Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

Summary

La dos diferentes 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE) protocolos descrito aquí hacen uso de dos diferentes polimerasas de la DNA para asignar las secuencias que incluyen un segmento del marco de lectura abierto (ORF), el codón de parada y el entero 3' UTR de una transcripción utilizando RNA obtenidos de líneas celulares de cáncer diferentes.

Abstract

Maduración de los mRNAs eucarióticos consiste en 3' final de formación, que consiste en la adición de una cola de poly(A). Para asignar el extremo 3' de un gen, el método tradicional de elección es 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE). Protocolos para 3' raza requieren el cuidado diseño y selección de primers anidados dentro de la región 3' no traducida (3' UTR) del gen Diana de interés. Sin embargo, con algunas modificaciones, el protocolo puede utilizarse para incluir el entero 3' UTR y secuencias dentro del marco de lectura abierto (ORF), proporcionando una visión más comprensiva de la relación entre el ORF y el 3' UTR. Se trata además de identificación de la señal de poliadenilación (PAS), así como el escote y poliadenilación sitio provisto por convencional 3' RACE. Ampliado 3' RACE puede detectar inusual 3' UTRs, incluyendo fusiones de genes dentro de los 3' UTR, y la información de secuencia puede utilizarse para predecir potenciales sitios de unión de miRNA como AU rica desestabilizar elementos que puedan afectar la estabilidad de la transcripción.

Introduction

La formación del extremo 3' es un paso crítico en la maduración del ARNm que comprende el clivaje del pre-mRNA aguas abajo de un paso seguido por la adición de 250 untemplated adenines, que forman parte de la cola de poly(A)^1,2. La proteína poly(A) (PABP) se une a la cola de poly(A), y este protege la transcripción del mRNA de la degradación y facilita la traducción¹.

Las estimaciones actuales sugieren que el 70% de genes humanos tiene PASs múltiples y así experimentar la poliadenilación alternativa, resultando en múltiples 3' extremos³. Por lo tanto, es importante identificar donde la cola de poly(A) se fija al resto de los 3' UTR, así como identificar el PAS utilizado por cualquier transcripción dada. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha dado como resultado la identificación simultánea de 3' UTRs y el paso de miles de genes. Este aumento en la capacidad de secuenciación ha requerido el desarrollo de algoritmos bioinformáticos para analizar los datos que implica alternativa poliadenilación del extremo 3'. Para la detección de novo o validación del PAS y por lo tanto, mapeo del extremo 3' de los genes individuales de datos de secuenciación a gran escala, 3' carrera sigue siendo el método de elección^4,5. Las secuencias incluidas en productos de cDNA de 3' raza normalmente incluyen sólo una parte de los 3' UTR que contiene la cola de poly(A), el sitio de la hendidura, el PAS y las secuencias aguas arriba del PAS. A diferencia de la polimerización en cadena, que requiere el diseño y uso de iniciadores específicos de avance y retroceso de gen, 3' RACE sólo requiere iniciadores adelante anidados específicos de dos genes. Por lo tanto, la PCR requiere un conocimiento más detallado de la secuencia de nucleótidos de una región grande del gen está amplificado^4,6. 3' carrera utiliza el mismo invertir cartilla que metas la poly(A) de la cola para todos contra RNA transcripciones, sólo los iniciadores hacia adelantados tienen que ser gene específico, así, que solo requieren conocimiento de una región significativamente menor del mRNA. Esto permite la amplificación de regiones cuyas secuencias no están completamente caracterizadas^4,7. Esto ha permitido 3' carrera a utilizarse no sólo para determinar el extremo 3' de un gen, sino para también determinar y caracterizar grandes regiones corriente arriba del PAS que forman una parte importante de los 3' UTR. Al combinar la carrera con el modificado 3' carrera que incluye grandes porciones de 3' UTR y regiones flanqueantes 5', es posible totalmente la secuencia o clonar una toda transcripción de mRNA del extremo 5' a sus 3' extremo⁸.

