Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Summary

Se presenta un instrumento y métodos para la preparación de volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para microscopía electrónica de transmisión. No se requieren, evitando las consecuencias perjudiciales que esto puede tener para las proteínas, significativamente reducir la pérdida de muestra y que permite el análisis de lisado de proteómica visual única célula pasos papel-blotting.

Abstract

Debido a recientes avances tecnológicos, microscopia del cryo-electrón (cryo-EM) se está convirtiendo en un método estándar para el análisis estructural de complejos de la proteína a resolución atómica. Sin embargo, técnicas de aislamiento de proteínas y métodos de preparación de la muestra de EM siguen siendo un cuello de botella. Un número relativamente pequeño (100.000 a un par de millones) de partículas individuales de la proteína necesitan ser reflejada para el análisis de alta resolución de proteínas por la sola partícula enfoque EM, que hace la miniatura muestra manejo de técnicas y principios de microfluidos factible.

Se presenta un método miniaturizado, sin borrar los papeles EM red preparación para acondicionamiento previo de la muestra, EM grid cebado y procesamiento posterior que sólo consume nanoliter-volúmenes de muestra. El método utiliza un sistema de dosificación con precisión sub-nanoliter, absorción de líquidos de control y cebado de EM grid, una plataforma para controlar la temperatura de la red determinando la humedad relativa por encima de la rejilla de EM y un pick-y-caída-mecanismo para la muestra vitrificación. Para cryo-EM, se coloca una rejilla de EM en la etapa de control de temperatura y la muestra es aspirada en un tubo capilar. La punta del capilar se coloca cerca de la superficie de la rejilla, la rejilla está cargada con la muestra y exceso es nuevamente aspirada en el microcapillary. Posteriormente, la película muestra es estabilizada y un poco enrarecida por la evaporación controlada del agua regulada por la compensación de la temperatura de la plataforma respecto al punto de rocío. En un momento dado se activa el mecanismo de selección y penetración, transferir rápidamente la red EM preparada en etano líquido para vitrificación de muestra. Como alternativa, métodos de acondicionamiento de muestra están disponibles para preparar volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para tinción negativa (NS) EM.

Las metodologías en gran medida reducen el consumo de muestra y evitar los enfoques potencialmente dañinos a las proteínas, tales como la transferencia de papel de filtro utilizado en los métodos convencionales. Además, la minúscula cantidad de muestra necesaria permite nuevas estrategias experimentales, como muestra rápida acondicionado, combinación con lisis celular solo para "proteómica visual", o "lossless" preparación de la muestra total para el análisis cuantitativo de muestras complejas.

Introduction

Hardware y software para el análisis estructural de complejos de proteínas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) ha avanzado enormemente en los últimos años. Las mejoras allanaron el camino a una «revolución de resolución»^1,2 y cambiaron fundamentalmente la investigación estructural. La revolución comenzó con la llegada del cryo-Electrón microscopia (cryo-EM)^3,4, permitiendo la preparación de muestras biológicas bajo cerca de condiciones fisiológicas mientras que disminuye la sensibilidad de la radiación y la prevención de evaporación de la muestra en el alto vacío del microscopio electrónico de transmisión⁵. En los años siguientes, el progreso tecnológico incremental aumenta gradualmente la resolución alcanzable. Entre estas innovaciones fueron el uso de armas de emisión de campo^6,7y, más recientemente, mejorado los algoritmos de análisis de datos, tales como métodos de máxima verosimilitud^8,9. Directo del electrón detector cámaras^10,11,12,13, proyección de imagen de modo de película y acompañamiento software desarrollos^{14,15, 16 , 17}, proporcionada el avance final necesario para lograr la resolución atómica de muestras biológicas por análisis de partículas individuales (para una revisión véase Cheng, Grigorieff, et al. ¹⁸). la importancia de cryo-EM fue recientemente reconocida por la concesión del Premio Nobel de química a tres de los pioneros.

Para imagen de una muestra biológica por TEM, el método usado para cargar la cuadrícula de la EM con la muestra (en lo sucesivo como "preparación de la red") debe asegurarse de que la capa resultante de la muestra (i) es lo suficientemente delgada (< 100 nm) evitar el gran ruido por inelástica o multiplicar dispersos electrones, (ii) soporta el alto vacío del microscopio electrónico, y (iii) protege las biomoléculas de daño de la radiación. Se utilizan dos métodos principales para cumplir con estos requisitos previos: Tinción negativa(NS)^19,20 procedimientos (figura 1A) absorber la muestra a una película de carbón fino, incrustar las biomoléculas en heavy metal amorfo y luego Deje que el conjunto se seque en el aire. Esto es sencillo y rápido, y las rejillas cargadas de EM (en lo sucesivo como "redes de muestra") son fáciles de almacenar y puede conservarse durante largos períodos de tiempo (generalmente años). En TEM, las preparaciones exhiben alto contraste debido al NS y toleran dosis más altas del electrón que cryo-preparaciones, pero la resolución se limita a aproximadamente 20 procedimientos Å. Cryo-EM (figura 1B) emplean carbón perforado apoya. Una capa delgada de la solución de la muestra se atraviesa a través de los agujeros y la red de la EM se sumerge en un cryogen, etano generalmente licuado, para enfriarla rápidamente por debajo de-150 ° C. El resultado es un amorfo, vitrificados, 50 a 100 nm de espesor película de la solución en los orificios de soporte. Esta película delgada, amorfa resiste el alto vacío en el microscopio electrónico y, en el caso ideal, conserva estructuras biológicas en su estado nativo. El procedimiento permite muestras biológicas ser fotografiada en alta resolución. Sin embargo, la cuadrícula muestra debe mantenerse a temperaturas por debajo-150 ° C en todo momento para evitar la desvitrificación. Puede ser reflejada con dosis de electrones relativamente alta debido a la baja temperatura, pero el contraste y la relación señal a ruido sin embargo es baja. Por lo tanto, técnicas de promediación son empleadas para aumentar el contraste y, siempre y cuando la muestra es reflejada desde diferentes ángulos, se puede reconstruir alta resolución mapa tridimensional (3D). Los más utilizados y exitoso método de reconstrucción 3D a partir de ahora es la sola partícula. Para una revisión reciente, véase Cheng en otros¹⁸.

Tinción negativa de TEM (NS-EM) es importante para la detección y control de calidad, cuando se necesita alto contraste o sólo una cantidad limitada de muestra está disponible (adsorción a la película de carbón generalmente concentra la muestra). Sola partícula cryo-EM es el método estándar de oro si reconstrucciones 3D de alta resolución de la estructura de la proteína están destinadas.

