este protocolo, adaptado de Steed et al., 20167, describe un método que utiliza la Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 pez cebra transgénica línea, en la que la proteína de photoconvertible Kaede se expresa en células endoteliales, incluyendo el endocardio. La droga 2, 3-butanedione-2-monoxima (BDM) se utiliza para detener temporalmente el corazón latiendo, lo que permite photoconversion exacta de EdCs entre 36 y 55 hpf y proyección de imagen de alta resolución de photoconverted EdCs en momentos específicos de desarrollo. Se ha demostrado previamente que EdCs photoconverted utilizando este método puede seguir siendo distinguible de sus vecinos inconversos durante cinco días o más después del tiempo de photoconversion7. Este protocolo también detalla un método utilizado para el análisis de la imagen de photoconverted EdCs en embriones menores de 48 hpf, que se ha utilizado con éxito para seguir movimientos de tejido durante el desarrollo de AVC (Boselli et al., en prensa)9. Esperamos que los lectores encontrarán este protocolo útil para el estudio de AVC y válvula de desarrollo de embriones normales y mutantes, morphants o embriones tratados con drogas. Para un protocolo más general sobre rastreo de celulares usando photoconvertible proteínas durante el desarrollo del pez cebra, vea por favor el artículo por Lombardo et al., 201210.

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Protocolo

1. preparación de moldes y montaje agarosa

  1. Crear un molde con las dimensiones indicadas en la figura 1 utilizando una impresora 3D o herramientas de taller mecánico tradicional.
  2. Pipetee aproximadamente 1,5 mL de agarosa 1% fundido en un plato de montaje plástico 35 mm. Colocar el molde de plástico en la agarosa líquida, teniendo cuidado de evitar atrapar aire entre el molde y la agarosa. Coloque el plato a 4 ° C, espere hasta que la agarosa endurece (esto toma alrededor de 5 minutos), luego retire el molde de plástico.
  3. Para guardar el plato de montaje para su uso posterior, cubrir el plato con su tapa y, a continuación, envuelva el plato y la tapa con parafilm. Luego puede almacenarse el plato de montaje lateral de la tapa hacia abajo hasta 5 días a 4 ° C.
  4. Prepara con antelación alícuotas de 1 mL de agarosa de bajo punto de fusión de 0,7% en 1,5 mL tubos Eppendorf para usar en el día de montaje.
    Nota: Los pozos de agarosa del plato de montaje se deformen con el tiempo como el agua se evapora si parafilm no envuelve los platos bien.

2. obtención de embriones para la Photoconversion

  1. Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) línea y crecen aproximadamente 200 embriones en medio del embrión en la oscuridad a 28,5 ° C. Para obtener más información sobre cómo cruzar líneas de pez cebra, consulte la base de datos educación ciencia de JoVE11.
  2. Después de 5 h, pero antes de 24 h, tratamiento de embriones con la 1-fenil-2-tiourea (PTU) para evitar la formación de pigmento (0.003% PTU en medio del embrión).
  3. Sobre 1 h antes del comienzo de photoconversion, pantalla embriones bajo un estereoscopio fluorescente y seleccionarlos embriones sanos 5 parecen expresar la fluorescencia verde brillante. Se recomienda el uso de luz de baja intensidad al visualizar los embriones para evitar la exposición de los embriones a la luz ambiente para evitar photoconverting Kaede en células no específicas.

