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Artículo de método

Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno

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DOI:

10.3791/57314

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3 de febrero de 2018

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1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para preparar polivinilos hidrogeles de ácido itacónico-co-alcohol con rigidez variable, que han sido injertadas con y sin oligopéptidos, para investigar el efecto de la rigidez de los biomateriales en la diferenciación y proliferación de células madre. La rigidez de los hidrogeles fue controlada por el tiempo de reticulación.

Resumen

El efecto de señales físicas, tales como la rigidez de los biomateriales en la proliferación y diferenciación de células madre, ha sido investigado por varios investigadores. Sin embargo, la mayoría de estos investigadores ha utilizado hidrogeles de poliacrilamida para el cultivo de células madre en sus estudios. Por lo tanto, sus resultados son controvertidos porque esos resultados pudieran originar de las características específicas de la poliacrilamida y no de la localización física (rigidez) de los biomateriales. Aquí, describimos un protocolo para la preparación de hidrogeles, que no se basan en poliacrilamida, donde varios vástago y las células incluyendo las células madre embrionarias humanas (ES) humanas pluripotentes inducidas (iPS) células, puede ser cultivado. Se prepararon hidrogeles con rigidez variable del bioinert el ácido itacónico-co-alcohol polivinilo (P-IA), con rigidez controlada por grado de reticulación por cambiar tiempo de reticulación. Investigaron a los hidrogeles de P-IA injertados con y sin oligopéptidos derivados de matriz extracelular como una plataforma de futuro para la cultura de célula de vástago y diferenciación. La cultura y el paso de las células madre del líquido amnióticas, células madre procedentes de adiposo, células madre embrionarias humanas y las células iPS humanas se describe en detalle aquí. Los hidrogeles oligopeptide P-IA demostraron funcionamientos superiores, que fueron inducidas por sus propiedades de rigidez. Este protocolo informa la síntesis del biomaterial, su manipulación superficial, junto con el control de las propiedades de rigidez y, finalmente, su impacto en el destino de la célula de vástago usando las condiciones de cultivo libre de xeno. Basado en estudios recientes, tales sustratos modificados pueden actuar como futuras plataformas para apoyar y dirigir el destino de varias línea de células madre a diferentes vínculos; y además, regenerar y restaurar las funciones de la perdida órgano o tejido.

Introducción

El destino de la diferenciación de la célula de vástago en un linaje específico de células y la proliferación a largo plazo de células madre, células especialmente humanas pluripotentes inducidas (iPS) y las células madre embrionarias humanas (ES), se sabe para ser regulados por inhibidores de factores de crecimiento, y / o pequeñas moléculas bioactivas en medios de cultivo. Recientemente, han sido reconocidas las señales físicas de los biomateriales, particularmente la rigidez de biomateriales de la cultura de célula, a ser un factor importante que guía el destino de la célula de vástago proliferación y diferenciación1,2, 3,4,5,6. Por lo tanto, varios investigadores han comenzado a investigar el destino de las células madre, que se cultivan en hidrogeles, en diferenciación, principalmente utilizando hidrogeles de poliacrilamida con rigidez variable.

La rigidez de los biomateriales puede controlar adherencias focales, morfología celular, fenotipo de la célula y adherencia de la célula de vástago, sobre todo en dos dimensiones (2D) cultivo1,2,3,5. Mecano-detección de biomateriales las células madre generalmente es controlada por adherencia focal señalización vía receptores de integrina. NMMIIA, miosina UROLOGICAL contractilidad IIA dependen del citoesqueleto de actina juega un papel fundamental en el proceso de mechanosensing de células madre en células de 2-D cultivo sistemas3,4,5, 7,8,9,10,11.

