Infección por Pseudomonas aeruginosa causa una morbilidad significativa en hosts vulnerables. La biblioteca mutantes de inserción de transposones no redundante de p. aeruginosa cepa PA14, designados como establece PA14NR, facilita el análisis de la funcionalidad del gen en numerosos procesos. Presentamos es un protocolo para generar copias de alta calidad de la biblioteca mutante PA14NR establecido.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa fenotípicamente y genotípicamente diversa y adaptable ubicua en ambientes humanos. P. aeruginosa es capaz de formar biopelículas desarrollan resistencia a los antibióticos, producen factores de virulencia y evolucionar rápidamente en el curso de una infección crónica. Así p. aeruginosa puede causar agudo y crónico, difícil de tratar infecciones, dando lugar a una morbilidad significativa en ciertas poblaciones de pacientes. P. aeruginosa cepa PA14 es un aislante clínico humano con una estructura de genoma conservadas que infecta una variedad de mamíferos y a anfitriones haciendo PA14 una variedad atractiva para el estudio de este patógeno. En 2006, se generó una transposon no redundante inserción mutante biblioteca 5.459 mutantes correspondientes a 4.596 genes predichos de PA14. Desde entonces, distribución de la biblioteca de PA14 ha permitido a la comunidad de investigación comprender mejor la función de genes individuales y complejas vías de p. aeruginosa. Mantenimiento de la integridad de la biblioteca a través del proceso de replicación requiere técnicas de correcta manipulación y precisa. Para ello, este manuscrito presenta protocolos que describen en detalle los pasos involucrados en la replicación de la biblioteca, biblioteca de control de calidad y almacenamiento adecuado de los mutantes.
Introducción
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa fenotípicamente y genotípicamente diversa y adaptable presente en suelo, agua y entornos más humanos, así como la microflora de la piel. Comparado a muchas especies bacterianas, p. aeruginosa tiene un genoma relativamente grande de 5.5-7 Mbp con alta G + C contenido (65-67%). Además, una proporción significativa de sus genes están implicada en la adaptación metabólica y forman parte de redes de regulación, permitiendo una gran flexibilidad en respuesta a estrés ambiental1. P. aeruginosa expresa una gran cantidad de factores de virulencia, exhibe la propensión de form....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
PRECAUCIÓN: Utilizar las medidas de seguridad BSL-2 estándar manejo de p. aeruginosa, un patógeno humano. Si usted es un individuo inmunocomprometido o tiene cualquier condición médica que aumenta su susceptibilidad a la infección bacteriana, tenga cuidado especial cuando se trabaja con el P. aeruginosa. Consulte con la oficina de seguridad de la biotecnología en su institución y obtener la aprobación de su médico antes de trabajar con la PA14 NR Set o bibliotecas mutantes de bacterias patógenas.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Doce nuevas copias de la PA14NR se replicaron utilizando el Protocolo I y una evaluación de control de calidad de los ejemplares nuevos generados fue realizado usando Protocolo III.
PA14NR Set mutantes placas junto con el Control de placas, que consisten en de tipo salvaje PA14 inocularon y sin inocular pozos intercalados en un patrón preestablecido (Figura 4A), se replicaron siguiendo la metodologí.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El P. aeruginosa PA14NR se encuentra un recurso valioso para la comunidad científica. Según el conjunto de datos marzo de 2017 de base de datos de indicadores fundamentales de la ciencia Clarivate Analytics, Liberati et al. (2006) ocupa el puesto 37, que describe la construcción del Set del PA14NR, en el 1% de las publicaciones de Microbiología. Google Scholar reporta más de 600 citas de Liberati et al. (2006) el manuscrito original a partir de agosto de 2017. L.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no divulgan conflictos de intereses financieros. Eliana Drenkard y Frederick Ausubel participan en la creación de la biblioteca mutante PA14 transposon no redundante. Bryan Hurley y Lael Yonker actualmente de la casa y distribuyen la biblioteca mutante como parte del Departamento de Pediatría en el Hospital General de Massachusetts.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Lisa Philpotts de la Biblioteca Virtual de Treadwell de MGH para su orientación en la búsqueda de la base de datos. Este trabajo fue financiado por la Fundación de la Fibrosis Quística (YONKER16G0 y HURLEY16G0) y NIH NIAID (HBP y ADE: R01 A1095338).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales para la replicación en bibliotecas | |||
