Implantación de injertos vasculares Electrospun con estructura optimizada en un modelo de rata

Resumen

Aquí, presentamos un método modificado de electrospinning para fabricar injertos vasculares PCL con fibras gruesas y los poros grandes y para describir un protocolo para evaluar el desempeño en vivo en un modelo de rata de reemplazo de la aorta abdominal.

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para fabricar macroporoso PCL vascular injerto y para describir un protocolo de evaluación utilizando un modelo de rata de reemplazo de la aorta abdominal. Los injertos vasculares electrospun a menudo poseen poros relativamente pequeños, que limitan la infiltración celular en los injertos y dificultan la regeneración y remodelación de las arterias de neo. En este estudio, los injertos vasculares PCL con fibras más gruesas (5-6 μm) y los poros más grandes (~ 30 μm) fueron fabricados usando una técnica de tratamiento modificada. Se evaluó el rendimiento a largo plazo del injerto por la implantación de un modelo de aorta abdominal de la rata. El análisis de ultrasonido demostró que los injertos sigue siendo patentes sin aneurisma o estenosis que ocurren incluso después de 12 meses de implantación. Estructura macroporosa mejora el crecimiento de la célula y así promovido tejido regenerado en 3 meses. Más importante aún, no había señal de remodelado adverso, tales como la calcificación dentro de la pared del injerto después de 12 meses. Por lo tanto, electrospun injertos vasculares de PCL con macroporoso modificado procesamiento tienen potenciales para ser un sustituto de la arteria para la implantación a largo plazo.

Introducción

Injertos vasculares hechos de polímeros sintéticos son ampliamente utilizados en clínica para la terapia de las enfermedades cardiovasculares (ECV). Por desgracia, en el caso de injertos vasculares de pequeño diámetro (D < 6 mm) no se dispone de ninguna productos de éxito debido a la baja permeabilidad provocada por la velocidad de flujo reducido de la sangre, que a menudo conduce a la trombosis, la hiperplasia intimal y otros complicaciones¹.

Ingeniería de tejidos provee una estrategia alternativa para realizar la permeabilidad a largo plazo y basada en una regeneración vascular guiado por el andamio y la reconstrucción de la homeostasis. En detalle, el injerto vascular, como una plantilla tridimensional podría proporcionar soporte mecánico y estructural orientación durante la regeneración del tejido vascular y la influencia funciones celulares, incluyendo la adhesión celular, migración, proliferación, y secreción de matriz extracelular². Hasta ahora, se han evaluado diversos polímeros sintéticos para aplicaciones en la ingeniería de tejido vascular. Entre estos polímeros poly(ε-caprolactone) (PCL) se ha investigado intensivamente debido a compatibilidad buena célula y degradación lenta desde varios meses hasta dos años³. En una rata aorta modelo^4,5,6, injertos vasculares PCL procesados por electrospinning exhibieron excelente integridad estructural y la permeabilidad, así como continuamente creciente de la célula invasión y neovascularización en la injerto de pared de hasta 6 meses. Sin embargo, remodelación tisular adversa, incluyendo la regresión de las células y los capilares y la calcificación, también se observaron en los puntos de tiempo más largo, por 18 meses.

Cellularization del injerto vascular es un factor clave en determinar la regeneración del tejido y remodelación⁷. Electrospinning, como una técnica versátil, ha sido ampliamente empleada para la preparación de los injertos vasculares con estructura fibrosa nano⁸. Desafortunadamente, la estructura de poro relativamente pequeños a menudo conduce a infiltración insuficiente de células en el injerto vascular electrospun, que limita la regeneración del tejido posterior. Para resolver este problema, se han intentado diversas técnicas para aumentar el tamaño de los poros y la porosidad total, incluyendo el sal/del polímero lixiviación^9,10, modificación del aparato colector, después del tratamiento por radiación láser¹¹ , etcetera. De hecho, la estructura de los injertos electrospun (incluyendo el diámetro de fibra, tamaño de los poros y porosidad) está estrechamente vinculada a las condiciones de procesamiento de^12,13. Durante electrospinning, el diámetro de la fibra puede controlarse fácilmente cambiando los parámetros, tales como la concentración de la solución de polímero, flujo, voltaje, etcetera. ^{14 , 15}, y por lo tanto, el tamaño de los poros y la porosidad se han mejorado en consecuencia.

Recientemente Reportamos un injerto modificado de electrospun PCL con estructura macroporosa (fibras con diámetro de 5-7 μm y poros de 30-40 μm). Implantación in vivo mediante la sustitución de aorta abdominal de la rata demostró la elevada tasa de permeabilidad, así como buena regeneración endotelialización y músculo liso en 3 meses después de la cirugía¹⁶. Más importante aún, no tejido adverso remodelación incluyendo la regresión de la calcificación y la célula se pudo observar incluso después de un año de implantación.