ENGLER y sus colegas desarrollaron un interesante concepto que las células madre adultas, como la médula ósea (BMS) células cultivadas en biomateriales de cultura de célula con una rigidez similar a la de tejidos específicos, tienden a diferenciarse en células que se originaron de tejidos específicos5. Se incubaron las células BMS en hidrogeles de poliacrilamida suave 2-D con colágeno de tipo I (con una rigidez comparable a la de tejidos de cerebro) en medios de expansión espontáneamente fueron inducidos a diferenciarse en linajes tempranos de neurona, mientras que las células BMS cultivan en hidrogeles con una rigidez similar a la del músculo o los tejidos de colágeno del hueso se encontraron para inducir la diferenciación en linajes tempranos de miocitos y osteoblastos, respectivamente, en los hidrogeles de poliacrilamida 2-D3,5. Muchos investigadores han investigado el destino de la célula de vástago de diferenciación cultivadas en poliacrilamida hidrogel inmovilizado con colágeno tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. sin embargo, debe mencionarse que algunos contradictorios informes1,18,22,23,24 existen para la bien conocida idea sugerida por Engler et al. 5 se trata ya idea5 de Engler fue desarrollado exclusivamente en hidrogeles de poliacrilamida y sus resultados han originado de características específicas del biomaterial (poliacrilamida) y no únicamente de la localización física (rigidez) de el biomaterial. Por lo tanto, es importante desarrollar otro tipo de hidrogel, de que la rigidez puede ser controlada por reticulación de los hidrogeles. Para ello, se desarrollaron bioinert hidrogeles, que fueron preparados de ácido itacónico-co-alcohol polivinilo (P-IA) con una rigidez diferente, que estaba controlada por el grado de reticulación con un cambiante reticulación tiempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. las células madre puede ser cultivadas en hidrogeles P-IA nonmodified, como IA P hidrogeles injertados con matrices extracelulares (ECMs) y oligopéptidos. En un estudio anterior25, humanos las células madre hematopoyéticas (hHSCs) de cordón umbilical se cultivaron en P-IA hidrogeles con valores de rigidez diferentes que van desde un 3 kPa a 30 kPa módulo de almacenamiento donde fibronectina o un oligopéptido se deriva de fibronectina (CS1, EILDVPST) fue injertado en los hidrogeles de P-IA. Alto ex vivo doble expansión de hHSCs se observó en los hidrogeles de P-IA injertados con CS1 o fibronectina, que muestra una rigidez intermedia desde 12 kPa hasta 30 kPa25.

IPS humana y células madre embrionarias no pueden cultivarse en cultivo de tejidos convencionales poliestireno (TCP) platos33,34 porque ES humano y las células iPS requieren unión específica a ECMs, como vitronectina laminina mantener su pluripotencia durante el cultivo a largo plazo. Por lo tanto, varias estructuras de hidrogeles de P-IA oligopeptide-injertado con características de rigidez óptimo fueron diseñadas y preparadas en las formaciones de una sola cadena, una sola cadena con una serie de sesiones conjunta, una doble cadena con una serie de sesiones conjunta y un tipo ramificado cadena de32. Oligopeptide secuencias fueron seleccionadas de dominios de unión de la integrina y la glycosaminoglycan de ECMs. Los hidrogeles de P-IA injertados con oligopéptidos derivados de vitronectina con una doble cadena o serie de sesiones conjunta, que tienen un módulo de almacenamiento en aproximadamente 25 kPa, apoya la cultura a largo plazo ES humano y las células iPS para más de 12 pasajes gratis xeno y química condiciones definidas de32. La serie de sesiones conjunta y doble cadena con moléculas de adhesión celular en los hidrogeles facilitan la proliferación y células de pluripotencia de humano ES e iPS32. Aquí, un protocolo para la preparación de hidrogeles P-IA (con un módulo de almacenamiento de 10 kPa a 30 kPa, que se midió bajo condiciones de humedad en el aire) injertadas con y sin oligopéptidos o ECMs se describe. Se muestra cómo la cultura y paso varias células (incluyendo las células madre del líquido amnióticas, células madre procedentes de adiposo, células madre embrionarias humanas y las células iPS humanas).

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Protocolo

Los experimentos en este estudio fueron aprobados por los comités éticos del Hospital de Landseed de Taiwán (IRB-13-05) y la Universidad Nacional del centro. Todos los experimentos fueron realizados según las directrices gubernamentales e institucionales pertinentes y aplicables y reglamentos durante este estudio.

