Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

Summary

Estudios convencionales de pérdida de función de genes knockout animales han sido a menudo costoso y desperdiciador de tiempo. Basada en la electroporación CRISPR-mediada mutagénesis somática es una poderosa herramienta para entender gen funciona en vivo. Aquí, Divulgamos un método para analizar los fenotipos de nocaut en la proliferación de las células del cerebelo.

Abstract

Malformación cerebral es causada a menudo por mutaciones genéticas. Descifrar las mutaciones en los tejidos derivados del paciente ha identificado posibles factores causales de las enfermedades. Para validar el aporte de una disfunción de los genes mutados para desarrollo de la enfermedad, la generación de modelos animales que las mutaciones es un enfoque obvio. Germinales genéticamente modificados modelos de ratón (GEMMs) son populares herramientas biológicas y exhiben resultados reproducibles, es restringido por el tiempo y los costos. Mientras tanto, no del germline GEMMs a menudo permiten explorar funciones de los genes de una manera más factible. Desde un cerebro enfermedades (p. ej., tumores cerebrales) parecen resultar de somático pero no las mutaciones del germline, modelos de ratón quimérico no germinales, en el que coexisten células normales y anormales, pueden ser útiles para el análisis de enfermedades relevantes. En este estudio, Divulgamos un método para la inducción de mutaciones somáticas CRISPR-mediada en el cerebelo. Concretamente, utilizamos el condicionales knock-en ratones, en el que Cas9 y GFP son crónicamente activados por el promotor de CAG (CMV potenciador de pollo ß-actina) después de Cre-mediada por recombinación del genoma. El solo diseño-guía RNAs (sgRNAs) y la secuencia de recombinase de Cre, ambas codificadas en una único plásmido construcción, fueron entregados en las células progenitoras cerebelosa en un estado embrionario con electroporación en el útero . Por lo tanto, células transfected y su hija fueron etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP), facilitando así mayores análisis fenotípicos. Por lo tanto, este método no sólo mostrando entrega basada en la electroporación del gene en células embrionarias cerebelosas sino que también propone un nuevo enfoque cuantitativo para evaluar fenotipos de pérdida de función CRISPR-mediada.

Introduction

Enfermedades cerebrales son una de las más terribles enfermedades mortales. A menudo resultan de mutaciones genéticas y dysregulation posterior. Para entender los mecanismos moleculares de las enfermedades del cerebro, eterno intento descifrar los genomas de pacientes humanos ha descubierto un número de genes causativos posibles. Hasta ahora, se han utilizado modelos animales genéticamente modificado de germline en vivo ganar-de-función (GOF) y análisis de la pérdida de funciones (LOF) de tales genes candidatos. Debido al acelerado desarrollo de los estudios de validación funcional, es deseable un más flexible y factible en vivo gene sistema de ensayo para estudiar la función genética.

La aplicación de un sistema de transferencia en vivo basada en la electroporación gene en el cerebro de ratón en desarrollo es conveniente para este propósito. De hecho, varios estudios mediante electroporación en el útero han demostrado su potencial para llevar a cabo análisis funcionales en el cerebro en desarrollo^1,2,3. En realidad, han sido objeto de varias regiones del cerebro del ratón, tales como la corteza cerebral⁴retina⁵, diencéfalo⁶, cerebelo⁷, cerebelo⁸y médula espinal⁹ por genes somáticos enfoques, hasta la fecha.

De hecho, expresión génica transitoria por electroporación en vivo en cerebros de ratón embrionario ha sido utilizada para el análisis de fibra optica. Recientes tecnologías de integración genómica basada en transposones más permitido a largo plazo o condicional expresión de genes de interés^10,11, que es ventajoso para disecar la funciones de los genes de una manera espacial y temporal durante desarrollo. En contraste con el análisis de fibra optica, análisis LOF ha sido más difícil. Si bien se realizaron transitorios de la transfección de plásmidos portadores de shRNA y siRNAs, efectos a largo plazo de LOF de los genes no están garantizadas debido a la eventual degradación de ácidos nucleicos exógeno introducidos, tales como plásmidos y dsRNAs. Sin embargo, la tecnología CRISPR/Cas proporciona una brecha en el análisis LOF. Genes que codifican proteínas fluorescentes (p. ej., GFP) o proteínas bioluminiscentes (p. ej., luciferasa de la luciérnaga) han sido co transfected con Cas9 CRISPR y sgRNAs a las células expuestas a CRISPR-Cas9-mediada por mutaciones somáticas de la etiqueta. Sin embargo, este enfoque podría tener limitaciones en los estudios funcionales en células proliferantes, puesto que genes marcadores exógenos son diluidos y degradados después de la proliferación a largo plazo. Mientras que las células transfected y sus células hijas sufren mutaciones inducidas por CRISPR en sus genomas, sus huellas pueden perderse con el tiempo. Así, enfoques Etiquetadoras genéticos sería convenientes resolver este problema.