Un ejemplo de esta aplicación del modificado 3' RACE es la reciente identificación de una novela CCND1 MRCK transcripción del gene de fusión de líneas de células del manto linfoma y pacientes con cáncer. El 3' UTR consistió en secuencias de genes CCND1 y de MRCK y era recalcitrante a miRNA Reglamento⁹. Los dos anidados CCND1 específicos hacia adelante fueron complementarias a la región inmediatamente adyacente y aguas abajo del codón de parada CCND1 . Aunque transcriptoma toda la secuencia junto con herramientas bioinformáticas específico se puede utilizar para detectar fusiones de genes dentro de los 3' UTR¹⁰, muchos laboratorios pueden carecer los recursos financieros o conocimientos de bioinformática para hacer uso de esta tecnología. Por lo tanto, 3' RACE es una alternativa para novo de identificación y validación de genes de fusión novedosa que implica el 3' UTR. Teniendo en cuenta el drástico aumento del número de genes de fusión reportado como Lee las transcripciones, 3' RACE se ha convertido en una poderosa herramienta en la caracterización de secuencias de genes^11,12. Además, estudios recientes han demostrado que diferentes secuencias dentro de los 3' UTR como la longitud de los 3' UTR puede afectar estabilidad transcripción ARNm, localización, traducción y función¹³. Debido en parte a un creciente interés en la cartografía el transcriptoma, ha habido un aumento en el número de diferentes polimerasas de la DNA ser desarrollado para su uso en el laboratorio. Es importante determinar qué tipos de modificaciones pueden hacerse a los 3' protocolo de la raza en el fin de utilizar el repertorio disponible de polimerasas de la DNA.

Este trabajo informes de adaptación de raza para asignar los enteros 3' UTR 3', el PAS y el 3' final sitio de la hendidura de la transcripción de ANKHD1 utilizando anidados primers dentro de la sección ANKHD1 de la transcripción y dos diferentes polimerasas de la DNA.

Protocol

Usar una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad en todo momento mientras se realizan todos los procedimientos en el presente Protocolo. Asegúrese de que envases y tubos que contienen el reactivo de fenol y guanidina isotiocianato sólo se abren en una capilla certificada y disponer de los residuos de fenol en un contenedor designado. Utilizar reactivos, puntas y tubos estériles libre de DNasa/Rnasa.

1. cultivo celular

1. Crecer la línea celular HeLa y dos suspensión manto linfoma de la célula líneas celulares, Granta-519 y Jeko-1, en DMEM con 10% FBS y 100 U/mL penicilina/estreptomicina en una incubadora humidificada con 5% CO₂ a 37 ° C. Diluir las células 1:10 y contar con un contador de partículas¹⁴.
2. Para la extracción de RNA, la placa de 500.000 células/pocillo de una placa bien 6 (media de 2 mL por pozo). Después de la incubación por 24 h, recoger RNA de las células.