1. solución y preparación de los medios de comunicación

  1. Purificación del polímero
    1. Purificar P-IA con el grupo de ácido carboxílico con un grado de hidrólisis de > 96,5% en P-IA se lava con etanol. 20 g de P-IA en 200 mL de etanol en un vaso cónico de 500 mL y agitar en un agitador magnético para 24-30 h. cambio el etanol con etanol fresco cada 8-10 h.
    2. Saque P-IA el etanol por filtración usando un embudo Büchner.
    3. Seco P-IA por secado al vacío a temperatura ambiente durante 24 h.
      Nota: Se recomienda limpiar la trampa en el sistema de secado al vacío (por la eliminación de etanol) con frecuencia, especialmente durante el primer par de horas, porque la trampa tiende a obstruirse después de la eliminación de una gran cantidad de etanol a partir de P-IA.
  2. Preparación de la solución de P-IA
    Nota: Agregue muy lentamente el polímero en el solvente (agua). Se recomienda tomar por lo menos 15 minutos para añadir el P-IA en el solvente. Si el solvente es añadido en el polímero, el polímero no se disolvería totalmente. Tenga cuidado de no generar ebullición explosiva de la solución de P-IA. Utilizar gafas de protección durante la preparación de la solución de P-IA. El proceso de calentamiento de la solución de P-IA es esencial disolver cristalina P-IA. Es sugerido (y preferible) para preparar la solución de P-IA en una sala experimental relativamente limpio, si es posible.
    1. Disolver el P-IA en agua pura a una concentración de peso 0.050% para el experimento de cultivo de células o una concentración de peso 0.50% para la medición de Reómetro: por ejemplo, disolver 50 mg de P-IA en 100 mL de agua pura para el cultivo celular y 500 mg de P-IA en 100 mL de agua ionizada (DI) para las mediciones de reómetro.
    2. Agite la solución de P-IA para 1 h en la placa.
      Nota: Para evitar una ebullición explosiva, no caliente la solución más a 95 ° C. Explosivo de ebullición de la solución de polímero a una temperatura alta puede generar quemaduras en la piel. Por lo tanto, realizar la calefacción de P-IA muy cuidadosamente y monitorear la temperatura de la solución de P-IA durante el calentamiento.
    3. Después de la solución de P-IA se enfrió a temperatura ambiente, agitar la solución de P-IA a temperatura ambiente durante 48 h. solución de P-IA caliente deja en el plato caliente sin calefacción y luego dejarlo sin agitación a temperatura ambiente durante 20-24 h para que las burbujas de aire sean no presentes en la solución de P-IA.
  3. Preparación de la solución de reticulación
    1. Hacer la composición de la reticulación solución 1.0 peso % glutaraldehído de solución de glutaraldehído acuoso al 25%, 20.0% Na2de peso tan4 uso 99% > pureza y 1.0 peso % H2hasta4. Por ejemplo, para 6 o 12 bien placa de cultivo celular, añada 100 μl de solución de glutaraldehído, 2 g de sulfato de sodio y 100 μl de ácido sulfúrico en 10 mL de agua pura.
  4. Medios de cultivo de células de humano ES/PS
    Nota: Uso DMEM/F12 medios, esenciales 6 medios de comunicación y medios 8 esenciales para el cultivo celular.
    1. Volver congelado 50 X 8 esencial suplemento lentamente la solución durante la noche por descongelación en un refrigerador de 4 ° C.
    2. Agregar una botella de 50 suplemento X 8 esenciales en una botella de media basal 8 esenciales. Separar los medios de comunicación en pequeñas alícuotas (50 mL) en tubos de centrifugación de 100 mL, luego almacenar los medios de comunicación a-20 ° C.