Recientemente se desarrolló un método LOF CRISPR basado en células de gránulo cerebeloso que experimentan proliferación a largo plazo durante su diferenciación¹². Para la etiqueta genéticamente las células transfected, construyó un plásmido lleva un sgRNA junto con Cre e introduce el plásmido en el cerebelo de ratones de Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP¹³ mediante electroporación en el útero . A diferencia de los vectores del plasmid regular codificación EGFP, este enfoque etiquetados con éxito transfected gránulos precursores de neuronas (SPNG) y sus células hijas. Este método proporciona gran ayuda en la comprensión en vivo la función de los genes de interés en células proliferantes en el desarrollo normal del cerebro y un tumor propensos a fondo.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron según las normas de bienestar animal y han sido aprobados por las autoridades responsables (Karlsruhe competente, número de aprobación: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 y G133/14).

1. generar plásmidos pU6-sgRNA-Cbh-Cre

1. Diseño de lo sgRNA a un gen de interés según el protocolo anteriormente publicado¹⁴.
   Nota: En este experimento, dos sgRNAs están diseñados para atacar el gen Top2b de ratón y un sgRNA de orientada a no control (tabla 1). Al knockout de genes usando la tecnología CRISPR, sgRNAs deba ser diseñado para orientar la secuencia de codificación de la región 5' o el esencial dominio funcional de la proteína. Un punto de partida conveniente es probar secuencias sgRNA prediseñado disponible públicamente, como el GeCKO v2 Ratón knockout piscina biblioteca¹⁵ del laboratorio de Zhang. Alternativamente, sgRNAs puede ser diseñado utilizando software público disponible como el siguiente sitio web: crispr.mit.edu.
2. Clon del sgRNAs en el vector de pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
   Nota: El vector pU6-sgRNA-Cbh-Cre¹² utilizado en este estudio se deriva de la original pX330 plásmido¹⁶ reemplazando la secuencia de codificación de SpCas9 con el recombinase de Cre .
   1. Sintetizan como sigue dos oligos de ADN. Sentido: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisentido: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
      Nota: El 20 N de muestra sobre el soporte para la secuencia sgRNA.
   2. PU6-sgRNA-Cbh-Cre con BbsI durante 30 min a 37 ° C utilizando los siguientes reactivos de digerir la muestra digerida a un gel de agarosa al 1% de la carga y purificarlos con el equipo de extracción de gel. Uso 3 μg plásmido; 3 μl Bbs. 1 μl FastAP; 5 μl 10 x buffer de digestión; Añadir ddH₂O para llevar el volumen total de 50 μl.
   3. Fosforilan y templar cada par de oligos sgRNA utilizando los siguientes reactivos (volumen total de 10 μl): 1 μl modificado para requisitos particulares sentido oligo (100 mM); 1 μL para requisitos particulares oligo antisentido (100 mM); 1 μl de 10 x Buffer de la ligadura de T4; DdH de 6,5 μl₂O; 0,5 ΜL T4 PNK. Incubar en un thermo cycler durante 30 min a 37 ° C y 5 min a 95 ° C y luego rampa hasta 25 ° C a 5 ° C por minuto.
   4. Configurar la reacción de la ligadura siguiente e incubar 10 min a temperatura ambiente (volumen total de 10 μl): X µL Bbsdigiere plásmido (50 ng); 1 μl fosforilados y recocido, oligo duplex (dilución 1: 200); 5 μl de 2 x buffer de la ligadura; X µL ddH₂O; Ligasa rápida de 1 μl.
   5. Añadir 2 μl del producto de la ligadura en 50 μl de células químicamente competentes DH5α Escherichia coli . Después de 30 min de incubación en hielo, calor de choque la muestra de 90 s a 42 ° C e incubar por 2 min en hielo. Añada 100 μl de medio LB y placa sobre una placa de LB con ampicilina 100 de μg/mL.
      Nota: La integración de la secuencia sgRNA en el plásmido de pU6-sgRNA-Cbh-Cre se realiza siguiendo los pasos de la clonación para el plásmido pX330 del¹⁴.
   6. Inocular dos colonias, cada uno en 2 mL de medio LB a 37 ° C durante un mínimo de 6 h y realizar un aislamiento de ADN de mini-prep con el equipo.
   7. Sanger la secuencia de la DNA mini-prep utilizando la cartilla hU6-Forward y colonias se identifican con la correcta insercion de sgRNAs alineando con la secuencia mostrada en el paso 1.2.1. La secuencia de la cartilla se muestra en la tabla 1. Plásmidos utilizados en este estudio fueron nombrados pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre y pU6-sgControl-Cbh-Cre.
   8. Inocular las colonias correctamente identificados y purificar el endotoxina libre ADN plásmido para en el útero electroporación con el equipo, por ejemplo, de Qiagen. Eluir el ADN con endotoxina libre TE-Buffer diluido en ddH₂O en 1:10 (10% buffer de TE). La concentración de ADN del plásmido debe ser superior a 2 mg/mL.
      Nota: No utilice un kit de preparación para el maxi regular para la preparación de ADN. Plásmido-soluciones a 4 º C para uso a corto plazo regular (hasta 4 semanas), o parte alícuota un volumen adecuado de cerca de 25 μl y mantenerse a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.

