Valoración de ELISA como método para determinar la constante de disociación de la interacción del ligando del Receptor

Resumen

Se describe un protocolo detallado para llevar a cabo una valoración de ELISA. Por otra parte, se presenta un nuevo algoritmo para evaluar valoración ELISAs y obtener una constante de disociación de la Unión de un ligando soluble a un receptor inmovilizado en la placa de microtitulación.

Resumen

La constante de disociación describe la interacción entre dos socios en el equilibrio de la Unión y es una medida de su afinidad. Es un parámetro crucial para comparar diferentes ligandos, por ejemplo, los inhibidores competitivos, isoformas de la proteína y mutantes, por su fuerza vinculante a un socio de la Unión. Constantes de disociación se determinan trazando las concentraciones de consolidados versus gratis ligando como curvas de enlace. En contraste, curvas de titulación, en el cual una señal que es proporcional a la concentración del ligand encuadernado se enfrenta a la concentración total de ligando añadida, son más fáciles de grabar. La señal puede ser detectada espectroscópico y por el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Esto se ejemplifica en un protocolo para una valoración de ELISA que mide la Unión de la rhodocetin derivado de veneno de serpiente su dominio destino inmovilizados de la integrina α2β1. Valoración ELISA es versátiles y ampliamente utilizado. Cualquier par de interacción de proteínas puede utilizarse como inmovilizado receptor y ligando soluble, siempre que ambas proteínas son puros, y sus concentraciones son conocidas. Hasta ahora la dificultad ha sido determinar la constante de disociación de una curva de titulación. En este estudio, se introduce una función matemática subyacente a las curvas de titulación. Sin ninguna estimación de errores gráfico de un rendimiento de saturación, este algoritmo permite el procesamiento de los datos en bruto (intensidades de la señal a diferentes concentraciones de ligando agregado) directamente por la evaluación matemática mediante regresión no lineal. Así, varias curvas de valoración se pueden grabar simultáneamente y transformadas en un conjunto de parámetros característicos, entre ellos la constante de disociación y la concentración de receptores de enlace activo, y pueden ser evaluados estadísticamente. Cuando se combina con este algoritmo, titulación ELISA obtener la ventaja de presentar directamente la constante de disociación. Por lo tanto, se puede utilizar más eficientemente en el futuro.

Introducción

La constante de disociación K es un parámetro clave para describir la afinidad de un receptor (R) por su ligando (L). Basado en la ley de acción de masas, K se define el equilibrio, en el que el RL complejos ligando-receptor se disocia en el receptor R y el ligando L:

            Ecuación 1

con los índices f que indica el estado libre de/sin consolidar del receptor y ligando. La concentración del complejo receptor-ligando, RL, es idéntica a la concentración del ligand del receptor-li....

Protocolo

1. soluciones

1. Para preparar 100 mL de 10 x TBS solución de pH 7.4, disolver 6,06 g de TRIS y 8,77 g de NaCl en 90 mL de agua desionizada, ajustar el pH a 7.4 con solución de HCl 37%, completar el volumen a 100 mL con agua desionizada y filtrar la solución.
2. Para preparar 100 mL de 1 M HEPES/NaOH, solución pH 7,4, disolver 23,83 g de HEPES en 90 mL de agua desionizada, ajustar el pH a 7.4 con 1,5 M NaOH, completar el volumen a 100 mL con agua desionizada y filtrar la solución.
3. Para preparar 100 mL de solución de NaCl de 5 M, se disuelven 29,2 g de NaCl en 90 mL de agua desionizada. Completar el volumen a 100 mL con agua desionizada y filtra....

Resultados

Después de la ELISA se ha desarrollado, el color amarillo del sustrato de la fosfatasa alcalina se puede convertir, para- nitrofenolato, indica que la cantidad de ligando enlazado rhodocetin disminuye con la disminución de las concentraciones de mayor rhodocetin de columnas 1 a 11 (figura 1). Los pozos descoloridos en los pozos libres de rhodocetin en la columna 12 muestran una señal de bajo fondo.

Discusión

La valoración de ELISA es un sistema versátil de la prueba para determinar la disociación de una interacción ligando-receptor. Como la valoración ELISA evita la necesidad de separar eficazmente ligandos libres y encuadernados y analizar cuantitativamente, sus concentraciones substancialmente más estudios y publicaciones han empleado titulación ELISA en vez de curvas de enlace de la grabación . Por otra parte, titulación ELISAs son fáciles de realizar y requieren cantidades razonablemente bajas de receptor y ligando. Para.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1,316,591,214
MgCl2	Merck	172571
integrin a2A, wild-type y mutante, recombinante		aislado en el laboratorio del autor
NiNTA superflow column	Qiagen, Alemania	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
ensayo de ácido bicinconínico (BCA), kit de determinación de concentración de proteínas	Fisher Scientific	23225
albúmina sérica bovina (BSA), fracción V	Applichem	A1391
solución al 25 % de glutaraldehído	Merck	354400
anticuerpos inmunoglobulinas anti-conejo de cabra, conjugados con fosfatasa alcalina	Sigma-Aldrich	A9919
Glicina	Applichem	A1377
Acetato de Zn(II)	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Pastilla de sustrato de fosfatasa alcalina (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Microplaca de microtitulación de medio área Costar	Thermo Scientific	Corning 3690
Tubos de micro reacción	Eppendorf	30120086
Lector de ELISA de microplacas	BioTek	Synergy HT