Método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por LC-MS con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar y calificar cada especie de esfingomielina mediante monitoreo de reacción múltiple y modo MS/MS/MS, respectivamente.

Abstract

Se presenta un método de analizar la esfingomielina (SM) cualitativamente y cuantitativamente por cromatografía líquido-electrospray ionización-tandem espectrometría de masas (LC-ESI-MS/MS). SM es un sphingolipid común compuesto por una Fosforilcolina y una ceramida como la componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Un número de especies de SM está presente en células de mamífero debido a una variedad en el esfingoide larga cadena base (LCB) y un N-molécula de acil en la ceramida. En este informe, se muestra un método para estimar la cantidad de carbono y de dobles enlaces en un LCB y un N-molécula de acil basado en sus correspondientes iones producto de experimentos de MS/MS/MS (MS³). Además, se presenta un método de análisis cuantitativo de SM utilizando dos estable isotópicamente etiquetada SM especies, lo que facilita determinar el rango utilizado en la cuantificación de SM. El presente método será útil en la caracterización de una variedad de especies de SM en muestras biológicas y productos industriales tales como cosméticos.

Introduction

Esfingomielina (SM) es un sphingolipid comun en células de mamíferos. SM es sintetizada intracelularmente¹ y presente como un precursor para otros esfingolípidos como un esfingosina-1-fosfato y una ceramida, que tienen papeles cruciales en inmune celular trata y homeostasis de la barrera, respectivamente^{2, de la piel 3}. Así, el análisis preciso del metabolismo del SM es importante dilucidar las funciones fisiológicas y patológicas de los ESFINGOLIPIDOS.

SM se compone de una ceramida y una Fosforilcolina vinculado con el grupo 1-hidroxilo de la ceramida, que ....

Protocol

Consultar todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Guantes para minimizar la contaminación de las muestras por SM derivados de la piel. El presente Protocolo se aplicó a las células HeLa cultivadas en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1.000 U/L penicilina y estreptomicina 100 mg/L.

1. preparación de las muestras de lípidos

Nota: Es importante que toda la cristalería incluyendo tubos de ensayo con tapones de rosca forrado de teflón libre de detergente.

1. Extracción de la fracción lipídica total de homog....

Results

Químicamente sintetizados d18:1 / SM (figura 1A) y d18:1 24:0 / 24:0 SM en las muestras de lípidos extraídas de las células HeLa (figura 1B) se analizaron por LC-ESI-MS empleando a³ [M + HCOO]^– y [M-CH₃]^- como iones del precursor de la primera y segunda, respectivamente. Tenga en cuenta que la intensidad del espectro de desmetilado-sphingosylphosphorylc.......

Discussion

En el presente método cualitativo, hemos obtenido MS³ iones del producto de un proceso estadístico y un N-molécula de acil. Es fundamental para asignar correctamente un SPC y una N-molécula de acil. Para ello, debe señalarse que también se pueden detectar otras moléculas de Fosforilcolina que contiene como MS³ iones del producto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) y del plasmalógeno del PC están abundantemente presentes en células de mamífero y su hidrofobicidad es similar a la de SM. Po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	ThermoFisher	10010023
plato de cultivo de tejidos de 100 mm	IWAKI	3020-100
Rascador de células	IWAKI	9000-220
Tubo siliconado de 2,0 mL	Fisher Scientific	02-681-321
Tubo de ensayo	IWAKI	TST SCR 16-100
Tapón de rosca revestido de teflón	IWAKI	9998CAP415-15
Tubo de vidrio desechable	IWAKI	9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µ m 1,5 mm D.I. x 100 mm	Shiseido	92223	El cartucho Guard se inserta en el soporte del cartucho y se conecta a la columna C18
CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm CARTUCHO DE PROTECCIÓN	Shiseido	12197
Soporte de cartucho	Shiseido	12415
Acetonitrilo	Wako	018-19853
2-Propanol (Alcohol Isopropílico)	Wako	161-09163
Metanol	Wako	134-14523
Ácido fórmico	Wako	066-00466
28% Agua de amoníaco	Wako	016-03146
Sonicador (tipo baño)	SHARP	UT-206H
Mezclador de vórtice para tubo de ensayo de vidrio	TAITEC	Mix-EVR
1,4 mL vial de vidrio	Tomsic	500-1982	Las muestras se almacenan en un vial de vidrio de 1,4 ml sellado con tapón de rosca y tabique de 8 mm a -20 °C; C
Tabique de 8 mm	Tomsic	200-3322	Cuando se analizan las muestras, los tapones de rosca se sustituyen por tapones de rosca con tabique ranurado
Tapón de rosca para vial de vidrio de 1,4 mm	Tomsic	500-2762
Tapón de rosca con tabique ranurado	Shimadzu GLC	GLCTV-803
PVDF 0.22 µ filtro	m Millipore	SLGVR04NL
Espectrometría de masas de trampa de iones lineal triple cuadrupolar y cuadrupolar	SCIEX QTRAP4500
El software para la adquisición de datos y el análisis de espectros de iones de productos	SCIEX	Analyst
El software para la integración de datos en el análisis cuantitativo	Sistema de HPLC SCIEX	MultiQuant
	Shimadzu	Nexera
Frasco de vidrio	Sansyo	85-0002
d18:1/24:0 esfingomielina	Avanti Lípidos polares	860592P
esfingosilfosforilcolina	Merck	567735
Suero fetal bovino	ThermoFisher
L-glutamina	ThermoFisher
Penicilina y estreptomicina	Sigma	P4333
Eagle' s medio esencial mínimo	Sigma	M4655