Protocolo

El uso de animales de experimentación fue aprobado por el Animal experimentos éticos Comité de la Universidad de Nankai y llevado a cabo conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. fabricación de injertos Electrospun PCL

Nota: En este documento, una técnica de Electrohilado fue utilizada para fabricar los injertos vasculares.

1. Preparar soluciones PCL de 25 wt % y 10% en peso, disolviendo el PCL en una mezcla de metanol y cloroformo, respectivamente (cociente del volumen 1:5), a temperatura ambiente (RT) durante 12 h.
2. Cargar la solución PCL en una jeringa de vidrio 10 mL.
3. Coloque la jeringa con una aguja de 21 G.
4. Coloque el mandril de acero inoxidable (2 mm de diámetro, 25 cm de longitud) en el instrumento de colección.
5. Para los injertos de fibra más gruesa, use la solución PCL de 25% en peso, distancia de trabajo de 17 cm de la punta de la aguja al colector, tasa de flujo de 8 mL/h y la tensión de 11 kV como los parámetros de electrospinning. Para los injertos de fibra más fina, utilice la solución PCL de 10% en peso, distancia de trabajo de 20 cm de la punta de la aguja al colector, un caudal de 2 mL/h y la tensión de 18 kV como los parámetros de electrospinning.
6. Asegúrese de que los injertos obtenidos se colocan en el vacío durante la noche para eliminar el solvente residual. Esterilizar todos los instrumentos antes del procedimiento y mantener una técnica aséptica en todo.
7. Antes de la implantación, desinfectar los injertos por sumergir en 10 mL de etanol al 75% durante 30 minutos y luego exponerlos a la luz UV durante la noche.
8. Medidas del tamaño de fibra y poro: calcular el diámetro promedio de fibra utilizando el software ImageJ basado en imágenes de microscopia electrónica (SEM).
9. Ensayos mecánicos de andamios:
   1. Corte los andamios tubulares en secciones de 3 mm de longitud con una cuchilla de afeitar. Medir el espesor de andamios utilizando un micrómetro.
   2. Colocar los andamios tubulares en una máquina de ensayos de tracción con una capacidad de carga de 100 N.
   3. Sujetar los andamios con una distancia de 1 mm entre la abrazadera y tire longitudinalmente a una velocidad de 10 mm/min hasta la ruptura. Medir la resistencia a la tracción y alargamiento a la rotura. Calcular el módulo de Young de la región lineal inicial (hasta 5% tensión) de la curva del stress-strain.

2. rata Aorta Abdominal implantación modelo

Nota: Todos los materiales e instrumentos utilizados en cirugía son estériles. Durante la cirugía, asegúrese de que el operador lleva una máscara de Gasa y guantes estériles para evitar infecciones. Asegúrese de que la temperatura se mantiene a 27-30 ° C para mantener la temperatura corporal del animal. Seguir pautas IACUC locales con respecto a la analgesia.