Figura 1: principios de TEM red preparación y comparación entre el clásico (panel A, B) y un enfoque de microfluidos (panel C, D). A) preparación de red NS-EM clásica: sobre 3 μl de la muestra se pipetea a mano sobre una rejilla de EM recubierta por una película de carbono continua (en lo sucesivo como una 'red de NS-EM') (i). Después de la incubación para aprox. 10 s, papel de filtro se utiliza para secar lejos el exceso de líquido de la parte (ii), dejando las biomoléculas adsorbidas en una película fina de agua. Posteriormente, la proteína es incubada en una solución de sal de metales pesados, por ejemplo, acetato de uranilo 2%, durante 20 s (iii) y otra vez el líquido se quita frotando de un lado con papel de filtro (iv). Finalmente, la red de la EM se deja para secar en el aire. B) preparación de rejilla clásica cryo-EM: acerca de 3 μl de la muestra se pipetea a una mano en una película de carbón perforado. Para formar una película fina de la muestra, se retira el exceso de líquido por un papel borrar cara de uno o ambos lados (ii). Finalmente, la red se sumerge rápidamente en etano líquido para vitrificar (iii). C) preparación de red NS-EM mediante la configuración de cryoWriter: volumen A 5 nL se aspira desde la población de la muestra utilizando un microcapillary (i). Para la muestra de acondicionamiento, la punta de microcapillary se sumerge en la solución de acondicionamiento, por ejemplo, acetato de amonio 2%. Iones y moléculas pequeñas se intercambian por difusión (ii). Tenga en cuenta que las dimensiones de la microcapillary garantizar que todo el proceso es por difusión. Proteínas tienen mucho menor constantes de difusión de los iones de sal y no se pierdan significativamente²⁴. Finalmente, la muestra se suministra a la red y deja secar (iii). D) principios de preparación de red cryo-EM mediante el método basado en la cryoWriter: EM un recubiertos por una película de carbón perforado se coloca en la superficie de una plataforma de control de temperatura y sostenido por pinzas. La temperatura de la plataforma es controlada en un desvío de la temperatura de punto de rocío del ambiente de red. La red se mueve en relación con la microcapillary que contiene la muestra y el microcapillary se baja hasta unos pocos micrómetros por encima de la red. Posteriormente, se dispensan unos nanolitros de muestra de él mientras el escenario se mueve en un patrón espiral; exceso de líquido es nuevamente aspirado (i). Después de red EM cebado, se retira el microcapillary y la red sigue siendo en la plataforma controlado de temperatura (posteriormente conocida como etapa de punto de rocío (DP)) por un corto tiempo permitir que una cantidad controlada de la muestra se evapore. Para inmersión de congelación, la rejilla es rápidamente retirada de los escenarios usando las pinzas (ii), girada 90 ° en posición vertical y sumergida en un baño de criógeno (iii) (en lo sucesivo como mecanismo de selección y el descenso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Desafortunadamente, los métodos de preparación de red utilizados para NS y cryo-EM no han mejorado significativamente desde que se inventó. Inconvenientes actuales son el consumo de alto (aprox. 3 μl de proteína 1 mg/mL) y perdida de la gran cantidad (> 99%) de la muestra (figura 1A, B). Además, el método clásico utilizado para preparar las rejillas para cryo-EM es un áspero procedimiento para proteínas: en primer lugar, se trata de un extenso frente papel-blotting paso (figura 1B, ii), y, en segundo lugar, se expone la proteína a la interfaz aire-agua para una cantidad significativa de tiempo²¹. Aquí, se presenta un método alternativo para el acondicionamiento previo de la muestra, preparación de la red de muestra y procesamiento posterior (rejilla de secado o vitrificación) NS-EM (figura 1C) o cryo-EM (figura 1D). La configuración de construcción interna, llamada "cryoWriter", utiliza miniatura muestra manejo de principios de la tecnología y microfluídicos para aspirar, condición y dispensar la muestra, papel evitando borrar completamente y proporcionar métodos alternativos a las muestras finas para Cryo-EM. Significativamente reduce el consumo de muestra y mejora el control de usuario sobre preparación de la muestra en su conjunto. Además, el método permite aplicaciones experimentales novedosas; como la preparación de componentes biológicos aislados de células individuales en un enfoque llamado "célula proteómica visual"^22,23,24,25.

Protocol

Un "cryoWriter" (figura 2; para los detalles vea anterior trabajo^24,26,27) o instrumentación equivalente se requiere de los siguientes protocolos. Se da una lista de proveedores de las principales piezas y consumibles en la Tabla de materiales.

1. negativa preparación de rejilla de mancha (NS)