2. probar la eficiencia de la sgRNAs usando el sistema de plásmido EGxxFP

Nota: La eficacia de la sgRNAs normalmente es probada por topógrafo o T7E1 (endonucleasa T7 I) ensayos. En este protocolo, se utiliza una alternativa fácil y eficiente. La clave de este enfoque es usar el plásmido pCAG-EGxxFP que contiene fragmentos EGFP superpuestos separados por una secuencia de ADN que contienen lo sgRNA a sitio¹⁷. Sobre la expresión del pCAG-EGxxFP junto con los sgRNA Cas9 en las células transfected, se repara la rotura mediaron Cas9 doble cadena (DSB) en la secuencia de destino por mecanismos endógenos homología, que reconstituye la expresión de EGFP cassette.

1. Diseño de cebadores para amplificar la región genomic centrada con el sgRNA dirigidas a secuencias. El amplicon PCR es aproximadamente de 500 bp. En este experimento, se aplicó un conjunto de ADN para clonar un fragmento de la polimerización en cadena-amplificada en el plásmido EGxxFP pCAG.
   Nota: Alternativamente, sitios de restricción apropiado se pueden añadir en el extremo 5' de los cebadores PCR. Sitios de restricción disponibles en el vector EGxxFP pCAG son EcoRV, NheI, PstI, SalI, EcoRI y BamHI.
2. Amplificar el ADN genómico con cebadores diseñados con la forma y los parámetros de la polimerización en cadena a continuación. Carga de la muestra (19,7 μl de H₂O; 0,3 μl de 10 ng/μl de ADN genómico de ratón; 2.5 μl 10 μm EGxxFP-Top2b-F; 2.5 μl 10 μm EGxxFP-Top2b-R; 25 μl 2 X master mix PCR, volumen total de 50 μL) en una agarosa 1% gel y gel-purificar los fragmentos PCR usando un kit de extracción de gel. Utilice la siguiente reacción condiciones: 95 ° C por 3 min; entonces 35 x los ciclos de 98 ° C por 20 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C por 20 s y 72 ° C por 1 min; 4 ° C, por tiempo indefinido.
   Nota: En este experimento, se amplificó una región en Top2b exón 1; encontrar las secuencias de la cartilla en la tabla 1.
3. Resumen de lo pCAG-EGxxFP vector con enzimas de restricción BamHI y EcoRI por 2 h a 37 ° C, luego carga la muestra en una agarosa al 1% gel y gel-purificar el eje vector usando un kit de extracción de gel. Usar los reactivos siguientes (volumen total de 50 μL): plásmido X µL (3 μg); 2 μl BamHI; 2 μl EcoRI; 5 μl 10 x Buffer; X µL ddH₂O.
4. Establecer la Asamblea de ADN reacción¹⁸ según las instrucciones del fabricante y transformar en competentes DH5α e. coli.
5. Inocular dos colonias, cada uno en 2 mL de medio LB a 37 ° C durante un mínimo de 6 h, realizar un aislamiento de ADN de mini-prep con el equipo, por ejemplo, de Qiagen e identificar las colonias con la inserción correcta (en lo sucesivo como pCAG-por ejemplo-Top2b-FP) usando Sanger secuenciación con el primer EGxxFP-Top2b-F.
6. Transfectar las células HEK293T.
   1. Células de semilla la HEK293T en una placa de 24 pocillos 24 h antes de transfección.
      Nota: Las células fueron cultivadas en una incubadora de la célula de 37 ° C con 5% CO_2, en DMEM con suplemento de glutamina que contiene 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina. Asegúrese de que las células son 60% confluente en el día de la transfección. En este experimento, utilizamos uno células HEK293T expresando estable SpCas9 probar pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Sin embargo, pueden utilizarse células HEK293T de tipo salvaje es siempre un vector de expresión de SpCas9.
   2. Transfectar las células HEK293T usando el reactivo de polietilenimina (PEI). Transfectar las células con 120 ng/pozo de plásmido pCAG EG-Top2b-FP-¹² y 120 ng/pozo de pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre o pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre en una placa de 24 pozos. Mezclar el plásmido DNAs y el 1.8 μl del reactivo de PEI en 80 μl de medio DMEM sin suplemento glutamina suplemento e incubar por 15 min a temperatura ambiente después de Vortex.
   3. 6 h después de la transfección, quitarlo del medio y reemplazar con medio fresco.
   4. Vigilar la presencia de células vivas de GFP⁺ 48 h después de transfección con un microscopio de fluorescencia con 20 aumentos.
      Nota: El número de células GFP⁺ indica la eficiencia targeting de lo sgRNA. Resultados de sgRNAs eficaces y no eficaces (sgTop2b-1 y sgTop2b-2, respectivamente) se muestran en la figura 2A.