2. extracción de RNA

1. Recolección de células
   Nota: Con excepción de la etapa de centrifugación, realice todos los pasos enumerados en una campana de cultivo de tejidos para mantener la esterilidad.
   1. Para las células de suspensión (Jeko-1 y Granta-519):
      1. Transferencia de las células (junto con 2 mL de medio) a un tubo de 15 mL y centrifugue a 1.725 x g por 5 min aspirar los medios de comunicación y dejar el precipitado de células en la parte inferior del tubo.
      2. Resuspender el pellet celular en 50 μl de 1 x de tampón de fosfato salino (PBS). Añadir 500 μl del reactivo de isotiocianato de fenol y guanidina monofásicos a cada muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mezclar bien y dejar a temperatura ambiente (RT) por 5 min al invertir el tubo de microcentrífuga cada 1 minuto.
   2. Para células adherentes (HeLa):
      1. Aspire los medios de cultivo celular de cada pocillo. Añadir 1 mL de PBS a cada pocillo para limpiar escombros.
      2. Retirar el PBS y agregar 500 μl de reactivo de isotiocianato de fenol y guanidina monofásicos a cada pocillo.
      3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con suave balanceo. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Lisis de la célula
   1. Congelación de la mezcla de células isotiocianato fenol y guanidina a-20 ° C durante 1 h.
      Nota: Puede dejar la mezcla a-20 ° C durante la noche o hasta que se necesite.
   2. Descongelar el fenol y guanidina isotiocianato celular la mezcla en hielo. Añada 100 μl de cloroformo en el tubo de microcentrífuga en una campana PCR. Vórtice de la muestra para s 10-15 hasta que la mezcla es color rosa y opaco. Incubar la muestra en hielo (a 4 ° C) durante 15 minutos.
   3. Centrifugue la muestra durante 15 min a 20.800 x g a 4 ° C. Cuidadosamente Remueva la fase acuosa incolora superior (~ 200 μL) y traslado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Precipitación de RNA
   1. Añadir un volumen igual de isopropanol a cada muestra. Añadir 1 μl de coprecipitant (véase Tabla de materiales) a cada uno para actuar como un portador para el RNA de la muestra y ayuda a visualizar el ARN en los pasos posteriores. Incubar la muestra a-80 ° C durante al menos 4 h. Para mejores resultados, incubar durante una noche a-80 ° C.
   2. Transferir la muestra a una centrífuga refrigerada. Centrifugar durante 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; el RNA aparece como una mota azul en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el isopropanol de la muestra. Añadir 500 μl de etanol al 80% y resuspender el precipitado con brevemente un vórtex durante 3 s.
   3. Centrifugar la muestra a 20.800 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos eliminar el etanol de la muestra. Dejar la muestra secar por unos 10 minutos volver a suspender la muestra en 35 μl de agua libre de ARNasa. Colocar en un bloque de calor (65 ° C) durante 5 minutos para que el ARN sea completamente en solución y coloque inmediatamente el tubo en hielo.
   4. Determinar la concentración de ARN total usando un espectrofotómetro como se describió anteriormente, excepto usar 1,5 μl de la muestra de RNA en lugar de 1 μl¹⁵. Opcionalmente, ejecute 1 μg de ARN total en gel de agarosa al 1% para determinar la integridad del RNA.

3. DNasa tratamiento

1. Después de la cuantificación del ARN, realizar tratamiento de DNasa en el ARN total para degradar cualquier DNA genomic. Para cada muestra, añadir los siguientes reactivos del kit libre de Rnasa DNasa al hacer una reacción total de 20 μl mezclar en un tubo de microcentrífuga separados:
   1. Mezcle 2 μl de DNasa 10 X buffer de reacción con 4,4 μg de ARN total. Llevar a un total de 14 μl con agua.
   2. Añadir 2 μl de DNasa Rnasa-libre. Incubar a 37 ° C por 30 min en presencia de 2 μl de inhibidor de la Rnasa (desde el Kit de transcripción inversa).
   3. Añadir 2 μl de solución de parada y calor en un bloque de calor 10 min a 70 ° C para inactivar la enzima DNasa.
      Nota: El tratamiento de DNasa es opcional.

4. síntesis de cDNA

Para un volumen final de reacción de 50 μl:

1. Para un volumen final de reacción de 50 μl: transferencia 22 μL de la ADNsa tratados RNA a un tubo nuevo o transferencia 4 μg de ARN total con agua hasta un volumen total de 22 μL a un tubo nuevo. Añadir 2 μl del primer T7 oligo dT₂₅ solución de imprimación de 10 μm. La secuencia de la cartilla de T7 oligo dT₂₅ es 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
2. De la transcripción reversa kit añadir 2 μl de inhibidor de la Rnasa (20 U/μL), 8 μl del buffer de reacción de 5 x, 4 μL de 10 mM dNTPs y 2 μl de la transcriptasa reversa (200 U/μL).
   Nota: Configurar una reacción sin transcriptasa inversa para actuar como un control negativo.
3. Incubar a 42 ° C por 1 h. transferencia directamente al hielo. Calentar el tubo a 75 ° C por 5 min y coloque el tubo en hielo.