1. En el instrumento y el software. Inicializar todos los módulos necesarios (controlador de bomba de jeringa, etapas motorizadas, cámaras de vigilancia y fase de punto de rocío).
2. Enfriar el soporte de la muestra y la fase de punto de rocío. Si es necesario, asegúrese de que está regulada la temperatura punto de rocío en etapas 1-2 ° C por encima del punto de rocío.
   Nota: El escenario es enfriado mediante un dispositivo Peltier comercial con un controlador PID.
3. Preparar NS llenando un 100 o 200 μL PCR tubo con 100-150 μL de NS (p. ej., tungstato de metilamina 2% disponible comercialmente). Coloque el tubo en el soporte de la muestra refrigerada del instrumento.
4. Posición de la muestra.
   1. Coloca la muestra (0.5 - 1 μm) en un tubo PCR de 100 o 200 μl. Si se dispone de menos de 50 μl de muestra, corte la parte inferior de un tubo PCR con una cuchilla de afeitar y usarlo como una muestra bien. Esto asegurará que el microcapillary puede llegar fácilmente a la muestra.
      Nota: Es más fácil aspirar muestras de 100 o 200 μL PCR los tubos, ya que el microcapillary utilizado más adelante para aspirar la muestra es ligeramente inclinada y la dirección del eje z viajes-altura es limitada.
   2. Coloque el tubo PCR/contenedor en el soporte de la muestra refrigerada en el instrumento para evitar la evaporación. Alternativamente, las muestras pueden ser aspiradas de placas de pozos en el microscopio etapa superior la incubadora a temperatura ambiente; de enfriamiento no está implementado para las placas bien.
5. Definir posiciones. Use el joystick de cryoWriter que controla la fase xy motorizado y botones de control de software para el lineal x, y y etapas de la z a la posición de la microcapillary. Utilice la cámara para comprobar la posición del tubo capilar.
   1. Hacia la microcapillary el depósito de la muestra. Sumerja la punta en el líquido de la muestra y guardar esta posición como "muestra".
   2. Mover la microcapillary para el tubo de PCR NS, sumerja la punta en la solución de NS y guardar esta posición como "mancha".
   3. Coloque el microcapillary aproximadamente 100 μm encima del centro de la ranura donde la red de la EM se posicionará y guardar esta posición como "grid_save".
6. Aspirar la muestra y condición para NS-EM.
   1. Si no ya instalado, instale una jeringa de 10 μl (0,46 mm de diámetro interior) en una bomba de jeringa de precisión.
   2. Pegue un extremo de un microcapillary de sílice fundido largo 30 cm (diámetro exterior 360 μm, diámetro interior 150 μm) a la salida de la jeringa.
   3. Conecte el otro extremo de microcapillary a un corto (5 cm) largo cónico microcapillary vía el conectador de la presión. La punta cónica de la microcapillary corto forma la punta dispensadora.
   4. Llene la jeringa con agua doble destilada desgasificada (ddH₂O; líquido sistema) y evitar la formación de burbujas de aire.
   5. Dispensar unas pocas decenas de nanolitros de líquido del sistema y eliminar las gotas de la microcapillary con un paño libre de pelusas.
   6. Haga doble clic en la posición de la muestra guardada. Esto coloca el microcapillary en la muestra bien. Mientras que el capilar se está moviendo, dispensar 3 x 0,5 nL de líquido del sistema justo antes de la punta microcapillary se sumerge en la muestra para evitar que la burbuja de aire está atrapado allí (ver Nota 2 abajo).
   7. Aspire 5 nL de muestra.
   8. Haga doble clic en la posición guardada de NS. El microcapillary se retira del recipiente de la muestra y se trasladó al depósito NS automáticamente. Mientras que el capilar se está moviendo, dispensar manualmente 3 x 0,5 nL de líquido de la muestra justo antes de que la punta se sumerge en el depósito para asegurarse de que no hay ningún aire de burbujas (ver Nota 2 abajo).
      Nota: importante: (1) cuando se cambia de aspiración a modo de dispensación o viceversa, hay una pequeña pérdida en el movimiento del pistón debido a reacción en los engranajes de la bomba de jeringa. Según el fabricante, la reacción de una nueva unidad se encuentra entre 7 y 12 μm. Para nuestra jeringa de barril de 0.46 mm de diámetro, esto se traduce en nL 1-2. Por lo tanto, nL 1-2 puede ser "dispensadas", antes de que realmente se distribuye la muestra. Generalmente, una pequeña gota empieza a salir la punta de microcapillary después de la tercera 0,5 nL dispensar paso. (2) una burbuja de aire atrapada por encima/por debajo de la muestra hacer dispensar menos precisa y evitar acondicionado muestra por difusión.
   9. Deje el microcapillary inmerso durante 3-12 minutos, dependiendo de la solución tampón de muestra y la geometría de la boquilla.
      Nota: Cuanto mayor sea la sal y fosfato de concentración en el búfer, más tiempo de inmersión necesario. NS (relativamente rápido) difunde en la toma de muestra mientras sales buffer (relativamente rápido) y proteína (mucho más lento) difuso hacia fuera. Esto reduce la concentración de sales buffer de la muestra evitando la cristalización cuando la red de carga seca. Además, fosfato tiende a formar un precipitado en combinación con el NS.
7. Preparar una cuadrícula y depositar una gota de la muestra condicionada.
   1. Mientras que la muestra está siendo condicionada, tome un pedazo de cinta adhesiva y un bloque PDMS y limpie la parte superior de los PDMS y retirar la cinta adhesiva para asegurar que no hay ningún polvo. Poner el bloque PDMS en una placa Petri.
      Nota: Nuevos bloques de PDMS son tomados de la sala limpia.
   2. Recoger cuidadosamente una rejilla (p. ej., Cu, 200 o 400 malla revestida con la película de Parlodion/C). Asegúrese de tocar solamente el borde de la rejilla con las pinzas. Coloque en el bloque PDMS limpio con la película de carbón hacia arriba.
   3. Lugar el bloque PDMS con la rejilla en un aire de descarga del resplandor y brillo la descarga de 20 s con 100 W de potencia a 0,4 mbar. Guarde la red en una caja de Petri cerrada. Tiempo de descarga de resplandor generalmente conducen a separarse más grande del volumen de muestra depositada en la red. Como resultado, la capa de mancha se convierte en más delgada (mancha más débil).
   4. 1 minuto antes de que el tiempo de inmersión, agarre la red de descarga de resplandor con las pinzas de cryoWriter. Asegúrese de que el electroimán se activa; Si no se activa el software. Montar la pinza en el electroimán y el tornillo manual de instrumental quirúrgico para alinear la rejilla plana en el escenario de punto de rocío, parte de película de carbono hacia arriba. Asegúrese de que está regulada la temperatura punto de rocío en etapas 1-2 ° C por encima del punto de rocío para reducir la tasa de evaporación después de carga la muestra.
   5. Finalizado el tiempo de inmersión, haga doble clic en "grid_save". Con seguridad se colocará la punta de microcapillary sobre la superficie de la rejilla. Llevar manualmente la punta microcapillary en contacto con la red. Levante la boquilla de 10 μm y colóquelo sobre el centro.
      PRECAUCIÓN: Algunas muestras que contienen detergentes tienden a subir a lo largo de la superficie externa de la microcapillary cuando el líquido se dispensa debido a la tensión de superficie baja. Es importante estar muy cerca de la superficie de la rejilla para evitar esas pérdidas.
   6. Dispensar 5 nL de muestra en la cuadrícula. En un día seco, cuando la rápida evaporación tiene lugar en la punta de microcapillary, uno puede dispensar también lentamente hasta que la muestra está en la punta y luego rápidamente la dosificación 5 nL.
   7. Retirar el microcapillary y deje la muestra condicionada secar lentamente en el escenario de punto de rocío (DP-etapa).
   8. Una vez que haya secado el punto de la muestra, retire la rejilla y almacenar a temperatura ambiente en una caja de rejilla o placa de Petri.
   9. Dispensar 500 nL de líquido del sistema de la microcapillary y retírela con un paño libre de pelusas. Enjuague el tubo capilar 5 veces con etanol, detergente o 1 M NaOH. Esto limpia el microcapillary lo que le permite ser utilizado con una muestra diferente.

2. crio red preparación

1. Para preparar el instrumento y la muestra, siga los pasos 1.1 a 1.5 que se describe anteriormente. Si NS no es necesario, omita los pasos 1.3 y 1.5.2. Para el tampón de muestra de intercambio o condición de la muestra para cryo-EM por diálisis, por ejemplo, para reducir la concentración del tampón de sales o para introducir aditivos (p. ej., trehalosa, detergentes) utilizan el tampón deseado en vez NS en los pasos 1,3 y 1.5.2.
2. Preparación de etano líquido en un contenedor cryo estándar.
   1. Monte la Copa etano, cryo cuadro titular y araña y llene el recipiente criogénico hasta el borde con nitrógeno líquido; por lo general requiere unos 200 mL. Espere unos minutos hasta que la taza de etano se haya enfriado y esté libre de nitrógeno líquido.
   2. Abra la botella de gas etano y lentamente deje que la corriente del gas en la taza de etano. Que se llenan de etano líquido hasta que el nivel 2-3 mm por debajo de la parte superior; Esto toma unos pocos minutos y requiere aproximadamente 5 mL de etano líquido.
   3. Tomar una caja de crio y colocarlo en una ranura libre en el recipiente criogénico.
   4. Quitar la araña, colocar la tapa de poliestirol en la parte superior y coloque el recipiente criogénico en el montaje en el cryoWriter.
3. Una red de EM de la descarga del resplandor.
   1. Tome un pedazo de cinta adhesiva y un bloque de polidimetilsiloxano (PDMS) y limpie la parte superior PDMS, aplicar y retirar la cinta adhesiva (quita polvo). Poner el bloque PDMS en una placa Petri.
   2. Escoge cuidadosamente una cuadrícula desde el cuadro de la cuadrícula. Asegúrese de tocar solamente el borde de la rejilla con las pinzas. Colocarlo en un bloque limpio de PDMS con la película de carbón perforado hacia arriba.
   3. Lugar el PDMS bloque con la rejilla en un plasma cleaner y limpia de plasma de la superficie de la cuadrícula (por ejemplo uso 75% H Ar/25%_2, potencia 50 W, presión 25 mTorr). Coloque el bloque PDMS con la rejilla de descarga de resplandor en una placa Petri.
4. Coloque la rejilla en el instrumento
   1. Tome la rejilla de descarga de resplandor con las pinzas de cryoWriter. Asegúrese de que el electroimán se activa; Si no se activa el software. Montar la pinza en el electroimán y utilice el tornillo de instrumental quirúrgico manual para alinear la rejilla plana en el escenario, parte de película de carbón encima.
   2. Haga doble clic en "grid_save". Ajustar la posición de microcapillary para que la punta es de aprox. 10 μm sobre la superficie de la rejilla. Asegúrese de que el microcapillary puede moverse libremente a través de la red sin tocar en cualquier lugar, si es necesario retira el microcapillary unos pocos micrómetros.
   3. Volver al centro de la rejilla y guarde la nueva posición como la "grilla".
      PRECAUCIÓN: Denominación correcta es obligatoria para el script de la macro trabajar.
5. Escritura cuadrícula muestra y congelación profunda.
   1. Ras el microcapillary con unas pocas decenas de nanolitros de líquido del sistema y eliminar las gotas de la microcapillary con un paño libre de pelusas.
   2. Iniciar el script de la macro. La macro realizará los siguientes pasos:
      1. Dispensar 5 nL (para eliminar burbujas de aire en la punta) y vaya a la posición de la muestra.
      2. NL aspirado 65 de muestra. Infundir 5 nL en el tubo de muestra. Este sistema de reacción y permitir escritura sincronizada, es decir., para garantizar ese suministro y etapa de inicio del movimiento a la vez.
      3. Mueva a la posición de "grid".
      4. Iniciar 'patrón de escritura', que hará que el microcapillary mover a través de la red, al mismo tiempo de dispensación 45 nL de muestra.
      5. Luego, hacia la microcapillary del centro de la red, bajar otro 10 μm y retirar el líquido sobrante de la muestra.
      6. Retirar el microcapillary y desactivar el electroimán. Esto libera el paso inicia y pinzas de congelación.
6. Las pinzas de agarre y suelte con cuidado el adaptador magnético desde el émbolo. Rápida transferencia de la red de la taza de etano en el recipiente criogénico que contiene la caja de crio y coloque la parrilla en una ranura libre.