3. realizar en el útero de electroporación

1. Criar de 6 a 8 semanas de edad ratones y preparar las herramientas para la electroporación en el útero . Cruce macho homocigótico Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP ratones con ratones CD-1 femenino. Vez que el embarazo de los ratones CD-1 desde el día en que el enchufe vaginal es detectado (E0.5). Los embriones son electroporated en día E13.5.
   1. Tire de Capillares de vidrio de borosilicato (diámetro interior: 0.6-0.8 mm) con un extractor de la micropipeta. Utilice la siguiente configuración: P = 500, calor = 560, tire = 150, Vel = 75, tiempo = 250. Etiqueta de la punta del capilar con tinta negra para mejor visualización durante la inyección. Recortar el taper capilar bajo un estereomicroscopio utilizando una regla y afiladas agujas pinzas y recortar la punta en una longitud de unos 6 mm.
   2. Mantener la unidad de los capilares para mantener el experimento reproducible. Crear un borde biselado unilateral durante el ajuste. La punta debe estar tan afilada como sea posible para la fácil penetración de la pared uterina y evitar daño a los tejidos del embrión.
      Nota: Como alternativa, use una amoladora micro para ajustar un ángulo de 35°¹⁹. Los capilares pueden almacenarse a temperatura ambiente en un plato de Petri en condiciones libres de patógenos de 10 cm.
   3. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos.
   4. Mezclar la sgRNA plásmidos en partes iguales con pT2K-IRES-Luc a una concentración final de al menos 1 μg/μl de cada plásmido y color la solución de plásmido con verde rápido (concentración final de 0.05%). Prepare solución 1% verde rápido con agua destilada libre de endotoxinas y el filtro a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar las partículas de tinte de la solución.
      Nota: La transfección de pT2K IRES-Luc es opcional, pero permite la identificación de animales de electroporated viables después del nacimiento, usando proyección de imagen de bioluminiscencia. Por favor consulte el paso 3.5. Prepare una cantidad suficiente de mezcla de plásmido por el número total de ratones embarazadas para ser operado. Utilizar sobre 15-20 μl de la mezcla por ratón (~ 12 embriones). Proceder de inmediato con la cirugía.
2. Preparar ratones para la cirugía.
   1. Anestesiar embarazadas ratones CD-1 con isoflurano. Inducir la anestesia en una caja con 3-4 vol % isoflurano (flujo de oxígeno: 1,5 L/min) y mantener con 2 vol.% durante la cirugía mediante cono de nariz.
      Nota: La cirugía completa no debe tardar más de 30 minutos reducir la cantidad de inyección y electroporated de embriones, si es necesario. Utilizar guantes estériles para cirugía.
   2. Coloque el ratón sobre su espalda en una almohada y ajustar la anestesia.
   3. Inyectar analgésico (Metamizol, 800 mg/kg peso corporal, por vía subcutánea (s.c.), depósito de 24 h).
      Nota: Puede utilizar otros analgésicos autorizados de Metamizol.
   4. Aplique el ungüento de ojo para evitar la sequedad de ojo durante la cirugía.
   5. Fijar extremidades con cinta y esterilizar el abdomen con un desinfectante. Cubre el ratón con una gasa, dejando solamente el área quirúrgico expuesto. Etanol al 70% se separó sobre Gasa y área quirúrgica.
   6. Hacer una incisión en la piel de unos 2 cm de longitud y ensanchar la brecha suavemente con tijeras quirúrgicas rectas. Localizar la linea alba y hacer una segunda incisión ligeramente más pequeña a través del peritoneo utilizando tijeras con punta Roma.
   7. Humedecer la cavidad abdominal abierta con precalentado estéril 1 x PBS.
   8. Extraiga con cuidado los cuernos uterinos de la cavidad abdominal con unas pinzas de anillo. Tire suavemente por el acaparamiento de la pared uterina únicamente en el boquete entre los sacos de yema de huevo de dos embriones vecinos. Evitar cualquier presión sobre el embrión mientras se tira a través de la incisión. Ampliar la incisión si es necesario y tenga especial cuidado en la posición de los cuernos uterinos en el abdomen mientras no comprimir el flujo sanguíneo a través de la arteria uterina.
