Artículo de método

Cuantificación de lípidos abundancia y evaluación de la distribución de lípidos en Caenorhabditis elegans por Nilo rojo y aceite rojo O manchas

DOI:

10.3791/57352

⸱

5 de marzo de 2018

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1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California, 2Molecular & Computational Biology Section, University of Southern California, 3Integrative Program for Biological & Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

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Nilo rojo de fijo Caenorhabditis elegans es un método para la medición cuantitativa de los depósitos de lípidos neutros, mientras que el aceite rojo O tinción facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo excepcional en el que estudiar el metabolismo de los lípidos y la homeostasis de la energía. Muchos de sus genes de lípidos se conservan en los seres humanos y están asociados con el síndrome metabólico u otras enfermedades. Examen de la acumulación de lípidos en este organismo puede realizarse por fijadores colorantes o métodos libres de etiqueta. Manchas de fijador como Nilo rojo y aceite O rojo son maneras baratas, confiables para medir cuantitativamente los niveles de lípidos y observar cualitativamente la distribución de lípidos a través de los tejidos, respectivamente. Por otra parte, estas manchas permiten proyección de alto rendimiento de varios genes del metabolismo de lípidos y vías. Además, su carácter hidrofóbico facilita la solubilidad en lípidos, reduce la interacción con los tejidos circundantes y evita la disociación en el solvente. Aunque estos métodos son eficaces en el examen de contenido lipídico general, no proporcionan toda la información sobre la composición química y la diversidad de los depósitos de lípidos. Para estos propósitos, métodos libres de etiqueta tales como microscopia de GC-MS y los coches son mejores satisfecho, sus costos no obstante.

Introducción

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Los lípidos son esenciales para la vida. Son componentes integrales de las membranas, actúan como mensajeros secundarios y transductores de señales y tienen funciones cruciales en almacenamiento de energía. Cuando el metabolismo lipídico se altera, conduce a enfermedades como obesidad y diabetes tipo II, que están presionando de preocupaciones de salud pública9. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo excelente estudiar el metabolismo de los lípidos ya que tiene un ciclo de vida relativamente corto, un cuerpo transparente, un linaje de la célula conocidos y un genoma completamente secuenciado. Principalmente un hermafrodita C. elegans permite a los investigadores levantar grandes cantidades de animales isogénicas en breve períodos de tiempo a realizar alto rendimiento adelantados pantallas genéticas para estudiar una amplia gama de genes y rutas metabólicas4. Este enfoque ha revelado un alto grado de conservación de genes de metabolismo de lípido de C. elegans 273 entre los seres humanos, ratones, ratas y drosophila. Además, más de 300 genes de lípido en C. elegans tienen orthologues humano que están asociadas con enfermedades no relacionadas con el síndrome metabólico11. Tradicionalmente, examen del almacenaje del lípido en C. elegans ha dependido sobre todo de ensayos marcados con tinte, que proporcionan información confiable sobre la acumulación de lípidos. Menos común es una descripción de donde localización los lípidos y medidas diferencias en abundancia de lípidos en los tejidos. Sin embargo, trabajo reciente ha revelado que la distribución de lípidos puede ser tan importante como la acumulación de lípidos6.

Últimamente, los estudios han comenzado a integrar métodos tales como alto rendimiento líquido cromatografía-espectrometría de masas (HPLC-MS), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), y anti-stokes coherente microscopia de Raman dispersión (coches) a la dirección del deficiencias de los enfoques basados en la mancha analizando directamente el contenido de extractos de lípidos y fracciones de lípidos específicos depósitos de lípido, respectivamente10,11. Por otra parte, microscopia de coches ha revelado que el rojo Nilo sólo puede servir como un proxy para la acumulación de grasa cuando se utiliza como un colorante fijador, para su uso como una tinción vital conduce al objetivo de tinción de organelos fluorescentes auto10. Sin embargo, los conocimientos técnicos requeridos y los costos asociados con estos cromatografía y los métodos de microscopía hacen su uso insostenible para muchas preguntas de investigación. En este artículo, discutimos un método conveniente y confiable para fijar y depósitos de lípidos neutros en C. elegans con Nilo rojo de la mancha y aceite O rojo para distinguir la abundancia de lípidos en animales enteros y en tejidos específicos.