3. unicelular lisado preparación

1. Preparar los microcapilares para la electroporación.
   Nota: Los microcapilares cónico (láser-tirado e inspeccionados) la silicona fundida tienen una capa de poliimida protección en el exterior, excepto la punta, donde se quema la capa durante el proceso de ahusamiento.
   1. Para cubrir los microcapilares con una capa conductora, montarlos en un ángulo de 45° en un carril del metal, con las puntas apuntando hacia arriba. Utilice una lámina de aluminio para proteger el extremo inferior (2 cm) de las puntas, como formas del polyimide sin recubrimiento el mejor sello con los conectores encajan empleados más adelante.
   2. Sputter depositar una capa pegajosa de 20 nm Ti/W y luego una capa de 200 nm de espesor de Pt.
2. Hacer la punta de microcapillary hidrofóbica.
   1. Preparar una solución de 1 M de 1-dodecanethiol en EtOH.
   2. Descarga del resplandor del microcapillary en el aire durante 1 min con 100 W de potencia a 0,4 mbar.
   3. Sumerja la punta de la microcapillary en la solución de 1 M de 1-dodecanethiol durante unas horas (idealmente durante la noche).
      Nota: Es mejor preparar consejos recién un día antes de su uso.
3. Instale un nuevo microcapillary.
   1. Retire el microcapillary de la solución 1-dodecanethiol, lave el exterior con etanol y enjuagar el interior con etanol utilizando una jeringa.
      Nota: Si no se dispone de ninguna microcapilares funcionalizados, rápidamente resplandor descarga la punta de un microcapillary y sumergirla en una gota de tratamiento de ventana de coche comercial, que es una mezcla de ácido sulfúrico y PDMS. La funcionalización hidrofóbica resultante no es tan buena como con 1-dodecanethiol, pero generalmente suficiente.
   2. Hienden su extremo sin recubrimiento con un cortador de tubo capilar.
      Nota: Un corte limpio es importante para un buen sello con el acoplamiento de prensa.
   3. Utilice un palillo de dientes para aplicar pasta de plata a la frontera aguda formada entre el vidrio y el recubrimiento de poliamida, cuando la capa de poliimida se quema por el láser durante tirar de capilar.
      Nota: Este refuerzo es necesario ya que la capa de Pt es muy débil en esta región, y conducción eléctrica puede romper fácilmente.
   4. Lavar el extremo del polyimide de microcapillary con acetona. Dejar una pequeña gota de acetona en el extremo e introdúzcalo en el orificio del conector press-fit. Aplique ligera presión para formar un buen sello.
4. Calibrar la posición de microcapillary.
   1. En el instrumento y el software como se describe en el paso 1.1. Además, inicializar la cámara del microscopio y el generador de funciones.
   2. Colocar un portaobjetos de microscopio de vidrio en el soporte de portaobjetos en el microscopio.
   3. Baje el microcapillary cerca del portaobjetos de cristal y centro sobre el objetivo del microscopio hasta que aparece en la vista de la cámara de microscopio. Utilice las etapas lineal x - y y-eje para colocar la punta de la microcapillary en el centro de la imagen. Luego baje lentamente la extremidad hasta que toque ligeramente el portaobjetos de cristal.
      PRECAUCIÓN: Elegir muy pequeños pasos (5 μm) hacia el acercamiento final. De lo contrario, puede dañarse la punta.
   4. Presione el botón "Calibrar la boquilla". Esto retrae el microcapillary 40 mm y conjuntos de esta posición como posición de inicio.
5. Preparación de estampado piezas PDMS y ITO se desliza
   1. Mezcla de PDMS y crosslinker en proporción 10:1, vierta en una placa de Petri grande a una profundidad de unos 2-3 mm. Cueza al horno a 60° C por unas horas en incubadora de hibridación o dispositivo similar.
   2. Con un martillo y un sello (12 mm de diámetro), corte los agujeros en la capa PDMS. Luego, utilice un bisturí para cortar 2 cm largo cuadrados o rectángulos, incluyendo los agujeros para obtener piezas estampadas que caben en un portaobjetos de microscopio. Generalmente, dos piezas estampadas se montan en portaobjetos de un microscopio.
   3. Lave las piezas PDMS y las diapositivas de ITO primero con detergente y luego con etanol al 70%. Colocarlos, mojado, en un plato de Petri y dejar que el etanol se evapora totalmente en un horno a 60° C.
   4. Resplandor-descarga las diapositivas de ITO durante 1 min con 100 W de potencia a 0,4 mbar y luego aplicar 1 mL de solución de recubrimiento (por ejemplo, poli-l-lisina (PLL)). Incubar por 5 min, retirar la solución con una pipeta y aplicar 1 mL de ddH₂o ligeramente agitar durante 1 minuto y retire el ddH₂O utilizando una pipeta. Deje que los portaobjetos se seca a 60° C.
6. Preparar el cultivo celular. Seguir el protocolo estándar de células adherentes cultivo (por ejemplo, Arnold, et al. ^{24 , 25}). las células de ITO de la semilla durante normal partir/pases.
   1. Una diapositiva de ITO recién revestido de PLL y añadir un trozo PDMS. Aplique algo de presión para formar un sello hermético. Esto produce pequeños pozos con la diapositiva como su base.
   2. Añadir 300 μL de células suspendidas en un medio fresco a los pozos PDMS. La densidad de siembra debe ser de alrededor de 75.000 células por pozo.
   3. Incubar los portaobjetos ITO durante 1-2 días bajo condiciones estándar.
7. Prepararse para el experimento de lisis de la célula:
   1. Precaliente unos mililitros del buffer de electroporación (p. ej., tamponada fosfato salino (PBS)).
   2. Preparar la instalación para la preparación de red NS-EM
      Nota: Los datos para la preparación de la configuración se muestran en pasos 1.1-1.5 (NS) o paso 2.1-2.4 (crio). Aquí describimos los pasos más importantes para la preparación de NS.
      1. Preparar NS llenando un 100 o 200 μL PCR tubo con 100-150 μL de NS (p. ej., tungstato de metilamina 2% disponible comercialmente). Coloque el tubo en el soporte de la muestra refrigerada del instrumento.
      2. Mover la microcapillary para el tubo de PCR NS, sumerja la punta en la solución de NS y guardar esta posición como "mancha".
   3. Cargar los parámetros estándar de lisis, por ejemplo, el voltaje de lisis.
   4. Tome la corredera de la ITO de la incubadora y montarlo en el inserto del microscopio. Utilice dos tornillos para fijar la corredera en el inserto de aluminio y para asegurar el contacto eléctrico entre la ITO de la diapositiva y el marco de aluminio conectado eléctricamente a tierra.
   5. Retire el medio de cultivo celular y lavar dos veces con 300 μL de buffer de electroporación. Mantener las células en buffer de electroporación.
   6. Coloque el inserto de aluminio sosteniendo el carro de ITO en la etapa de incubadora de células vivas en el programa de instalación.
   7. Localizar el cultivo celular en la vista del microscopio y escoge un área sin las células. Acercar la punta a la superficie de ITO y suavemente tocarla, luego retirar la punta 100 μm y guardar la posición como "células".
   8. Rápidamente deja la cultura de célula y enjuague la punta de microcapillary con unas pocas decenas de nanolitros de líquido del sistema y poner en cultivo celular otra vez. Dispensar unos nanolitros durante la inmersión en el pozo PDMS para asegurarse de que no hay aire burbujas quedan atrapadas en la punta.
   9. Acercar suavemente la superficie de ITO (inicialmente, debe estar en posición de "células", es decir., 100 μm sobre la superficie). Al entrar en contacto, retraer punta 10 μm.
   10. Seleccionar una celda cercana para la lisis. Coloque la punta de la microcapillary por encima de la celda objetivo.
8. Iniciar el script de la macro para sola célula lysis.
   1. Nombre de la posición de la microcapillary se debe mover a después de que una célula ha sido lisada con éxito. Se trata de la reserva de NS (NS-EM), un buffer de desalación (cryo-EM) o la red de la EM (cryo-EM). Evitar errores ortográficos y pulse 'Aceptar'.
   2. La macro procede sin intervención del usuario:
      1. i) el microscopio etapa y la célula cultura 100 μm se mueven a la izquierda, una instantánea de la celda objetivo es tomado y 50 nL de líquido de ddH₂O sistema están dispensados de la microcapillary. Esto desplaza y diluye el alta tampón salino y aplica presión osmótica a la célula.
      2. II) la etapa es vuelto a colocar la punta por encima de la celda objetivo otra vez. La explosión de tensión predefinida se aplica, y después de 500 ms el sistema de bomba comienza a aspirar 3 nL de muestra a un caudal de 2 μl/min.
      3. III) la etapa se mueve a la izquierda otra vez, permitiendo a la célula para ser inspeccionado. Aparece una ventana, pidiendo a la entrada del usuario.
   3. Decir si el paso de lisis fue exitoso o no.
      1. Si la respuesta es no, hacerse cargo, al ras de la microcapillary y una nueva celda de destino.
      2. Si la respuesta es sí, se toma una instantánea de la célula (sometidas a lisis) quitada, y luego el microcapillary se mueve a la ubicación especificada en 3.8.1. Si se trata de NS o un depósito tampón, use la interfaz de usuario estándar para despachar 3 x 0,5 nL de líquido mientras el microcapillary se está moviendo para asegurarse de que no hay ninguna burbuja de aire. La punta se sumerge en el líquido del depósito por la macro.
         Nota: Usted puede seguir acondicionar la muestra y preparar rejillas como se explica en las secciones 1.6.9 - 1.7.9 para NS-EM o sección 2.2-2.6 para cryo-EM. A continuación, se explican los pasos necesarios para la preparación de NS de la red.
   4. Deja la microcapillary inmerso de 8-12 minutos, dependiendo de la geometría del inyector
      Nota: La concentración de altos de fosfato en el búfer de requiere un tiempo de inmersión para el acondicionamiento.
   5. Dispensar 5 nL de la célula acondicionada lisada hacia la rejilla.
   6. Retirar la microcapillary y dejó la muestra condicionada seca lentamente en el escenario de punto de rocío (DP-etapa) regulado 1-2° C superior a la temperatura de punto de rocío.
   7. Retire la rejilla y almacenar a temperatura ambiente en una caja de rejilla o placa de Petri.