      Nota: En algunos casos, se recomienda extraer un cuerno uterino en un momento y reemplácelo antes de continuar con el segundo cuerno uterino.
3. Inyección y electroporación de plásmido DNAs
   1. Aspirar aproximadamente 15 μl de solución de plásmido coloreada con el vidrio preparado capilar. Evitar posibles burbujas de aire durante el proceso.
      Nota: La solución de plásmido puede obstruir la punta fácilmente si su concentración es alta. Prueba del tubo capilar soltando algunas ADN justo antes de la inyección.
   2. Suavemente Sujete el embrión con pinzas de anillo y localizar el área del cuello.
      Nota: Si el embrión está en una posición difícil inyectar, saltarlo e ir para el próximo embrión. Mayor reposicionamiento del embrión puede aumentar las posibilidades de daño a ellos.
   3. Perforar lentamente con la punta del capilar de vidrio previamente preparado en el cuarto ventrículo penetrando a través del cerebelo dorsal y posteriormente inyectar 1 μl de la mezcla de plásmido. Confirmar que el ADN teñido no es filtrado en el cerebro y es visible como un diamante en forma de estructura.
      Nota: Como alternativa, utilizar 2,5 lupas para mejor visualización del cuarto ventrículo y que rodean los vasos sanguíneos. Entregar pulsos eléctricos inmediatamente después de la inyección para evitar la difusión de la solución de plásmido en los otros ventrículos.
   4. Aplicar impulsos eléctricos cuadrados (5 pulsos, 32 mV, 50 ms en 950 ms-off) con pinzas-como pinzas de platino (véase Tabla de materiales). Coloque los electrodos lateralmente con el polo negativo que cubre la oreja y el polo positivo que se coloca en el primordio cerebeloso sobre la pared uterina. Utilizar placas de electrodo de 5 mm de diámetro para la electroporación eficaz de E13.5 embriones.
      Nota: Aumentar la tasa de supervivencia de crías mediante la manipulación de menos de 2/3^rd del número total de embriones por presa. Evitar demasiado cerca los embriones en el cuello uterino. Si manipula, puede causar complicaciones durante el parto y poner en peligro la camada entera. Si los electrodos están demasiado cerca del corazón del embrión, esto puede causar un paro cardíaco.
4. Cuidado post cirugía y post-electroporación
   1. Coloque cuidadosamente los cuernos uterinos en la cavidad abdominal y se llenan previamente calentado estéril 1 x PBS. Deje que los cuernos uterinos se deslice en una posición natural.
   2. Cerrar el peritoneo y la piel por separado con una sutura continua simple.
      Nota: Tenga cuidado extra para no perforar a través de la pared uterina al suturar el peritoneo.
   3. Cierre la anestesia y el animal del vientre abajo dentro una jaula nueva.
   4. Vigilar el animal durante la fase de despertar y otra vez 24 horas después de la cirugía. Coloque la jaula bajo una lámpara de calefacción, si el temblor no mejora en un 15 min-marco de tiempo y el animal no se inicia la preparación.
   5. Confirman éxito electroporación por proyección de imagen de luciferasa.
      1. Asegúrese de que las presas operadas colocar embriones en tiempo (en E19.5).
         Nota: La fecha de nacimiento se puede retrasar hasta el día siguiente probablemente debido a la operación.
      2. Anestesiar los cachorros electroporated (P5-P7) con 2,5% de isoflurano e inyectar (intraperitoneal (i.p.)) con D-Luciferin (3 mg/kg de peso corporal) 5 minutos antes de la proyección de imagen.
      3. Detectar señales de luciferasa en los cachorros de electroporated usando el reproductor de imágenes de bioluminiscencia.
         Nota: Un tiempo de exposición de 1 minuto es suficiente para detectar la señal de la luciferasa. Resplandor (p/s/cm²/sr) es aproximadamente > 1 x 10⁶.