2. P-IA preparacion de hidrogel

  1. Preparación de la película de P-IA
    1. Inyectar una alícuota de 1 mL de la solución de P-IA en un plato TCP de 35 mm y el plato en un horno de 45 ° C durante 2 días para producir una película de P-IA en un banco de limpieza en seco.
  2. Reticulación de los platos del hidrogel P-IA
    1. Sumerja las películas P-IA en una solución acuosa de reticulación para 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 y 48 h.
      Nota: ' P-IA -X' (p. ej., h P-IA-12) se refiere a un P-IA hidrogel reticulado para X h (p. ej., 12 h).
    2. Después de reticulación, enjuague los hidrogeles P-IA con agua pura a temperatura ambiente y luego mantener los hidrogeles en agua pura a temperatura ambiente en un banco limpio.
    3. Esterilizar los hidrogeles P-IA por inmersión en una solución de etanol 75,0 volume/volume% durante 1 min, enjuagar el P-IA los hidrogeles en agua pura seis veces y entonces mantener el P-IA los hidrogeles en agua pura hasta para el cultivo de células.
  3. Preparación de platos típicos de hidrogel P-IA injertado con oligopéptidos o ECM
    1. Activar los P-IA los hidrogeles mediante inmersión en 1 mL de una solución acuosa que contiene 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- etilcarbodiimida clorhidrato (EDC) y 10 mg/mL N- hydroxysuccinimide (NHS) por 1 h a 37 ° C o 4 h a 4 ° C.
    2. Enjuague los hidrogeles P-IA con 1 mL de fosfato tampón salino (PBS, pH 7,2) 3 veces y sumerja los hidrogeles P-IA en una solución de PBS que contenga 1 mL de oligopéptido (100-1.500 μg/mL) o ECM (10-100 μg/mL) durante 24 h a 4 ° C.
      Nota: Las secuencias de oligopéptidos y ECMs utilizado para el cultivo de células madre se resumen en la tabla 1.
    3. Después de injertar el oligopéptido o ECM, lave los hidrogeles P-IA con agua pura 3 veces.
      Nota: Los hidrogeles P-IA injertados Y μg/ml de oligopéptidos o ECM (Z) son sucesivo P-IA -Xh -Z oP-IA-Xh -Z-Y, donde X se refiere al tiempo de reticulación (h), Y indica la concentración de los oligopéptidos o ECM, Z indica un diferentes oligopeptide o ECM.

3. humano ES/iPS Cell Culture

  1. Método de paso y mantenimiento de las células iPS y ES humano indiferenciado
    1. Mantener ES humano (p. ej., WA09 o H9) células o humano iPS (por ejemplo, HS0077) células en Matrigel en medios de comunicación esencial 8 platos 6 cm usando estándar ES/iPS humana de la célula cultura protocolos28,32.
    2. Incubar cerca de confluencia humana ES/iPS células con dispase 2.0 mg/mL II en medio DMEM/F-12 a 37 ° C durante 8-10 minutos y luego enjuague las células humanas del ES/iPS dos veces con medio DMEM/F12.
    3. Después de la adición de 2 mL de DMEM/F-12 medios humanos ES/iPS células cultura platos separar colonias adherentes débil con un raspador celular o mediante pipeteo.
    4. Recoger las células humanas del ES/iPS en tubos de centrifugación de 15 mL y centrifugar las células humanas del ES/iPS a 160 × g por 5 min a 37 ° C.
    5. Después de la centrifugación, descartar el DMEM/F12 y suspender las células humanas del ES/iPS en 1 mL de medio de E8 y entonces contar la densidad celular usando un contador de células.
    6. Inocular las células ES/iPS después del ajuste de la densidad adecuada (1-5 x 104 células por cm2 pases o como se indica) en nuevos platos de la cultura (P-IA hidrogeles injertados con el oligopéptido o ECM).