Results

La configuración de "cryoWriter" fue desarrollada (representado en la figura 2) para probar los procedimientos de preparación de rejilla de EM miniaturizados propuestos en la figura 1C, D. Figura 2 A muestra un resumen de los distintos componentes montado en un microscopio de fluorescencia inversa. Un módulo de cultivo celular se instala en el lado izquierdo del microscopio; un módulo para la preparación de la red de EM se encuentra a la derecha. El módulo de cultivo celular (figura 2B) permite el crecimiento de las células eucariotas adherentes y proyección de imagen de células vivas de la cultura de célula por microscopio de luz. Las células individuales son sometidas a lisis por la acción combinada de choque osmótico, electroporación y aspiración del contenido de la célula en un microcapillary (figura 2B, figura 6A)^24,25. La muestra aspirada lisada puede utilizarse entonces para preparar rejillas para NS - o cryo-EM. Como alternativa, una solución stock de la proteína en un tubo PCR puede ser el origen de la muestra. Microcapillary (figura 2B) empleado está conectado a un sistema de bomba de alta precisión que permite volúmenes de muestra se aspira y dispensa con precisión sub-nL. Como se detalla en los protocolos, todo proceso de la muestra se realiza dentro de este microcapillary o en la red eléctrica EM sin transporte de la muestra significativa. Por ejemplo, el mismo microcapillary se utiliza para lyse las células eucarióticas individuales, aspirar el lisado, condicionan y finalmente dispensar alícuotas sobre rejillas de EM. El módulo de preparación de red consiste en una DP-etapa movible que permite que la temperatura de la rejilla de EM a ser precisamente controlados (figura 2C). Para NS-TEM, la cuadrícula muestra preparada puede simplemente retirarse de la etapa fría y deja secar en aire a temperatura ambiente. Sin embargo, los llamados efectos de anillo de café que luego pueden resultar deban evitarse para TEM cuantitativa donde se cuentan 'partículas' de la proteína. Para ello, las rejillas se secan lentamente en la etapa de DP con un gradiente de temperatura progresiva para disminuir la evaporación de líquidos. Para cryo-EM, la temperatura de la rejilla se mantiene cerca del punto de rocío; se elige un desvío positivo de aproximadamente 8 ° C, lo que permite la evaporación controlada de líquido de la muestra para la estabilización de la película fina y adelgazamiento, que puede ser monitoreada por un sensor si es necesario²⁶. Después del tiempo seleccionado de adelgazamiento, se activa un mecanismo de selección y penetración y la muestra es vitrificada (figura 2C). Tenga en cuenta que este mecanismo de hundimiento no es necesario para la rejillas NS-EM, que se almacenan a temperatura ambiente.