5. primer búsqueda de transcripción del gen de fusión

1. Primer diseño
   1. Descargar la secuencia de cDNA desde el navegador de genoma conjunto (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificar una región dentro de la ORF de la transcripción blanco (ANKHD1) aguas arriba del codón de parada. Copiar y pegar toda la región (hasta 700 nucleótidos) que contienen secuencias aguas arriba del codón de parada en la región de entrada de secuencia de lo software de diseño de la cartilla (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
   2. Seleccione la opción Mostrar todos los particulares y 10 para el número de cartillas que el sistema debe generar (resultados a devolver) y salen todos los otros parámetros fijados por defecto.
   3. Elija cinco cartillas hacia adelantados y dos cartillas inversos que no se superponen. Iniciadores de la orden y reconstituir con agua libre de DNasa/Rnasa a una concentración final de 10 μm. Más detalles sobre el diseño de la cartilla general de PCR están cubiertos en otra parte¹⁶.
2. PCR para identificar potenciales cebadores para su uso en posteriores 3' RACE
   Nota: Para determinar los iniciadores avance finales en la reacción, pruebe los cebadores diseñados por establecer diferentes combinaciones de cebadores de adelante y atrás para regular PCR en una campana PCR.
   1. Transferir el cDNA (2 μL) a un tubo PCR de 0.5ml dulce. Añadir 1 μl del primer delantero y 1 μl del primer inverso (de una solución de imprimación de 10 mM). Hacer hasta 12.5 μl agregando 8,5 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 12.5 μl de 2 x Gel de PCR Master Mix.
   2. Utilice las siguientes condiciones de ciclismo térmicas PCR: 95 ° C por 2 min seguida de 29 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 1 minuto Seleccione el final a 68 ° C por 7 min.
   3. Después de la polimerización en cadena, ejecute los productos en un gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio. Detalles de la electroforesis se describen previamente con unas cuantas modificaciones¹⁷.
      1. Disolver 1 g de agarosa en 100 mL de tampón Tris acetato (TAE) en un matraz de 250 mL. Hervir en el microondas.
      2. Dejar enfriar durante 1 minuto y agregar 7,5 μl de solución de bromuro de etidio (bolsa de 10 mg/mL) en una campana de humos. Mezclar bien agitando el frasco y vierta en un aparato de gel horizontal. Dejar a temperatura ambiente en la campana por lo menos 30 minutos permitir que el gel se solidifique.
      3. Cubrir el gel con 1 x TAE tampón y cargar 10 μl del producto PCR en el gel de agarosa con 3-5 μl de la escala del peso molecular de ADN. Corren 175 V para 10 minutos visualizar los productos usando a un sensor y si se necesita más separación de productos, ejecutar el gel para un 5-10 minutos adicionales.
3. Selección de primers anidados para 3' RACE
   1. Analizar los resultados del gel de agarosa PCR para seleccionar los iniciadores que tienen una banda distinta, fuerte, sola de PCR. Utilice la cartilla más 5' (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') junto con la cartilla de₂₅ oligodT T7 en la primera PCR ejecutar.
   2. Seleccione la cartilla anidada que se encuentra aguas abajo de la primera cartilla (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') y con la cartilla de T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') en el segundo conjunto de las reacciones de PCR.

6. optimización de 3' de carrera a los 3' UTR mediante dos enzimas diferentes

Nota: Ha habido un aumento en la diversidad de las polimerasas de la DNA utilizada para PCR; por lo tanto, quisimos determinar condiciones estándar que pueden aplicarse incluso cuando se utiliza diferentes enzimas para 3' reacciones de PCR de raza. Los cebadores de reversos para cualquier transcripción se mantienen constantes; los únicos cambios son en los cebadores anidados adelantados que son específicos para la transcripción de destino.