4. Caracterización de la caracterización de la célula humana ES/iPS

  1. Evaluación de la actividad de la fosfatasa alcalina (AP)
    1. Medir la actividad de la fosfatasa alcalina (AP) de células humanas del ES/iPS utilizando una tinción fosfatasa alcalina estándar vivo.
  2. Inmunotinción
    1. Realizar el immunostaining de Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 y Oct3/4 en las células del hES y caderas para investigar pluripotencia siguiendo el protocolo convencional28,32.
    2. Añadir un volumen de 0,5 mL de paraformaldehído al 4% (volumen/volumen) en cada plato bien 24 en el que las células humanas del ES/iPS fueron cultivadas y posteriormente, incuban los platos por 15 min a 4 ° C para fijar las células.
    3. Aspirar la solución de paraformaldehído de cada pozo. Luego, añadir 1 mL de PBS por pozo y aspirar PBS para enjuagar las células. Realizar el proceso de enjuague 3 veces.
    4. Permeabilizar las membranas celulares mediante la adición de 0,5 mL de 0,3% (volumen/volumen) de Triton-X 100 solución en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
    5. Aspirar la solución Triton-X 100 y añadir 300 μL de 2% (peso/volumen) de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS (tampón de bloqueo) en cada pozo, incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    6. Retire el amortiguador de bloqueo mediante pipeteo y posteriormente, agregar los anticuerpos primarios deseados (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) y Tra-1-81(1:200) con una pipeta, ven tabla 2) en cada pocillo, donde 1: 200 indica que los anticuerpos se diluyeron con PBS 200-fold e incubados durante un día a 4 ° C.
    7. Aspirar la solución de anticuerpo primario y lavan las células con 300 μL de 0.05% Tween 20 en solución de PBS 3 veces a temperatura ambiente.
    8. Añadir 300 μL de anticuerpos secundarios (1: 200, ver tabla 2), que son el principal subtipo de IgG específicos, en la solución de BSA de 2% (peso/volumen) en cada uno así e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    9. Lavar las células con 300 μL de 0.05% Tween 20 en solución de PBS 3 veces a temperatura ambiente en la oscuridad.
    10. Analizar las células por microscopía de fluorescencia o la microscopia confocal.
  3. Formación del cuerpo de embryoid
    1. Investigar la pluripotencia de las células humanas del ES/iPS por formación de embryoid cuerpo (EB) en pasos de 10 y 20.
      Nota: Cerca de 80% es suficiente para la preparación de la formación de EB de confluencia en placas de 6 pocillos.
    2. Enjuague ES humana o células iPS con 2 mL de DMEM/F-12 medios dos veces y luego sumergir las células en 1,5 mL de medio fundamental 6.
    3. Cortar cerca de 80% confluente ES o iPS células humanas aproximadamente 32 piezas utilizando 200 μL puntas. A continuación, separar las células de los platos, con un raspador celular.
    4. Recoger las células humanas del ES/iPS y transferencia en un plato ultra bajo 6-bien accesorio.
    5. Medios de intercambio esencial 6 pipetear medios viejos y añadiendo medio fresco cada 2 días.
      Nota: La cultura las células en suspensión durante 2 semanas a 37 ° C con 5% CO2.
    6. Después de la EBs homogéneamente se suspendieron en 6 esencial los medios de comunicación, transferencia de EBs a la cultura en los platos TCP 24 pocillos recubiertos con 0.1 peso % de gelatina y las células en medios 6 esencial de la cultura para una semana adicional.
    7. Teñir las células con anticuerpos específicos contra los marcadores de las células derivadas de tres capas germinales embrionarias [AFP (endodermo), GFA (ectodermo), β III-tubulina (ectodermo) y SMA (mesodermo)] y evaluar las celdas por el método de immunostaining descrito anteriormente.
  4. Formación de teratoma
    1. Investigar la pluripotencia de las células humanas del ES/iPS por formación de teratoma en pasos de 10 y 20.
      Nota: 5 platos de cerca de 80% de confluencia en placas de 6 pocillos son suficientes para la formación del teratoma (por lo menos 3 x 106 células son necesarias para los experimentos de formación de teratoma).