1. Utilizar ratas Sprague Dawley macho pesa 240-270 g como receptores de injerto vascular. Asegúrese de que la rata ha ayunado 24 h antes de la cirugía. El objetivo de ratas ayuno por 24 h es vacía las heces en el tracto intestinal lo suficiente, de tal modo amplían horizontes del operador.
2. Agarre de cuello detrás de la rata y mantenga su cabeza hacia abajo, inserte la aguja de springe en la cavidad abdominal de la parte inferior del abdomen. Inducir a la rata para la anestesia con hidrato de cloral (330 mg/kg) por inyección intraperitoneal.
3. Confirmar la anestesia adecuada al asegurar que la rata ha relajado los músculos y la respiración constante. Colocar la rata en el microscopio en una posición supina.
4. Aplique petrolato veterinario oftálmica ungüento en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Administrar anticoagulación (100 UI/kg) con solución salina heparinizada (50 UI/mL) por inyección en la vena la cola antes de la cirugía.
5. Afeitado de la piel en la pared abdominal anterior usando una cuchilla de afeitar y limpiar la piel con solución de yodo y alcohol médico.
6. Realizar una incisión de laparotomía de línea media con tijeras quirúrgicas y garantizar que la incisión es de unos 4-5 cm de largo y luego exponer la cavidad abdominal.
7. Repliegue y envuelva los intestinos con una gasa humedecida con solución salina preferentemente.
8. Disecar cuidadosamente la aorta abdominal.
9. Identificar y ligar todos los ramas pequeños utilizando suturas de nylon monofilamento 9-0.
10. La sección aislada de la abrazadera (hasta 1 cm de longitud) de la aorta utilizando dos pinzas vasculares. La aorta puede permanecer sujeta durante 20-30 minutos.
11. Transecto de la aorta abdominal entre dos pinzas con micro tijeras para crear los sitios de anastomosis.
12. Lave los dos extremos de la aorta con solución salina heparinizada (50 UI/mL) para quitar la sangre residual.
13. Pele apagado la adventicia con micro tijeras.
14. Anastomizar el injerto con diámetro interno de 2 mm y 1 cm de longitud a aorta abdominal de la rata con un patrón de sutura figura de ocho con suturas de nylon monofilamento 9-0.
15. En primer lugar, construir cuatro anastomosis según la secuencia de 9, 3, 12 y 6:00 posiciones en el lado proximal, luego anastomizar los bordes de corte en 4 puntos de sutura entre dos suturas. Después de terminar la sutura proximal, la sutura del lado distal por el mismo método.
    Nota: Cada punto es necesaria para asegurar que el lado nativo se encaja un poco en el injerto.
16. Retire la abrazadera distal para permitir que la sangre fluya en el injerto, luego retire la pinza proximal.
17. Presione los extremos de la sutura para detener el sangrado utilizando una bola de algodón estéril o con una esponja de Gasa pequeña. Pulse durante unos 3 minutos, hasta que la hemostasia.
18. Regresar los intestinos a la cavidad abdominal.
19. Lavar la cavidad abdominal con solución salina tibia con gentamicina (320 U/mL).
20. Coser la pared abdominal usando una sutura de Nylon 3-0 en la capa de músculo y la piel, respectivamente.
21. Colocar la rata en una jaula limpia y seca y poner una almohada debajo de la jaula para mantener la temperatura del cuerpo animal; Luego espere a que la rata para recuperarse de la anestesia. Asistir al animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
22. Después recupera conciencia, puso la rata en una jaula solo con comida y agua. Aplicar yodo en la herida para prevenir la infección después de la cirugía. Vuelve la rata a la compañía de otros animales hasta que recupera completamente.
23. Eutanasia ratas según las pautas en los puntos de tiempo predeterminado.

Resultados

Los injertos PCL fueron explantados en 3 meses y 12 meses postoperatorio y analizan por técnicas estándar histológicas por hematoxilina y eosina (H & E), tricrómica de Masson, Verhoeff-van Gieson (VVG), Von Kossa e inmunofluorescencia que manchaba para α-SMA, MYH, vWF y la elastina. Las imágenes histológicas fueron tomadas usando un microscopio vertical, y las imágenes de la inmunofluorescencia fueron tomadas usando un microscopio de fluorescence.

Discusión

La infiltración celular es crítico para la regeneración y remodelación del injerto vascular en vivo¹⁶. Infiltración de la célula limitada está a menudo relacionada con los poros relativamente pequeños del injerto que impiden la migración de células en la pared del injerto. Para hacer frente a esta dificultad, hemos desarrollado un método modificado para preparar electrospun injertos vasculares de PCL con estructura de poro grande. En detalle, el tamaño del poro aumenta con el aumento de e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pellets de poli(&épsilon;-caprolactona) (PCL) (Mn=80,000)	Sigma	704067
Metanol	Compañía de reactivos químicos de Tianjin	1060
Alcohol	reactivos químicos de Tianjin	1083
Cloroformo	Compañía de reactivos químicos de Tianjin	A1007
Sacarosa	Tianjin Fengchuan Compañía	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Ratas Sprague Dawley	Animales de laboratorio Centro de la Academia de Ciencias
Militares Solución salina normal	Hebei Tiancheng Compañía
Hidrato de cloral	Tianjin Ruijinte Compañía química	2223
Inyección de heparina sódica	Tianjin Biochem Compañía farmacéutica
Inyección de sulfato de gentamicina	Jiangsu Lianshui Compañía farmacéutica
Anticuerpo primario anti-α-SMA para ratones	Abcam	ab7817
Anticuerpo primario anti-liso MYH para ratones	Abcam	ab683
Anticuerpo policlonal de elastina anti-rata para conejos	Abcam	ab23748
Anticuerpo primario anti-factor von Willebrand en conejo	Abcam	ab6994
IgG anti-ratón en cabra (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
IgG anti-conejo en cabra (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% suero normal de cabra	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoxilina y eosina (H& E)	Beijing leagene biotech	DH0006
tricrómico de Masson	Beijing leagene biotech	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Beijing leagene biotech	DC0059
Von Kossa	Beijing leagene biotech	DS0003
Agujas de suturas quirúrgicas con hilo, seda 3-0	Shanghai Jinhuan empresa de suministros médicos	G3002b
Agujas de suturas quirúrgicas con hilo, seda 9-0	Shanghai Jinhuan empresa de suministros médicos	H901