Nilo rojo, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, es un tinte benzophenoxazone que fácilmente se disuelve en disolventes orgánicos varios, pero sobre todo es insoluble en agua. Es un excelente lysochrome colorante utilizado para teñir lípidos neutros como los triglicéridos o ésteres de colesterol ya que cuenta con un color fuerte, solubiliza bien en lípidos tiene insignificante interacción con los tejidos circundantes y es menos solubles en el solvente que en lípidos. Tiene una máxima excitación y de emisión de 450-500 y 520 nm, respectivamente1. Cuando Nilo teñido de rojo C. elegans para la fluorescencia verde, cuerpos lípidos discreta pueden ser observados a lo largo del intestino y otros tejidos ya sea en grupos o disperse uniformemente, dependiendo del genotipo del animal o el tratamiento experimental 7.

Aceite rojo O es a lysochrome, soluble en la grasa colorante utilizado para teñir los triglicéridos y las lipoproteínas. Se llama un colorante azo porque su estructura química contiene dos grupos azo a tres anillos aromáticos. Es difícil ionizar, que hace que sea altamente soluble en lípidos. Su color de tinte es rojo y su absorción de la luz máxima es 518 nm 3. C. elegans manchado con aceite O rojo muestran gotas lipídicas rojo que destacan contra el cuerpo del animal transparente, que facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos diferentes6.

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Protocolo

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1. el Nilo rojo (NR) tinción de lípidos