Figura 2: Resumen de la configuración de cryoWriter. A) Resumen de la configuración de cryoWriter montado en un microscopio de luz inverso (1). B) margen de área indicado en el lado izquierdo en panel compartimiento cultivo celular A. (2), con un microcapillary (3) para lisis de manipulación y de la célula de muestra colocada sobre una placa de cultivo celular basada en PDMS miniaturizados (4). C) margen de área indicado en el lado derecho en mecanismo de panel a. 'Pick-y-caída'. Una cuadrícula de EM de película de carbón perforado (5) montada entre las puntas de unas pinzas (6) y en contacto directo con la etapa de control de temperatura (7), que se refiere como la etapa del punto de rocío (DP-etapa) en el texto principal en posición horizontal. La temperatura de la etapa bien se controla mediante un controlador PID y un elemento Peltier refrigerado por agua, manteniéndolo en o cerca de la temperatura de punto de rocío, según el ambiente. La DP-etapa (7) se monta en un eje xy motorizado para mover la rejilla con respecto a la microcapillary. El microcapillary sí mismo está montado sobre un escenario z y puede hasta que está muy cerca de la superficie de la rejilla de EM y utilizado para dispensar volúmenes nanoliter-tamaño en el soporte de la muestra que la cubre (una capa de carbón fino continuo para NS-EM o una película de carbón perforado para cr Yo-EM). Tenga en cuenta que absorción de líquido y distribución se realiza mediante un sistema de bomba de alta precisión (8). El líquido dosificado puede distribuirse mediante el movimiento de la rejilla con respecto a la microcapillary en un patrón espiral. Para la preparación de cryo-EM, el mecanismo de congelación de selección y penetración (9) transfiere rápidamente la cuadrícula muestra cargado en etano líquido (10) para un enfriamiento rápido y la vitrificación de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 3 muestra resultados representativos para redes NS-EM preparados utilizando la configuración de cryoWriter. La punta de la microcapillary fue cargada con 5 nL de muestra de una solución madre y sumergido en un tanque de solución NS (tungstato de metilamina 2%) durante varios minutos para permitir el intercambio difusivo de NS y los iones de la sal (para una discusión teórica ver Arnold, et otros ²⁴). luego, se suministra a la película de carbón fino de una cuadrícula de NS-EM y se secó la muestra condicionada. Figura 3 A muestra el uso de una red de la ranura de la misma manera a visualizar la gota completa, como sea necesario para TEM cuantitativa. Para evitar el efecto anillo de café, la red recién descargado de resplandor fue celebrada inicialmente a la temperatura de punto de rocío (no hay evaporación de agua) y luego se calienta lentamente en la etapa de DP. Tenga en cuenta que para la mayoría de las aplicaciones (por ejemplo, control de calidad de la muestra o el análisis estructural) este proceso de secado lento no es necesario. Alta calidad NS-preparaciones se obtienen sin ella, como se muestra en la figura 3B, C. Tiempos de acondicionado para los búferes de sal libre de fosfato y bajos son alrededor de 3 minutos, por ejemplo, con tampón Tris de sal (20 mM Tris-HCl pH 7.4 con 50 mM NaCl), como se muestra en la figura 3B con el virus del mosaico del tabaco (TMV) como muestra. Figura 3 C presenta el peor como el TMV en tampón PBS (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4). Los iones fosfato forman cristales transitorias con los iones de metales pesados de NS (ver figura 5C), alargando el tiempo de acondicionado requerido (7 min). Otras sales de metales pesados también pueden utilizarse con el módulo de preparación de la red, por ejemplo, 2% metilamina vanadato o amonio molibdato (véase también Arnold, et al. ²⁴). sin embargo, el acetato de uranilo no es conveniente; el efecto de la reticulación de este colorante conduce a agregados si la muestra de proteína está condicionada en la solución, antes de la adsorción de un carbón de cine (ver figura 5E)²³.

Figura 3: resultados típicos para las rejillas de NS con la configuración de cryoWriter como se indica en la figura 1C. A) imagen del Resumen de una gotita de nL 3 dispensados en una cuadrícula de ranura después de condicionar con tungstato de metilamina 2%. B) TMV en 20 mM de tampón TRIS. El recuadro muestra una ampliación de 3 x de la región indicada. Adaptado de Arnold, et al.²⁴ (más permisos relacionados con el material extraído deben orientarse a la AEC). C) virus del mosaico del tabaco (TMV) en tampón PBS. El recuadro muestra una ampliación de 3 x de la región indicada. Adaptado de Arnold, et al.²⁴ (más permisos relacionados con el material extraído deben orientarse a la AEC). Barras de escala: A, 100 μm; B, 50 nm; C, 80 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados típicos obtenidos para rejillas de cryo-EM preparadas utilizando la configuración de cryoWriter se representan en la figura 4. Grupo 4A muestra un atlas de la cuadrícula del área cubierta por la muestra vitrificada. Grupo 4B muestra la homogeneidad del hielo vítreo en una ranura de la rejilla seleccionada. En ambos casos, la muestra fue en 25 mM HEPES-KOH de pH 7.5, 50 mM de tampón NaCl que contiene 0,05% Fos 14 detergente. Se probaron muchas muestras y tampones y obtuvo un hielo vítreo de alta calidad comparables, pero las condiciones requeridas son buffer dependiente (véase también discusión de la figura 5). Panel 4C muestra partículas de apoferritina y un bacteriófago en tampón Tris-HCl (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.4) reflejada en el alto desenfoque para aumentar el contraste. Panel 4D muestra una proteína de membrana de 200 kDa estabilizada por amphipoles.

Figura 4: resultados típicos para las rejillas de cryo-EM con la configuración de cryoWriter como se indica en la figura 1D. Las muestras y los almacenadores intermediarios varían en los ejemplos mostrados. Todas las muestras fueron cargadas sobre películas de carbón perforadas. A) Collage de imágenes de resumen ("atlas de la red") de una muestra que contiene una proteína de membrana de 150 kDa, la periferia del hielo vítreo está indicada por flechas blancas. B) agrandado ranura de red de una red con el mismo buffer, que muestra la película de carbón perforado con hielo vítreo. Algunos agujeros no están llenos de solución tampón de muestra según lo indicado por flechas blancas. C) agujero de carbono vitrificado muestra que contiene complejos de la proteína apoferritina y bacteriófagos. Recuadro: ampliación de doble mostrando la cola de un bacteriófago. El asterisco blanco indica que la película de carbón. Tenga en cuenta que la imagen se registró con gran desenfoque para aumentar el contraste. D) A 200 kDa proteína de membrana reconstituida en amphipols. Recuadro: una 2 x ampliación de la región indicada que se muestra con mayor contraste. Barras de escala: A, 100 μm; B, 10 μm; C y D, 80 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La configuración de cryoWriter permite sistemática de óptimas condiciones de preparación de EM de la red; un ejemplo se muestra en la figura 5A (apoferritina en 25 mM HEPES-KOH de pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% Fos 14). En este experimento, el hielo vítreo "adelgazamiento" de temperatura es variado, pero el tiempo de vaciado (es decir, la brecha de tiempo entre la aplicación de ejemplo y congelación profunda) se mantuvo constante (1 s). A baja temperatura compensada (por ejemplo, 8 K), la capa de la muestra era demasiado gruesa. En temperaturas más altas el offset, el hielo vítreo en los agujeros era más delgado (10 K, 12 K), hasta que en algún momento (sobre 18 K) la red se convirtió totalmente seco (no se muestra). En los resultados presentan aquí, un desvío de 12 K conducen a un área homogéneo de hielo vítreo según lo indicado por las flechas negras. Tales experimentos de optimización se pueden realizar con el buffer de la muestra objetivo utilizando proteínas de "prueba" (como la apoferritina). Las mejores condiciones se aplican a la muestra objetivo. Además, rejillas con parámetros muy lejos de la óptima pueden a menudo ser reconocidas durante el procedimiento de preparación y no es necesario que se proyectarán en el microscopio electrónico, ahorro de tiempo significativo. Figura 5 también muestra una galería de típico cryo-EM (Panel B) y NS-EM (paneles C a E) artefactos específicos a la configuración de cryoWriter. La red de cryo-EM que se muestra en el Panel 5B con TMV en PBS con un 0.1% decyl-β-D-maltopyranoside (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, 136,9 mM NaCl, pH 7,4, 0.1%DM) fue adelgazada excesivamente. El fondo de la imagen es granulado porque la concentración de sal llegó a ser demasiado alto. En general, el aspecto visual de una muestra no parece ser una función lineal de la concentración de sal; granos de repente prominentes cuando se alcanza una concentración umbral durante el proceso de adelgazamiento. Tenga en cuenta que sustancias no deseadas pueden eliminarse con un paso de acondicionamiento antes de la preparación de la red, como se describe para NS-EM en protocolo sección 1.6. NS puede causar otros artefactos. En el ejemplo mostrado en el Panel 5C, tampón PBS (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7.4) sin muestra de fue de tungstato 2% metilamina para precipitados de 3 minutos y los cristales son evidente y ejercen fuerzas extensas en la superficie de carbono lleva a grietas. La única forma de precipitados en una concentración de PBS y NS de la gama y puede evitarse mediante el acondicionamiento de la muestra para más (Comparar figura 3C). Panel 5D muestra la periferia de una gota de muestra NS dispensada exhibiendo un "anillo de café". Esto perturbaría el análisis de la muestra cuantitativa, total y por ralentizar el proceso de secado, es decir, mantener la red de EM a la temperatura de punto de rocío durante la aplicación de ejemplo, y luego poco a poco aumentando la temperatura para secar (se puede evitar Ver figura 3A). 5E panel (apoferritina en 20 mM HEPES, pH 7.0, acondicionado 3 min) muestra la actividad de la reticulación de mancha de acetato de uranilo 2%, que no puede utilizarse para muestras de proteína condición antes de que se fijan por adsorción a soportes de película de carbón.