4. preparar Cryosections desde el cerebelo Electroporated

1. Eutanasia a los cachorros de electroporated P7 y diseccionar a cerebelo.
   Nota: La señal GFP puede observarse utilizando un estereoscopio epifluorescente.
2. Fijar el cerebelo durante la noche en 5 mL por cerebro 4% PFA en PBS a 4 ° C.
3. Transferir el cerebelo fija durante la noche en 10 mL por cerebro de sacarosa al 30% en PBS a 4 ° C.
   Nota: El tejido debe llegar a la parte inferior de un tubo de 15 mL después de la incubación en la solución de sacarosa.
4. Al absorber la solución de sacarosa restante con un trozo de papel de filtro de celulosa, sumerja el cerebelo en una temperatura óptima de corte (OCT) compuesto en un molde desechable de plástico y congele en hielo seco. El bloque criogénico puede almacenarse a-80 ° C hasta su uso.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí.
5. Cortar el bloque criogénico en secciones con 10 μm de espesor con un criostato y no las secciones a-80 ° C hasta su uso.
   Nota: Uno puede confirmar la expresión de GFP en las secciones, después de lavar el OCT compuesto con PBS.

5. el Immunostaining de los Cryosections

1. Seque el portaobjetos colocados por 30 min y lavar dos veces por 10 minutos en PBS.
2. Las secciones del círculo con un lápiz líquido bloqueador e incubar las secciones en una solución de bloqueo (10% de suero normal de burro en PBS con un 0.1% Triton-X100) por 1 h a temperatura ambiente.
3. Añadir anticuerpos primarios contra las moléculas de interés (e.g., GFP y topoisomerasa II beta (Top2B) en este estudio) en la solución de bloqueo e incubar durante la noche a 4 ° C.
   Nota: Los nombres y las concentraciones de anticuerpos utilizados aparecen en la Tabla de materiales. Con el fin de mejorar las señales de la GFP, un anticuerpo anti-GFP puede utilizarse opcionalmente junto con los otros anticuerpos.
4. Lave los portaobjetos con 0,1% Triton-que contienen SAFT 3 X 10 min incubar las secciones por 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo diluido en la solución de bloqueo con DAPI.
5. Lavar los portaobjetos en PBS 3 X 10 min Monte las diapositivas y mantener a 4 ° C hasta la proyección de imagen.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí.

6. la proyección de imagen y análisis

1. Imágenes de las secciones usando un microscopio confocal con 20 aumentos.
2. Contar el número de células positivas de GFP perdiendo la expresión de la proteína diana. En la figura 2Bse muestra una imagen representativa.
3. Compruebe el fenotipo molecular sobre la ablación de los genes diana en el PNB y sus progenies de immuostaining¹².

Results

Para en vivo análisis funcional, es crítico para identificar las células en las que se han introducido genes exógenos. Mientras que la expresión de un marcador, tal como GFP en células no proliferantes puede ser objeto de seguimiento durante un largo periodo de tiempo, la señal secuencialmente se pierde en las células proliferantes. Una ilustración de este efecto se demuestra en la figura 1. Para evitar perder la huella de células transfected en anál...