1. Protocolo 1:3 ' usando una ADN polimerasa modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu) de la raza
   1. Primera PCR
      1. 1 μl de cDNA de transferir a un tubo PCR y añadir 5 μl de tampón de reacción de Pfu de x 10. Añadir 1 μl de la primera cartilla adelante anidada, 1 μl del primer T7 oligodT₂₅ y 1 μl de dNTPs (de una solución 10 mM).
      2. Hacer hasta 49 μl total volumen añadiendo 40 μl de agua. Añadir 1 μl de polimerasa de la DNA de Pfu y mezclar bien. Ejecute la polimerización en cadena usando el perfil de la polimerización en cadena en la tabla 1.
   2. Segunda PCR
      1. Transferir 2 μl de los productos de la PCR primer a un nuevo tubo PCR y mezclar con 5 μl de 10 x PfuUltra II reacción tampón. Añadir 1 μl de la segunda cartilla PCR anidada, 1 μl del primer T7 y 1 μl de dNTPs (solución 10 mM).
      2. Hacer hasta 49 μl reacción total volumen añadiendo 39 μl de agua. Añadir 1 μl de polimerasa de la DNA de Pfu . Ejecute la polimerización en cadena usando el mismo perfil PCR como la primera instalación PCR (tabla 1).
2. Protocolo 2:3 ' carrera usando una ADN polimerasa quimérica que consiste en un dominio de unión a ADN fusionado a un Pyrococcus-como corrección de la mezcla principal de la polimerización en cadena de polimerasa
   1. Primera PCR
      1. Transferencia de 1 μl de cDNA en un tubo PCR. Añadir 1 μl de la primera cartilla adelante anidada y 1 μl de la cartilla de₂₅ oligodT de T7. Hacer hasta 25 μl añadiendo 22 μL de agua.
      2. Añadir 25 μl de 2 x PCR Master Mix y mezclar bien. Utilizar las condiciones PCR ciclo descritas en la tabla 2.
   2. Segunda PCR
      1. Transferencia de 2 μl de los productos de la PCR primera a un nuevo tubo PCR. Añadir 1 μl de la segunda cartilla PCR anidada junto con 1 μl del primer revés T7.
      2. Hacer hasta 25 μl añadiendo 22 μL de agua. Añada 25 μl de 2 X PCR Master Mix. Ejecute la polimerización en cadena usando el mismo perfil PCR como la primera instalación PCR (tabla 2).

7. Verifique que el segundo producto PCR de 3' de carrera.

1. Tomar 5-10 μl de la segunda producto de la polimerización en cadena (como producto de la primera ronda de PCR si la transcripción se expresa abundantemente) y correr en un gel de agarosa. Configurar el gel y correr la electroforesis como se describió anteriormente (pasos 5.2.3.1 a 5.2.3.3). Visualizar los resultados en un reproductor de imágenes.

8. secuenciación y purificación del producto

1. Purificar los productos PCR del gel de la segunda polimerización en cadena usando el Gel y sistema de limpieza de ADN PCR fragmento según protocolo del fabricante.
2. Realizar Sanger secuenciación (alternativamente, enviar el gel purificada muestras de productos PCR y secuenciación adecuados primers a un laboratorio de secuenciación). Analizar los datos de la secuencia después Sanger secuenciación.
3. Descargar software de análisis de secuencia (véase Tabla de materiales) e importar los archivos de trazas en el software. Uso el QVs individuales de Base puro (valores de calidad) para obtener la Base llamada información¹⁸. Descargar el cromatograma con rastros de alta calidad para la visión.
   Opcional: El producto purificado de gel puede ser clonado utilizando un kit de clonación adecuado y los clones aislados para Sanger secuenciación.

Results

Búsqueda anidada Primer avance:

El gel de agarosa de La figura 1 muestra dos distintas gel productos de la PCR (carriles 1 y 2) que utilizan la misma adelante cartilla pero diferentes primers inversas. Carril 3 tiene un producto PCR distinto y distinto primer avance y retroceso. Los iniciadores ideal a utilizar para la reacción de PCR basado en son los que dan un producto PCR diferente...