| Estéril de 96 pocillos Cultivo de tejidos tratado, caja de 50 | Corning Life Sciences | 353072 | via Fisher Scientific |
| Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μ L Placas de pozos profundos, caja de 25 | Corning Life Sciences | 3960 | via Fisher Scientific |
| Nunc OmniTray (placas rectangulares), caja de 60 | Thermo Scientific Rochester | 242811 | via Fisher Scientific |
| Ice Pan rectangular, Midi (4L) | Corning Life Sciences | 432104 | via Fisher |
| Scientific Secure-Gard Cone Mask, caja de 300 | Cardinal Health | AT7509 | via Fisher Scientific |
| AluminaSeal, paquete de 100 | Diversified Biotech | ALUM-100 | a través |
| de la membrana Breathe-Easy de Fisher Scientific, paquete de 100 | Diversified Biotech | BEM-1 | a través de Sigma-Aldrich |
| Estéril, envuelto individualmente, 50 ml de canal de solución/depósito de reactivos, caja de 100 | Sorenson | S50100 | a través de Westnet Incorporated |
| Rodillo de placa | VWR | 60941-118 | a través |
| de VWR Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", paquete de 16 hojas | GA International | RCL-11T1-WH | a través de Labtag.com (plantilla para impresión también disponible en Labtag.com) |
| replicador de 96 pocillos | V & P Científico, Inc. | Custom 407C, diámetro de pin de 3,18 mm, 57 mm de largo | a través de V & P Científico, Inc. |
| Multitron Pro, incubadora de agitación de 3 mm | Infors HT | l10003P | a través de Infors HT |
| Picus 12 canales 50-1200μ L Pipeta electrónica | Sartorius | 735491PR | a través |
| de las puntas de filtro Sartorius 50-1200μ L, paquete de 960 | Biohit | 14-559-512 | a través de Fisher Scientific; utilice puntas electrónicas compatibles con múltiples canales |
| Dry Ice | Proveedor específico del usuario | ||
| Materiales para el almacenamiento individual de mutantes | |||
| Fisherbrand Tubos de microcentrífuga premium: 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-130 | vía Fisher Scientific |
| Pipetas (P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | a través de Gilson |
| Materiales para el control de calidad PCR | |||
| microcentrífuga premium: 1,5 ml Fisher | Scientific | 05-408-130 | a través de Fisher Scientific |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | a través de ThermoFisher |
| PCR Thermocycler | |||
| Tubos de PCR Omnistrips con tapas abovedadas | Thermo Scientific | AB0404 | a través de Fisher Scientific |
| ART Boquillas de pipeta de baja retención ART Barrier (10 uL, 100 uL, 1000 uL) | Molecular BioProducts, Inc. | Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) | a través de pipetas Sigma-Aldrich |
| (P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | a través de Gilson |
| Fisherbrand Tubos de microcentrífuga premium: 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-130 | a través de Fisher |
| Scientific MasterKit de purificación de ADN puro | Epicentre | MCD85201 | a través de Epicentre Technologies Corp |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, listo para usar | Thermo Scientific | SM1333 | a través de ThermoFisher |
| RediLoad Loading Buffer | Invitrogen | 750026 | a través de ThermoFisher |
| Chemicals | |||
| Chemicals para almacenamiento de bibliotecas y mutantes individuales | |||
| Glycerol MB Grade, 1L | Sigma Aldrich | G5516 | a través de Sigma-Aldrich |
| LB Caldo | por 1 litro dH2O: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 1 ml de NaOH 1N (Protocolos actuales en biología molecular). Wiley, 1994.) | ||
| Triptona | Sigma Aldrich | T7293 | a través de Sigma-Aldrich |
| Extracto de levadura | Sigma Aldrich | Y1625 | a través de Sigma-Aldrich |
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S7653 | a través de Sigma-Aldrich |
| Hidróxido de sodio | Sigma Aldrich | S8045 | a través de Sigma-Aldrich |
| LB agar | Consulte la preparación anterior, agregue 15 g de Bacto Agar | ||
| Bacto Agar | Sigma Aldrich | A5306 | a través de Sigma-Aldrich |
| Gentamicin sulfato, 10g | Bioreagent | 1405-41-0 | a través de Sigma-Aldrich |
| Kanamycin sulfato | Gibco | 11815024 | a través de ThermoFisher |
| Ethanol, 190 proof | Decon | 04-355-221 | a través de Fisher Scientific |
| Chemicals for Quality Control PCR | |||
| Imprimaciones | Proveedor preferido por el usuario | Ver cebadores enumerados en la Tabla 3 | |
| Corning cellgro Agua de grado de biología molecular | Corning | 46000CV | a través de Fisher Scientific |
| Taq Polymerase | Buffer Invitrogen 10342020 | a través de ThermoFisher | |
| Taq DNA Polymerase, Invitrogen recombinante | 10342020 | a través de ThermoFisher | |
| dNTPs | Invitrogen 10297018 | via ThermoFisher | |
| Agarose | Sigma | A9539 | via Sigma-Aldrich |
Referencias
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39(2017).
- Bleves, S., et al. Protein secretion sy....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