Discussion

Mediante electroporación de exo el útero , previamente hemos informado siRNA basado en vivo análisis funcionales de Atoh1 en una etapa temprana del gránulo cerebeloso de la célula diferenciación⁸. Debido a la disolución o degradación del siRNA y la exposición de embriones fuera de la pared uterina, análisis fenotípico de las células del gránulo de electroporated se limitaba a estadios embrionarios. Sin embargo, el método actual permitieron el análisis del fenotipo de animales pos...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 488 Cabra anti-Pollo	ThermoFisher	A11039	dilución 1:400
Alexa 568 Burro anti-Ratón	Life Technologies	A-10037	dilución 1:400
Alexa 594 Burro anti-Conejo	ThermoFisher	A21207	dilución 1:400
Alexa 647 Burro anti-Conejo	Life Technologies	A31573	dilución 1:400
Alcalina Fosfatasa (FastAP)	ThermoFisher	EF0654
Banda de autoclave	Kisker Biotech	150262
BamHI (HF)	NEB	R3136S
BbsI (FastDigest)	ThermoFisher	FD1014
Papel de filtro de celulosa (Whatman)	Sigma-Aldrich	WHA10347525
Cloth	Tork	530378
Microscopio láser confocal de barrido	Zeiss	LSM800
D-Luciferin	biovision	7903-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	dilución 1:1000
Moldes de plástico desechables (Tissue-Tek Cyromold)	VWR	4566
DMEM Glutamax	ThermoFisher	31966047
Suero	de burroSigma-Aldrich	D9663
EcoRI (HF)	NEB	R3101S
Electro Square Porator	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	12362
Etanol	Merck	107017
ungüento para los ojos (Bepanthen)	Bayer	81552983
Fast Green	Merck	104022
Filtro FBS	ThermoFisher	10270-016
(0.22 y micro; m)	Merck	F8148
Generador de imágenes de células fluorescentes (ZOE)	Pinzas de 1450031
rectas	Fine Science Tools	91150-20
Gasa (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientific	15387311
GFP anticuerpo	Abcam	ab13970	dilución 1:1000
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
Capilar de vidrio con filamento	Narishige	GD1-2
Almohadilla térmica	ThermoLux	463265 / -67
Software de procesamiento de imágenes (ImageJ y Fiji)	Jeringa	de
insulina NIH (B. Braun OMNICAN U-100)	Carl Roth	AKP0.1
Isoflurano	Zoetis	TU061219
IVIS Calibrador Lumina LT Serie III	Perkin Elmer CLS136331
Kalt Agujas de sutura Herramientas de	ciencia fina	12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix Kapa	Biosystems	KK2601
Ki67 anticuerpo	Abcam	ab15580	1:500
Light Pointer	Photonic	PL3000
Lápiz bloqueador de líquidos	Kisker Biotech	MKP-1
Metamizol	WDT-Microgrinder
	Narishige	EG-45
Microinyector	Narishige	IM300
Extractor de micropipetas	Sutter Instrument Co.	P-97
Software de microscopio ZEN	Zeiss-Hilo
de sutura de seda no estéril (0,12 mm)	Fine Science Tools	18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek)	VWR	4583
p27 anticuerpo BD	bioscience	610241	dilución 1:200
Paraformaldehído	Roth	335.3
PBS ( 1x)	Life Technologies	14190169
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
Polietilenimina	Sigma-Aldrich	408727
pX330 plásmido	Addgene	42230
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
QIAquick Kit de extracción de gel	Qiagen	28704
Kit de ligadura rápida	NEB	M2200S Pinzas
de anillo	Fine Science Tools	11103-09
portaobjetos (SuperFrost)	ThermoFisher	10417002
Software para bioestadística (Prisma 7)	GraphPad Software,	Inc-Spitacid
	EcoLab	3003840
Microscopio estereoscópico	Nikon	C-PS
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S5016
Tijeras quirúrgicas	Fine Science Tools	91460-11
Tijeras quirúrgicas con punta roma	Fine Science Tools	14072-10
Sutura (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))	SMI	220340
T4 T4 Tampón de ligadura de ADN	NEB	B0202S
T4 PNK	NEB	M0201S
Tijeras de tejido romas (11,5 cm)	Fine Science Tools	14072-10
Anticuerpo TOP2B	Santa Cruz	sc13059	dilución 1:200
Tripsina (2,5 %)	Pinzas ThermoFisher	15090046
con 5 mm y Oslash; electrodos de disco Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Vaporizador	Drä gerwerk AG	GS186