3. incrustar

  1. Preparar 10 mL de medio de montaje: Metanosulfonato de 0,02% y el 50 mM BDM en medio embrión.
  2. Añadir 2 mL de medio de montaje en el plato de montaje y permite 15-30 min de la solución que se difunden en la agarosa.
  3. Mientras tanto, derrita una alícuota de 1 mL de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) de 0,7% colocando el tubo en un bloque de calor de 70 ° C durante aproximadamente 5 minutos.
    1. Espere la agarosa de la LMP se enfríe un poco, luego añada 25 μl de solución de metanosulfonato de 8 mg/mL y 40 μl de solución de 1 M de la BDM al tubo de agarosa de bajo punto de fusión. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo, luego transferir el tubo a un bloque de 38 ° C de calor para mantener la agarosa de la LMP en su estado líquido.
  4. En una Petri dish con medio embrión, dechorionate cuidadosamente los embriones previamente seleccionados bajo el estereomicroscopio con unas pinzas, procurando no para dañar los embriones.
  5. Transfiera los embriones a un plato separado que contiene 2 mL de medio de montaje.
    1. Cuando se detuvo el corazón de los embriones (tarda unos 5-10 min), colas de transferencia los embriones para el montaje del plato y colocar los embriones en los pozos con unas pinzas que se encuentran en un ángulo de 25 grados, apuntando hacia la parte más profunda del pozo, yema mirando hacia arriba.
    2. Cuando embriones son más o menos en su lugar, eliminar los medios de comunicación, integrar los embriones en ~ 200 μL de agarosa LMP de 0,7% que contiene Metanosulfonato y BDM y reajustar la posición de los embriones, inclinando los embriones a la izquierda o derecha según sea necesario.
  6. Espere a que los conjuntos de agarosa LMP (tarda unos 5 minutos), luego agregar medio de montaje en el plato. Los embriones están ahora listos para ser photoconverted.
    Nota: El Metanosulfonato y el BDM se utilizan para anestesiar los embriones y para detener el corazón de los embriones, respectivamente. Medios de montaje se pueden preparar el día antes de la proyección de imagen, pero no se olvide de proteger los medios de comunicación de la luz.
    Nota: La correcta colocación de los embriones es importante para permitir un camino claro láser a las células que se desea photoconvert. Coloque la cabeza del embrión cerca de la salida del pozo para que la luz láser no tiene que viajar lejos para llegar hasta el embrión, y para que los embriones pueden ser fácilmente desmontados después de photoconversion.

4. Photoconversion

  1. En un microscopio confocal vertical (como Leica SP8) equipado con un 405 nanómetro, 488 nanómetro y 561 nm láser fuente, localizar el embrión del corazón usando transmite luz blanca (brightfield) y un objetivo (como Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objetivo). Compruebe la fluorescencia roja de Kaede usando el 561 nm láser (es decir, láser DPSS 561, en ~ 5% de intensidad, detector colocado a 589 728 nm). A continuación, visualizar el endocardio usando el 488 nm láser (es decir, láser de argón multilínea de 30 mW en ~ 5% de intensidad, detector colocado a 502 556 nm).
  2. Entrar en modo "FRAP" en el software de adquisición de microscopio. Seleccione la potencia de láser de ~ 1% para ambos 488 nm y 561 nm láseres.
  3. Centrarse en el plano de interés, seleccione una región de interés (ROI), y células photoconvert con diodo 405 nm láser en energía del laser de 25%, tres veces la exploración sobre el ROI. Kaede insuficiente debe photoconverted en el ROI, escanee el 405 nm láser sobre el área tres veces nuevamente. Repita este paso para todos ROIs.
  4. Volver al modo "TCS SP8" en el software y adquirir una pila de z, usando la 561 nm y 488 nm láser secuencialmente. Asegúrese de seleccionar la opción 'bidireccional' para aumentar la velocidad de proyección de imagen.
    Nota: Cuánto tiempo tarda en photoconvert y la imagen de cada embrión varía. Latido del corazón se sabe para ser importante para el desarrollo de la válvula de corazón normal, así que evite mantener el corazón parado durante más de 30 minutos, incluso si esto significa que no tienes tiempo para photoconvert todos los 5 embriones.
    Nota: Durante el proceso de photoconversion, uso de detectores de PMT, mientras que después de photoconversion, se recomienda usar detectores de híbrido a modo de conteo. Esto es porque los detectores híbridos son más sensibles y son capaces de producir imágenes de mejor calidad, pero se dañan fácilmente por la sobre exposición.