Discussion

A pesar del advenimiento de las tecnologías de secuenciación masiva en paralelo, sobre una base de gen por gen, 3' carrera sigue siendo el método más fácil y más económico para identificar la PAS y nucleótidos adyacentes a la cola de poly(A). La adaptación descrita aquí expande utilizando 3' carrera a amplificar tanto mapa secuencias que incluyen una porción del ORF, el codón de parada y el entero 3' UTR de la transcripción del mRNA de ANKHD1 . Una ventaja de 3' RACE es que con algunas adaptaciones menores, prod...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Células HeLa	ATCC	CCL-2 Línea celular de cáncer de	cuello uterino.
Células Jeko-1	ATCC	CRL-3006	Línea celular de linfoma de células del manto.
Granta-519 células	DSMZ	ACC-342	Línea celular de linfoma de células del manto.
Suero fetal bovino	Sigma Aldrich	F6178	Suero fetal bovino para cultivo celular.
Penicilina/Estreptomicina	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiótico y antimicótico.
Coprecipitante GlycoBlue		Ambion AM9545	.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	medios de cultivo celular de la marca Gibco con GlutaMAX.
Agua libre de nucleasas	ThermoFisherScientific	AM9938	Agua libre de ADNasa y ARNasa de Ambion (no tratada con DPC).
Dulbecco' s Solución tamponada con fosfato	Corning	21-030	1X PBS.
Cloroformo	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reactivo Alcohol	Sigma Aldrich	793175
Etanol Solución de bromuro de etidio	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reactivo	ThermoFisherScientific	15596026	Reactivo monofásico de fenol e isotiocianato de guanidina.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  que contiene colorante de carga utilizado en ensayos rápidos de PCR de rutina y búsqueda de cebadores.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 DNasa libre de RNasa	Promega	M6101	Kit de tratamiento de dnasa.
Tinte de carga de gel naranja (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion PCR de alta fidelidad Master Mix con tampón HF	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix que contiene una ADN polimerasa quimérica que consiste en un dominio de unión al ADN fusionado con una polimerasa de corrección similar a Pyrococcus y otros reactivos.
PfuUltra II Fusion HS ADN polimerasa	Agilent Technologies	600670	ADN polimerasa modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu).
Kit de transcripción inversa RevertAid RT	Thermo Fischer	K1691	Se utiliza para la transcripción inversa de ARNm en la síntesis de ADNc. El kit incluye  Inhibidor de la ARNasa Ribolock, transcriptasa inversa RevertAid M-MuLV y otros reactivos enumerados en el manuscrito.
Tamaño perfecto 1Kb escalera	5 Prime	2500360	Escalera de ADN de peso molecular.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Se utiliza para visualizar gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.
Escalera de bajo peso molecular	New England BioLabs	N3233L	Escalera de ADN de peso molecular.
Mezclador de vórtice	MidSci	VM-3200
Mini centrífuga	MidSci	C1008-R
Baño seco	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Espectrofotómetro.
Mini-Submarino Ancho  Cell GT Sistema de Electroforesis Horizontal	BioRad 1704469		Equipo-aparato de electroforesis para configurar gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Fuente de alimentación para electroforesis en gel.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR termociclador.
Centrífuga	Eppendorf	5810 R
Centrífuga	Eppendorf	5430R
Wizard SV Sistema de limpieza de ADN en gel y fragmentos de PCR	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning, con un solo disparo  TOP10 células de E. coli químicamente competentes	ThermoFisherScientific	K280020
Estación de preparación MyPCR Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Capucha dedicada al trabajo de PCR.
Campana extractora Hamilton SafeAire II	ThermoFisherScientific		campana extractora.
Beckman Coulter Z1  partícula  Contador	Beckman Coulter	6605698	Contador de partículas. Para contar celdas antes de enchapar  para la extracción de ARN.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (a través de ThermoFisherScientific)		Software para analizar datos de secuenciación de Sanger.