Figura 5: cambios sistemáticos y artefactos observan cuando se utilizó la configuración de cryoWriter para preparar rejillas para NS - y cryo-EM. A) variación de espesor del hielo vítreo sistemática; optimización de la preparación de la red para cryo-EM. La temperatura compensada de la DP-etapa fue variado (8 K a 12 K) mantener el adelgazamiento constante de tiempo (1 s). Las flechas indican la periferia de la capa de la muestra. B) sal efectos; es decir, el paso de adelgazamiento demasiado altamente concentrado, era demasiado largo. El recuadro muestra una ampliación de 2 x de la región indicada. C) sal precipitados formados por tampón PBS en presencia de sales de metales pesados. Muestras con tampón PBS deben estar condicionadas ya que las muestras en otros búferes. Aquí, tampón PBS sin muestra estaba condicionado en tungstato de metilamina 2% por 3 min, un tiempo típico para otros buffers de muestra. Nota el crack en la película de carbón probablemente debido a las fuertes fuerzas de los precipitados actuando con el apoyo delgado durante el proceso de secado. D) efecto de "Anillo de café". E) acondicionado en acetato de uranilo 2% por 3 minutos Uranyl iones exhiben actividad significativa reticulación y la apoferritina de apoferritina grupos formar grandes agregados. Barras de escala: A, 80 μm; B, C de nm 80, 12 μm; D, 80 μm; E, 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La pequeña cantidad y el volumen requerido para la preparación de la red de EM mediante la configuración de cryoWriter permite nuevos tipos de experimentos. Por ejemplo, el contenido total de una sola célula puede recogido y preparado para NS - y cryo-EM. El procedimiento se indica en la figura 6A. Una célula eucariota, adherente (HEK 293) es lisada por electroporación simultánea y muestra aspiración (grupo 6A)²⁵. Un volumen total de 3 nL se aspira, que contiene el lysate de la célula y se conserva en el microcapillary para su posterior procesamiento. Para el NS-EM que se muestra en el Panel 6B, el medio de cultivo celular se intercambió con tampón PBS (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, Na₂HPO₄·7H2O de 8,9 mM, pH 7,4) antes de la lisis celular. El contenido de la celda fueron aspirado en 3 nL de tampón y acondicionado en un reservorio de NS como se indica en la figura 1C durante 10 minutos después, un volumen 5 de nL fue en la película de carbono continua de una cuadrícula de NS-EM. Proteínas individuales, por ejemplo, actina filamentosa y parches de membrana con las proteínas adjuntos pueden reconocerse en la imagen. Para la cryo-EM, se muestra en la figura6C, un volumen de 3 nL se dispensó en una rejilla de carbón perforado EM sin volver a aspiración para eliminar el líquido. La película gruesa de muestra formado extensivamente fue adelgazada antes de vitrificación. Para ello, la temperatura de la etapa de DP fue aumentada gradualmente, a partir de la temperatura de punto de rocío. El proceso de adelgazamiento fue monitoreado por un sistema de sensores en tiempo real hasta que se llegó a un umbral preespecificado desencadenando el mecanismo de selección y el descenso y vitrificación de la muestra (para detalles ver Arnold, et al. ²⁶). estructuras de la membrana y las proteínas pueden reconocerse en la imagen.

Figura 6: sola célula proteómica visual utilizando el montaje de cryoWriter. A) lisis de una sola célula eucariota adherente. La célula se cultiva (1, verde) en un funcionalizados, ITO revestido (rojo)-portaobjetos de vidrio (2) en un plato de petri miniaturizados (3)²⁵. La capa de ITO es eléctricamente a tierra. La célula es aborda por el microcapillary (4), que está recubierta con platino. Se da un choque osmótico inicial (no indicado) para facilitar la lisis, que se realizaron por una serie de impulsos eléctricos y por las fuerzas de esquileo ejercidas durante la aspiración de la celda lisada. El proceso puede ser monitoreado por microscopia ligera; el objetivo del microscopio esté indicado (5). Para más detalles, véase nuestro anterior trabajo^24,25. B) imagen NS-EM de lisado de una célula de HEK 293 individual. Filamentosos actina y membrana con proteínas adjuntas están visibles. Panel adaptado de Arnold, et al.²⁴ (más permisos relacionados con el material extraído deben orientarse a la AEC). C) imagen de Cryo-EM de lisado de una célula de HEK 293 individual. El recuadro muestra una ampliación de 2 x de la región indicada donde son visibles las estructuras típicas de la membrana con las proteínas asociadas. Panel C adaptado de Arnold, et al. ²⁶ barras de escala: B, 50 nm; C, 80 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El instrumento de 'cryoWriter' y los protocolos necesarios para preparar rejillas muestra para NS - y cryo-EM desde volúmenes de nL tamaño total de la muestra y evitar por completo el paso de borrar papel clásico se presentan. Principios de microfluidos y un sistema de Micromecánica se combinan en el cryoWriter para hacer esto posible.

Nuestra experiencia demuestra que cuando se utilizan los métodos miniaturizados presentados en este manuscrito, el espacio de parámetros para la preparación de EM de la red es mayor que para los métodos clásicos y bajo un control de usuario. Lo importante, la mayor reproducibilidad alcanzada permite preseleccionar con sistema de buffer de muestra, complementada con una proteína de prueba disponibles, para determinar los parámetros óptimos antes de realiza el experimento real. Esto mantiene el consumo de la muestra de interés para el absoluto mínimo y es muy recomendable. Pasos críticos para ambos preparación de red NS - y cryo-EM son: (i) cebado del sistema de la bomba; para sub-nanoliter volumen dispensado, el líquido del sistema (agua) debe ser desgasificada y bubble gratis. (ii) preciso control de la descarga del resplandor o plasma limpieza paso; las características de la superficie de la rejilla de la EM son cruciales para obtener resultados reproducibles. (iii) acondicionamiento de muestra; el tiempo necesario para el acondicionamiento, por ejemplo, con el NS, depende el tipo de buffer, contenido de sal y concentración (figura 3), así como en la geometría de la boquilla de la microcapillary²⁴. (iv) las tasas de evaporación preparados NS-EM para EM cuantitativa; el efecto anillo de café puede prohibir los análisis cuantitativos de los preparados de NS-EM y debe ser suprimido por las tasas de evaporación lenta controladas por la etapa de DP.

Diferentes aspectos de los métodos de preparación de red presentadas pueden combinarse libremente permitiendo el desarrollo de protocolos versátiles para muestras específicas. Ejemplos típicos serían la eliminación de una sustancia que previene la EM de alta resolución, por ejemplo, glicerol, de un paso de acondicionamiento antes de la preparación de la red para cryo-EM; la introducción de moléculas de mediador, como ligandos, por acondicionamiento antes de las rejillas están preparadas; o el examen de unicelular lisado por NS - o cryo-EM (figura 6).