5. Desmontaje de embriones photoconverted

  1. Después de photoconversion, utilice una pipeta de vidrio para presionar un poco justo por encima de la cabeza del embrión para romper la agarosa de la LMP, luego aspirar suavemente el embrión.
    1. Expulsar el embrión de la pipeta de vidrio en un plato de Petri de 35 mm que contiene medio de embrión con PTU (a lavar que contiene medio de BDM).
    2. Transferir el embrión a un pozo en una placa de 6 pozos que contienen medio embrión con PTU. Durante este paso, asegúrese de que tome nota de que embrión entra que bien, ya que es esencial para correlacionar la posición de las células photoconverted en etapas tardías del desarrollo.
  2. Ahora que los embriones se quitan del medio con BDM, deben comenzar sus corazones batiendo otra vez en unos 5 minutos embriones retorno a la oscuridad a 28,5 ° C para permitir que los embriones continuar desarrollando normalmente.

6. proyección de imagen de células de photoconverted en etapas embrionarias tardías

  1. En la etapa deseada, detener el corazón y volver a embeber los embriones como en el paso 3 de este protocolo, con la importante diferencia de que los embriones deben ser tratados con BDM en platos separados, marcados para seguimiento de embriones.
  2. De embriones hasta 62 hpf, adquirir z-pila del endocardio con 561 nm y 488 nm para el rojo y verde fluorescente señales, respectivamente. Embriones en etapas mayores de 62 hpf, use un multifotón laser set a 940 nm imagen Kaede verde en vez del láser de 488 nm.

7. Análisis de la imagen embriones bajo 48 hpf

Nota: Movimientos de tejido del AVC pueden ser difíciles de analizar debido a su estructura tridimensional compleja. Para cuantificar la longitud de una región de photoconverted en el AVC entre dos regiones no photoconverted o la longitud de una región no photoconverted en el AVC entre dos regiones de photoconverted, puede ser deseable para cartografiar la estructura tridimensional en un mapa de dos dimensiones. Imágenes de photoconverted embriones obtienen antes de 48 hpf puede analizarse mediante el método siguiente.

  1. Importar las imágenes adquiridas en Matlab o cualquier software similar.
  2. Delimitar manualmente el retorno de la inversión, es decir, el endocardio y aplicar una mascarilla para quitar la señal de fuera de esta región.
  3. Aplicar un umbral de intensidad en la imagen para identificar los puntos en el endocardio y el terreno en tres dimensiones. Aislar los puntos correspondientes a la parte más estrecha y más recta de la AVC, borrando manualmente los puntos de ningún interés en la aurícula y el ventrículo mediante el comando borrar en el software.
  4. Use un cilindro para adaptarse a los puntos que representan el AVC así obtenido.
  5. Definir un sistema de referencia para comparar varias muestras. Por ejemplo, adoptar el centro de la masa de los puntos de AVC como el origen del sistema de referencia y el eje del cilindro equipado como el eje z.
    1. Asegúrese de que z-posiciones positivas corresponden siempre al mismo lado del corazón (ventricular o atrial).
    2. Proyectar los puntos de AVC en el plano x-y y una elipse para que encajen.
    3. Rotar los puntos endocárdicos alrededor del eje z para que el eje mayor de la elipse y el eje y del sistema de referencia son paralelos y los y-valores positivos corresponden a la parte interna de la AVC con respecto a los embriones.
  6. Para segmentar el AVC, corte el dataset tridimensional con algunos aviones obtenidas haciendo girar el plano de media {y = 0, x > 0} en la dirección z.
    1. La intensidad de los píxeles vecinos en estos planos del proyecto y definir el endotelio de manera consistente. Por ejemplo, dibujar manualmente una línea desde el auricular en el lado ventricular del AVC en el espesor medio del endotelio.
    2. Interpolar los puntos de las líneas que representan el endotelio con una spline tridimensional usando el toolbox de spline para representar el AVC con una superficie.
      Nota: El número de los planos de corte determina tanto la precisión de la segmentación y el consumo de tiempo de este paso. Generalmente, 8 planos son suficientes para lograr buenos resultados.
  7. Definir la posición azimutal de cada punto sobre la superficie de AVC usando coordenadas cilíndricas.
    1. En cada posición azimutal definir una curva paramétrica a lo largo de la superficie de la AVC mediante el cálculo de la longitud de arco en la superficie entre puntos consecutivos.
    2. Para cada curva paramétrica, definir el punto en la curva más cercana al centro del AVC a cero. Los puntos del AVC así son descritos totalmente por su posición azimutal y su posición en la curva paramétrica.
  8. El AVC se despliegan en una imagen bidimensional usando la posición paramétrica de los puntos.
  9. Encontrar los bordes de la región para cuantificar como los bordes de la umbralización binaria de la imagen de la relación entre las intensidades de lo photoconverted y los canales no photoconverted. Manualmente el resultado correcto si es necesario.
  10. Calcular la longitud del arco entre los bordes para calcular la longitud de los tejidos en función de la posición azimutal.