    2. Lavar las células con 2 mL DMEM/F-12 medios dos veces y luego añadir 1,5 mL de medio DMEM/F-12 a los platos de cultivo celular.
    3. Cortada casi 80% confluente ES o iPS células humanas aproximadamente 32 por emplear 200 μL puntas. A continuación, separar las células de los platos, con un raspador celular.
    4. Recoger las células humanas del ES/iPS en un tubo de centrifugación de 15 mL y centrifugar las células a 160 × g por 5 min a 37 ° C.
    5. Después de la centrifugación, suspender los pellets de células en 100 μl DMEM/F12 y luego mezcla bolitas de la célula con 100 μl Matrigel (cociente del volumen 1:1).
    6. Transferir la suspensión de células en una jeringa previamente enfriado de-20 ° C. Inyectar, en total, por lo menos 3 × 106 células por vía subcutánea en masculino NOD-SCID (cabeceo. CB17 -Prkdascid/JNarl) ratones (5-8 semanas).
    7. Después de 5 a 8 semanas, diseccionar los teratomas, fijar con solución de paraformaldehído al 4.0% (peso/volumen) y luego almacenar a 4 ° C.
    8. Fijar el teratoma con parafina, cortar los teratomas de parafina y tinción con hematoxilina y eosina (H & E) utilizando un protocolo estándar28,32.
      Nota: Los investigadores pueden enviar tejido fijo teratoma a la empresa para fijar los teratomas con parafina, rebanada la parafina-encajados los teratomas y mancha la muestra con H & E, que se utiliza normalmente en el Departamento de patología en los hospitales.
  5. Cultivo de células de vástago humano adiposo derivados (ADS)
    1. Medios de cultivo cálido (DMEM que contenía 1% antimicótico antibiótico y 10% suero bovino fetal (FBS)), 0,25% de tripsina-EDTA y PBS a 37 ° C en un antes de baño de agua a utilizar.
    2. Lavar las células humanas de anuncios Pipetear 10 ml de PBS en cada placa de cultivo de 6 cm donde se cultivan las células.
    3. Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25%) en los platos de cultura 6 cm e incubar la solución a 37 ° C durante 5 minutos.
    4. Observar las células en los platos de cultura 6 cm bajo microscopia para confirmar que las células son separadas.
    5. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL y añadir un volumen igual de medio de cultivo (DMEM que contiene antibiótico antimicótico 1% y 10% FBS) en el tubo de la centrífuga para neutralizar el tripsina-EDTA.
    6. Centrifugar las células a 250 × g por 5 min a 37 ° C.
    7. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante cuidadosamente mediante pipeteo, sin perturbar el sedimento celulares.
    8. Resuspender las células en los medios de cultivo y luego sembrar las células a la densidad adecuada (5-10 x 103 células por cm2 pases o como se indica) en nuevos platos de la cultura (P-IA hidrogeles injertados con y sin los oligopéptidos y ECM).
  6. El líquido amniótico humano tallo cultura de célula (AFS)
    1. Caliente de los medios de cultivo (DMEM/MCDB 201 (2:3) que contiene 20% suero bovino fetal (FBS), 5 ng/mL bFGF y antibiótico antimicótico 1%), 0,25% de tripsina-EDTA y PBS a 37 ° C en un antes de baño de agua a utilizar.
    2. Lavar las células AFS humanas Pipetear 10 ml de PBS en cada placa de cultivo de 6 cm donde se cultivan las células.
    3. Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25%) en platos de cultivo de 6 cm e Incube las células a 37 ° C durante 5 minutos.
    4. Observar las células en los platos de la cultura 6 cm bajo microscopia para confirmar las células son separadas.
    5. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL y añadir un volumen igual de medio de cultivo (DMEM/MCDB 201 (2:3) que contiene 20% suero bovino fetal (FBS), 5 ng/mL bFGF y antibiótico antimicótico 1%) en el tubo de la centrífuga para neutralizar el tripsina-EDTA.
    6. Centrifugar las células a 250 × g por 5 min a 37 ° C.
    7. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante con cuidado sin perturbar el pellet celular mediante pipeteo.
    8. Resuspender las células en los medios de cultivo y semillas luego las celdas de la densidad adecuada (5-10 x 103 células por cm2 pases o como se indica) en nuevos platos de la cultura (P-IA hidrogeles injertados con y sin oligopeptide y ECM).