El uso de la microfluídica y cantidad de muestra mínima en los métodos presentados completamente elimina la necesidad de medidas de papel-blotting. Esto es una gran ventaja, porque borrar del papel es un tratamiento duro para proteínas, potencialmente contaminando la muestra con los iones no deseados e intrínsecamente conduce a la pérdida de muestra masiva. Por otra parte, efectos potencialmente causados por la interfaz de aire y agua de la película muestra delgada que se forma cuando se preparan muestras de cryo-EM en la forma clásica no se evitan cuando se utiliza el cryoWriter. Rejillas adecuadas para cryo-EM se pueden preparar con un menos de 0,2 s tiempo de espera entre la aplicación de la muestra y la vitrificación (datos no mostrados). Sin embargo, las proteínas viajes de unas pocas décimas de un nanómetro en unos nanosegundos por difusión, todavía hay tiempo suficiente para que puedan chocar con la interfaz aire agua de una película de espesor de la muestra 100 nm varias veces. Sin embargo, la cantidad de proteínas que se pega a la interfaz aire-agua puede reducirse significativamente estas brechas de corto plazo y podría impedir la desnaturalización de la proteína o restringido la orientación de la partícula. Otro enfoque prometedor que podría proteger las proteínas sensibles desde la interfaz aire agua es cubrir la película muestra por sustancias tensoactivas de bajo peso molecular. Estos compuestos podrían introducirse rápidamente por un paso de acondicionado en el cryoWriter antes de la preparación de la red. La alta relación superficie a volumen de sistemas microfluídicos es otra limitación de la cryoWriter, como muestra se puede potencialmente perder por adsorción no específica a la superficie microcapillary y perturbar el análisis cuantitativo por conteo de partículas. El problema es abordado de dos maneras: en primer lugar, la muestra no viaja largas distancias dentro de la microcapillary. De hecho, el volumen de muestra nanoliter sigue en la punta del capilar durante el proceso. En segundo lugar, la superficie al cociente del volumen es reducida aún más utilizando microcapilares con diámetros interiores relativamente grandes, por ejemplo, 180 μm. en tercer lugar, las superficies de los microcapilares pueden fácilmente apaciguadas si es necesario, por ejemplo, tratándolos con glicoles de etanol polylysine comercialmente disponibles (PLL-PEG).

El análisis de alta resolución de proteínas por el enfoque de la sola partícula utilizado en EM sólo requiere 100.000 a unas imágenes de millones de partículas de proteínas individuales. Esto significa que técnicas microfluídico pueden proporcionar bastante complejos para la investigación estructural. Se desarrolló un método de inmuno-precipitación miniaturizado para el aislamiento rápido de complejos de proteínas (alrededor de 1 hora) de cantidades mínimas de la célula (aprox. 40.000 células) anterior²⁸. Este método ahora se vinculará directamente a la etapa de preparación de muestra miniaturizada de la cryoWriter. El objetivo final es desarrollar un gasoducto microfluídico integrado para proteína ultra rápido aislamiento y cryo-EM red preparación que requiere menos de dos horas en total. Además, como lo demuestra la figura 6, la pequeña cantidad y volumen de material necesario para la preparación de la muestra y el acondicionado casi sin pérdidas y procedimiento de preparación de red consigue utilizando el cryoWriter, que permiten estudiar la proteína complejos de células individuales. Juntos, el método de inmuno-precipitación miniaturizados y la cryoWriter establecer los cimientos de un nuevo método de proteómica llamado "célula visual proteómica", como recientemente hemos demostrado por experimentos de choque térmico²⁴. Algoritmos de análisis de datos para el análisis de imágenes de la "proteómica visual" se están probando.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manejo de líquidos
Punta microcapilar	Nuevo objetivo	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 µ m ID de la punta, 100 y micro; m ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	Puntas de sílice 30 y micro; m ID de la punta, 150 y micro; m ID , pk. 20
Manguito conductor	Nuevo Objetivo	CONGAS-1	Elastómero conductor para contacto de alta tensión, 12" de largo
Tubo de sílice fundida	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Tubo FS estándar, 150 y micro; m ID, 363 y micro; m OD, 5 metros
Conector PressFit	BGB-Analytik	2525LD	Deact. Conector PressFit de 0,25 a 0,25 mm de diámetro interior, pk. 25
Jeringa 10 y micro; l	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT - Punta Luer (aguja no incluida)
Controlador de bomba de jeringa	Cetoni	A3921000093	controlador neMESYS
Unidad de dosificación de bomba de jeringa	Cetoni A3921000095		unidad de dosificación neMESYS
Sensor de punto de rocío
	Meltec	UFT75-AT Sensor de	humedad/temperatura, cálculo del punto de rocío, USB y DLL integrado
Temperatura sensor	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L sensor de	temperatura de montaje en superficie Pt1000
Controlador Peltier	Cooltronic	TC2812	Regulador de temperatura PID para la activación de sistemas accionados por Peltier con salida de tensión constante
Elemento Peltier	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S Bloque de	40x40 mm
	-	-	Bloque de refrigeración por agua para elemento peltier de 40x40 mm, base de cobre
Bomba de agua	Digitec.ch		294877 XSPC X20 750 Bomba de depósito dual de 5,25 bahías Bloque
de intercambiador de calor de agua	-	-Bloque de	intercambiador de calor de agua con 2 ventiladores para enfriar el agua circulante
Enfriadores de agua pequeños	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram edición cobre 2 piezas
Elementos peltier pequeños	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 ° C, 2 piezas
Mecánica
Etapa lineal eje z	Dyneos AG	M-404.2PD	Platina de traslación de precisión de alta carga, rango de recorrido de 50 mm, motor de CC
Controlador de etapa	Dyneos AG	C-863	Mercury Servocontrolador
de mercurio etapa de eje XY	Prior Scientific H117EIL5 Etapa		motorizada para Zeiss Axiovert 200 Microscopio invertido
Imanes permanentes pequeños	Supermagnete	S-05-08-N	Varilla magnética y barra diagonal; 5 mm, altura 8,47 mm, neodimio, N45, niquelado, pk. 10
Electroimán pequeño	Schramme	EG1025A02/110	Electroimán 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controlador electroimán	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Control de electroimán Placa PCB
Concentrador	de solenoideDistrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini pinzas	Microscopía Electrónica Ciencias	0302-M5S-PS	Dumont Tipo 5 mini, puntas súper delgadas
Varias piezas optomecánicas	Thorlabs	-	-
Varias piezas mecánicas	Taller Biozentrum, Universidad de Basilea-Placas		adaptadoras diseñadas a medida, soportes, etc. ver archivos CAD adjuntos
Optics
	Thorlabs	CPS780S	módulo de diodo láser de 780 nm Fotodetector de 2,5 mW
	Thorlabs	PDA100A-EC Detector de	ganancia conmutable de silicio, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM		emsdiasum.comDTF-03523	30 nm DuraSiN™ membranas de nitruro de silicio para TEM, paquete de 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537  SIGMA	Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato
NanoVan 2%	nanoprobes.com		Tinción negativa a base de vanadio
NanoW 2%	nanoprobes.com		Tinción negativa a base de tungsteno
Software
openBEB			El marco openBEB 2 está disponible a pedido, la versión 3 será descargable
Control CryoWriter software (complemento openBEB)		Disponible a pedido, es posible que se apliquen tarifas adicionales para el software de controlador de terceros.