  1. Preparación de solución 5 mg/mL NR
    1. En una botella de 500 mL, añadir 100 mg de polvo NR a 200 mL de acetona al 100%.
    2. Cubrir la botella con papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz.
    3. Antes de usar, agitar la solución durante 2 h en la oscuridad.
    4. Para uso a largo plazo, guarde la solución NR en un frasco bien sellado sin ninguna exposición a la luz. Solución madre de escala NR según las necesidades de investigación. Asegúrese de que la misma solución se utiliza en experimentos NR-coloración para obtener coloración consistente y resultados de la proyección de imagen.
  2. Preparación de solución de trabajo NR
    1. Por cada 1 mL de isopropanol al 40% (v/v), añadir 6 μl de solución stock de NR.
    2. Preparar 600 μl de solución de trabajo NR para cada muestra.
      Nota: Asegúrese de NR fresco derecho solución de trabajo antes de la tinción. Según necesidades de la solución madre de NR, utilice un tubo cónico aforado de 50 mL o 15 mL.
  3. Preparación de gusanos para la tinción de lípidos NR
    1. Crecer gusanos a etapa temprana de la L4 a 20 ° C en medio del crecimiento de nematodos (NGM) sembrado con fines registro OP50 e. coli.
    2. Lavar los gusanos la placa con 1 mL de 1 x solución salina con tampón fosfato + solución al 0.01% Tritón X-100 (SAFT) y la suspensión de gusano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Centrífuga de que los gusanos a 560 x g durante 1 minuto retirar el sobrenadante y repetir este paso hasta que e. coli se borra de la suspensión.
    4. Añadir 100 μl de isopropanol al 40% para el pellet de gusano e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
    5. Centrifugue los gusanos a 560 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante sin interrumpir la pelotilla del gusano.
      Nota: Volúmenes más altos de uso de SAFT para lavar los gusanos de las placas si usando las placas de mayor tamaño o coloración más gusanos por placa. No lave los gusanos en SAFT más que 15 min antes de la fijación de la muestra. Realizar lavados adicionales si no se elimina el sobrenadante de las bacterias. Llevar a cabo la incubación en isopropanol al 40% usando un nutator o balancín. Siempre controlar los tubos para asegurarse de que está produciendo agitación de lleno de la muestra.
  4. Lípidos tinción con NR
    1. En la oscuridad, añadir 600 μl de solución de trabajo NR a cada muestra. Invertir los tubos tres veces y mezclar completamente los gusanos en la solución NR.
    2. Girar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.
    3. Después de la incubación, centrifugar los gusanos a 560 x g durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante.
    4. Añadir 600 μl de Saft e incubar las muestras en la oscuridad durante 30 minutos remover exceso mancha NR.
    5. Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y quitar todo pero aproximadamente 50 μl de sobrenadante.
      Nota: Incubación NR no requiere agitación. Adaptación de gusanos es común durante esta etapa.
  5. Preparación de transparencias para proyección de imagen de microscopio
    1. Resuspender el precipitado de gusano en el sobrenadante restante.
    2. Colocar 5 μl de la suspensión de gusano en un portaobjetos y un cubreobjetos en cuidadosamente para evitar atrapar burbujas de aire.
    3. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas antes de gusanos la proyección de imagen.
    4. Preparar sólo unas diapositivas a la vez. Esto garantizará la proyección de imagen NR es constante a través de las muestras. La calidad de imágenes teñidas de NR disminuye después de 6 h. discreto lípido gotitas son difíciles de observar y aumenta la fluorescencia del fondo, que interfiere con la detección de señal NR.
  6. Proyección de imagen de gusanos NR-manchado
    1. Imagen de los gusanos en el aumento de 5 X para capturar a varios animales por el campo de visión.
    2. Cambiar a 10 aumentos para la mejor cuantificación de los gusanos.
    3. Utilice FITC/GFP canal imagen gusanos NR-manchadas y tiempos de exposición diferentes para determinar las condiciones óptimas para la cuantificación.
    4. Guardar archivos en formato TIF para evitar perder datos debido a la compresión.
      Nota: Exposición típica veces desde el 100-1000 Sra. teniendo un tiempo de exposición óptima, utilizarlo para todas las muestras para mantener la coherencia de imagen.
  7. Cuantificación de imagen tinción NR
    1. Subir imágenes a ImageJ. En el menú desplegable de Plugins, utilice la función Bio-formatos si no se reconoce el archivo de imagen.
    2. En el menú desplegable de imagen, bajo la función de pilas, utilizar pila de imágenes para crear una pila de imagen cuando se comparan varias imágenes.
    3. En el mismo menú desplegable, ajustar brillo y contraste de la pila de la imagen y propagar los cambios a todas las imágenes haciendo clic en aplicar.
    4. Emplear la herramienta de selección de polígono para delinear cada gusano imagen y utilice la función de medida del menú desplegable de análisis para cuantificar la intensidad de la fluorescencia emitida por NR.
    5. Para cada imagen, medir cinco localidades de fondo y calcular la intensidad de la fluorescencia de fondo promedio.
    6. Restar la intensidad de la fluorescencia de fondo de cada gusano reflejada mediante la fórmula N = G - (A x B), donde N es neta fluorescencia, G para fluorescencia bruta, A para el área total de gusano y B por fluorescencia del fondo promedio.
    7. Para normalizar la intensidad de fluorescencia por el tamaño del gusano, dividir fluorescencia neto de cada gusano por su área total. Los resultados se informan como intensidad de la fluorescencia en unidades arbitrarias (a.u.) por píxel.
      Nota: Evitar exportar imágenes en formato JPEG. Mientras que la compresión hace archivos más manejables para almacenar, integridad de los datos se ve comprometida por este formato. Asegúrese de que todas las imágenes se modifican y analizadas idénticamente. Recuerde incluir una barra de escala para evaluar adecuadamente el tamaño en diferentes aumentos. Para visualizar mejor las diferencias en la intensidad de fluorescencia con ImageJ, cambiar el tipo de imagen de RGB a 8 bits y seleccione fuego desde el menú de tablas (LUT) de búsqueda de imagen. Esto crea una imagen de mapa de calor en el color que mayor brillo se correlaciona con la intensidad creciente de la fluorescencia.