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Resultados

P-IA hidrogeles injertan con oligopéptidos derivados de ECM (oligoECM) o ECM con diferentes elasticidades se prepararon siguiendo el esquema de la reacción, como se ve en la figura 1A, utilizando diferentes tipos de oligoECM (figura 1B). Las elasticidades de los hidrogeles fueron reguladas por la intensidad de crosslinking aplicada (tiempo) (figura 1). P-IA hidrogeles injertados con oligopéptidos der...

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Discusión

P-IA-oligoECM y P-IA-ECM hidrogeles con rigidez variable fueron desarrollados para la expansión a largo plazo de ES humano y las células iPS mantienen su pluripotencialidad para más de diez pasos en condiciones libres de xeno, así como para el cultivo de células humanas de la AFS, células de anuncios, y las células madre hematopoyéticas25,28,32. P-IA hidrogeles inmovilizados con oligoECM son un excelente candidato para los mater...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue parcialmente financiada por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán bajo la beca número 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 y 104-2221-E-008-107-MY3. Esta investigación también fue apoyada por el proyecto de Hospital de Landseed de Taiwán (NCU-LSH-105-A-001). Subvenciones para la investigación científica (número 15K 06591) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón también es reconocido. A. Higuchi agradece a para el programa internacional de colaboración científica (ISPP-0062) Vicerrectorado de estudios de posgrado e investigación, Universidad Rey Saud, Riyadh 11451, Reino de Arabia Saudita.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
GTPGPQGIAGQRGVVPH JapónningunoEspecificación: Oligopéptido
Abreviatura: Cíclico RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH JapónningunoEspecificación: Oligopéptido
Abreviatura: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH JapónningunoEspecificación: Oligopéptido
Abreviatura: CS1
EILDVPSTPH JapónningunoEspecificación: Oligopéptido
Abreviatura: VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH JapónningunaEspecificación: Oligopéptido
Abreviatura: HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH JapónningunaEspecificación: Oligopéptido
Abreviatura: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH JapónningunaEspecificación: Oligopéptido
Abreviatura: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JapónningunoEspecificación: Oligopéptido
Abreviatura: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JapónningunoEspecificación: Matriz extracelular
Abreviatura: rVN
VitronectinaThermo Fisher scientificA14700Especificación: Matriz extracelular
Abreviatura: FN
FibronectinaSigma-AldrichF2006Especificación: Material de recubrimiento disponible comercialmente
Abreviatura: Synthemax II
Synthemax IICorning3535Especificación: Polímero
Polivinilalcohol-co-ácido itacónicoJapón VAM & PovalAF-17Especificación:
GlutaraldehídoSigma-AldrichG5882Especificación: Químico
Na2SO4Sigma-Aldrich239313Especificación: Químico
H2SO4Sigma-Aldrich339741Especificación: Químico
Abreviatura: EDC
N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida clorhidratoSigma-AldrichE7750 Especificación: Químico
Abreviatura: NHS
N-hidroxisuccinimidaSigma-Aldrich56480Especificación:
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148Especificación: Químico
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Especificación: Consumible de cultivo celular
Raspador de células Corning3008Especificación: Consumible de cultivo celular
Dispasa IISigma-AldrichSI-D4693Especificación: Medio de cultivo celular
Essential 6Thermo Fisher scientificA1516401Especificación: Medio de cultivo celular
Essential 8Thermo Fisher scientificA1517001Especificación: Medio de cultivo celular
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032Especificación: Medio de cultivo celular
DMEMThermo Fisher scientific12800-017Especificación: Medio de cultivo celular
MCDB 201Sigma-AldrichM6770Especificación: Célula
ES Humana Célula ES WiCellResearch Institute, Inc.WA09Especificación: Célula iPS Célula
iPS humanaBanco de células RikenHS0077Especificación: 35 mm
Abreviatura: TCP
Plato TCPCorning353001Especificación: 60 mm
Abreviatura: TCP
Plato TCPCorning353002Especificación: Plato de 24 pocillos
Plato de 24 pocillosCorning353047Especificación: Bloqueo agente
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA8806Especificación: Reactivo de detección
Tinción viva de fosfatasa alcalinaThermo Fisher scientificA14353Especificación: Reactivo de detección
Hematoxilina y eosinaSigma-Aldrich1.05175Especificación: Placa de formación EB
Placa de fijación ultrabaja de 6 pocillosCorning3471Especificación: Material de recubrimiento
gelatinaSigma-AldrichG9391Especificación: Material de recubrimiento
MatrigelCorning354230Especificación:
Ratones NOD-SCIDratones Laboratorios Nacionales de Investigación Aplicada NingunoEspecificación: Suero
Fetal suero bovinoIndustrias Biológicas04-001-1AEspecificación: Antibiótico
antibiótico antimicóticoThermo Fisher scientific15240-062Especificación: Anticuerpo
Anticuerpo para NanogInvitrogenMA1-017Especificación: Anticuerpo
Anticuerpo para SSEA4Abcamab16287Especificación: Anticuerpo
Anticuerpo para OCT3/4InvitrogenPA5-27438Especificación: Anticuerpo
Anticuerpo Anticuerpo para Sox2Invitrogen48-1400Especificación: Anticuerpo
Anticuerpo para el músculo liso ActinaInvitrogenPA5-19465Especificación: Anticuerpo
Anticuerpo para AFPInvitrogenPA5-21004Especificación: Anticuerpo
Anticuerpo GFAPInvitrogenMA5-15086Especificación: Anticuerpo
Alexa Fluor 555 – anticuerpo anti-ratón de cabra conjugadoInvitrogenA-21422Especificación: Anticuerpo
Alexa Fluor 488 – anticuerpo anti-conejo conjugado de cabraInvitrogenA-11008Especificación: Anticuerpo
químico químico

Referencias

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