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Resultados

Un ejemplo de un embrión photoconverted en 48 hpf y reflejada otra vez 80 hpf se muestra en la figura 2, cine 1 y 2. Exponer Kaede a la luz nm 405 irreversiblemente conversos de la proteína de su forma verde fluorescente para formar rojo fluorescente, que permite el comportamiento de las células con el verde o su forma roja a seguir con respetan a su color diferenciado vecinos durante la formación de la válvula. Se puede ver ...

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Discusión

Tiempo de photoconversion: Kaede aunque sigue siendo brillantemente expresada en EdCs en 96 hpf, cabe señalar que a medida que el embrión crece, la luz laser difunde más antes de que llegue el AVC, dificultando el photoconversion confinado de Kaede. En embrionario etapas después de 55 años hpf, la dilatación del ventrículo y la aurícula también significa que el haz de láser violeta utilizado para photoconversion no puede llegar a las células de AVC sin pasar a través de la aurícula o ventrículo. Esto significa q...

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Divulgaciones

Ningún conflicto de interés declarado.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli y Basile Gurchenkov para ayudar a diseñar y hacer el molde que se describe en este protocolo. Este trabajo fue financiado por la ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), el programa EMBO joven investigador, FRM (DEQ20140329553), la Comunidad Europea, ERC CoG N ° 682938 Evalve y por el subsidio ANR-10-LABX-0030-INRT, a cargo de un fondo del Estado francés la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir etiquetado ANR-10-IDEX-0002-02.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales
huevos (consulte el Libro del pez cebra22 para obtener más detalles).
Microscopio estereoscópico
Microscopio confocal vertical (equipado con láseres que funcionan a 488 nm, 561 nm y 405 nm, un láser multifotónico sintonizable y un Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0,95 objetivo)LeicaLeica SP8
Heat blockThermoScientific88870001
plato de cultivo de tejidos de 35 mm x 10 mmFalcon353001
Placa de 6 pocillosFalcon353046
placa
Pinzas
Pipeta
Molde
Reactivos
8 mg/mL Solución madre de tricaína 
1 M BDM solución
UltraPure agarosa de bajo punto de fusiónInvitrogen16520-050
AgarosaLonza50004
PTU (1-fenil-2-tiourea)Sigma AldrichP7629
Medio embrionario: 30x solución
Software
Matlab equipado con las cajas de herramientas de análisis de imágenes, ajuste de curvas, bioformatosMathWorks
8 mg/mL solución madre de tricaína
200 mg de tricaína en polvo (ácido etil 3-aminobenzoato metanosulfónico)Sigma-AldrichE10521
25 mL Danieau
Ajuste a pH 7, alícuota y almacene a -20 ° C 
1 M
1 g BDMSigma-Aldrich112135
10 mL ddH2O
Alícuota y almacenar a -20 &0 ° C
Embrión medio: 30x solución madre
50,7 g NaClSigma-Aldrich7647-14-5
0,78 g KClSigma-Aldrich7447-40-7
1,47 g Sulfato de magnesioSigma-Aldrich  7487-88-9
2,1 g Nitrito de calcio tetrahidratadoSigma-Aldrich13477-34-4
19,52 g HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico)Sigma-Aldrich7365-45-9
Ajustar a pH 7,2 y almacenar a temperatura
moho
resinaPlasCLEARAsiga
Plus 39  Impresora 3D Freeform PicoAsiga
Equipo necesario para la cría de peces y la recolección de de Petride vidriomadre madre ambiente

Referencias

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  9. Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
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