2. aceite rojo O manchas (ORO) de lípidos

  1. Preparación de solución madre de ORO
    1. En una botella de 250 mL, Añadir 500 mg de polvo ORO a 100 mL de isopropanol al 100% y mezclar bien.
    2. Una vez preparado, guarde la solución cerrada con ninguna exposición a la luz.
  2. Preparación de solución de trabajo de ORO
    1. Diluir solución stock de ORO en agua (3:2) isopropanol al 60%.
    2. Antes de usar, filtrar la solución de trabajo de ORO a través de un filtro de jeringa estéril de acetato de celulosa de 0,2 μm.
      Nota: Para mejor calidad de la solución, preparar solución de trabajo de ORO el día antes y deje mezclar durante la noche. Sin embargo, si la solución es mismo día necesario, diluir y mezclar ORO solución en un rockero durante al menos 2 h antes de su uso. Antes de mecedora, envuelva el tubo cónico en las cintas de parafina para evitar la salida de la solución ORO.
  3. Preparación de gusanos para la tinción de lípidos ORO
    1. Crecen los gusanos a 20 ° C en medio del crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con fines registro OP50 e. coli a la etapa de la vida deseada.
    2. Añadir 1 mL de solución de SAFT a la placa y agitar hasta que los gusanos están fuera de la placa. Incline la placa y lavar con 1 mL de SAFT. Transferir la suspensión de gusano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Centrífuga de que los gusanos a 560 x g durante 1 minuto sacar el sobrenadante sin perturbar el pellet y repetir el lavado paso con 1 mL de SAFT tres veces. Quitar todo flotante pero 100 μl.
    4. Añadir 600 μl de isopropanol al 40% para el pellet de gusano y el rock a temperatura ambiente durante 3 minutos.
    5. Centrifugue los gusanos en 560 x g durante 30 s y quite todo flotante pero 100 μl sin perturbar el pellet de gusano.
      Nota: Use mayores volúmenes de SAFT para lavar gusanos de placas si la coloración de alto rendimiento. No lave los gusanos en SAFT más que 15 min antes de la fijación de la muestra. Hacer lavados adicionales si no se elimina el sobrenadante de las bacterias. Llevar a cabo la incubación en isopropanol al 40% usando un nutator o balancín. Siempre controlar los tubos para asegurarse de que está produciendo agitación de lleno de la muestra.
  4. Lípidos tinción con ORO
    1. Añadir solución de trabajo de ORO de 600 μl de cada muestra. Invertir el tubo tres veces y mezclar los gusanos bien en ORO.
    2. Rotar las muestras a 30 rpm por 2 h a temperatura ambiente.
    3. Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y eliminar todo flotante pero 100 μl.
    4. Resuspender las muestras en 600 μl de Saft y gire los tubos a 30 rpm por 30 min eliminar exceso mancha ORO.
    5. Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y eliminar todo pero 50 μl del sobrenadante.
    6. Para distinguir mejor la ubicación de la línea germinal y células intestinales del animal, la mancha núcleos mediante la adición de 1 μl de (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) para cada 1 mL de solución de trabajo de ORO. Realizar coloración de ORO por 2 h con la adición de DAPI antes del montaje de diapositivas para la proyección de imagen. Núcleos intestinales son más grandes en tamaño y la gónada se distingue por las células germinales en desarrollo.
      Nota: Después de la coloración de ORO, gusanos pueden adherirse a los lados del tubo de microcentrífuga y no formar un pellet sensible. Si esto sucede, centrifugar los gusanos otra vez o permitir gusanos a asentarse por gravedad durante al menos 10 minutos.
  5. Preparación de las diapositivas para la proyección de imagen del gusano
    1. Suspender los gusanos en el sobrenadante restante y mezcle bien la solución.
    2. Poner 5 μl de la suspensión de gusano en un portaobjetos y coloque un cubreobjetos cuidadosamente, asegurando que ningunas burbujas de aire forma.
    3. El cubreobjetos con esmalte de uñas y gusanos de la imagen del sello.
      Nota: Después de la fijación y tinción, gusanos pueden ser muy rígido y difícil de pipetear. Para evitar esto, asegúrese de pipetas ancha cortando sus consejos.
    4. Almacenar las diapositivas en un rack de microcentrífuga a 4 ° C hasta 24 horas si no de imágenes inmediatamente después de la tinción.
  6. Proyección de imagen de gusanos teñidos de ORO
    1. Utilice una cámara compatible con color a los gusanos de ORO manchado de imagen.
    2. Utilice 5 aumentos para varios gusanos en un campo de visión de la imagen.
    3. Cambiar a 10 aumentos para mejor examen de los gusanos.
    4. Exportar imágenes en formato TIF para evitar pérdida de datos debido a la compresión.
      Nota: Si la coloración con ORO + DAPI, cambiar la cámara color a uno que puede captar la fluorescencia.
  7. Análisis de imagen de gusanos teñidos de ORO
    1. Cargar micrograph(s) en ImageJ. En el menú desplegable de Plugins, utilice la función Bio-formatos si no se reconoce el archivo de imagen.
    2. En el menú desplegable de imagen, bajo la función de pilas, utilizar pila de imágenes para crear una pila de imagen cuando se comparan varias imágenes.
    3. Ajustar brillo y contraste en el mismo menú desplegable para mejorar la visibilidad de las gotitas de lípidos.
    4. Clasificar las imágenes según la acumulación de lípidos en el cuerpo del animal o en tejidos específicos.
    5. Para la mejor evaluación de la localización de los lípidos y para la identificación de los artefactos de imagen inespecífica con ImageJ, seleccionar la función de Color en el menú desplegable de imagen y haga clic en pila de RGB para mostrar las señales de cada componente RGB.

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Resultados

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SKN-1 es un bZip, factor de transcripción de cytoprotective que comparte homología con NRF2 mamíferos y se ha demostrado para mediar la oxidación de los ácidos grasos. Dependiendo de la concentración de glucosa en su dieta, gusanos con un alelo activado constitutivamente skn-1 muestran los niveles de lípidos diferentes cuando manchados con rojo Nilo7. Figura 1A -C muestra activado skn-1 animales expue...

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Discusión

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El aumento de la obesidad y las tasas de enfermedad metabólica hace que C. elegans un modelo adecuado para estudiar los mecanismos que regulan la acumulación de grasa en las células y tejidos. La evidencia reciente sugiere que los cambios en los niveles de lípidos están correlacionados con los procesos celulares que van desde8, la activación de la hormona receptores2, salida reproductiva5de señalización de la insulina. En comparación con mic...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue posible por la concesión de NIH: R01GM109028 (criador)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Imager.Microscopio M2mZeissn/aMicroscopio de fluorescencia
Cámara ERC5sAxiocamn/a
Cámara MRmAxiocamn/aRojo del Nilo con capacidad de fluorescencia
Thermo FisherN1142Tinción lipídica
Aceite rojo OAlfa AesarA12989Tinción lipídica
DAPIThermo FisherD1306Tinción de ADN
Alcohol isopropílicoBDHBDH1133-1LPSolución fijadora
0,2 y micro; m filtro de jeringa seterileVWR28145-477 filtro deacetato de celulosa
centrífuga 5430Eppendorf5428000015centrífuga
agitador Asadorlaboratorio Quake400110Q
Rotador de tuboVWR10136-084Rotador
K2HPO4Sigma-Aldrich7758-11-4NGM
KH2PO4Sigma-Aldrich7778-77-0NGM
MgSO4Alfa Aesar7786-30-3NGM
CaCl2Sigma-Aldrich10035-04-8NGM
NaClSigma-Aldrich7647-14-5NGM
ColesterolSigma-Aldrich57-88-5NGM
PeptonaBD Biosciences211677NGM
AgarTeknovaL9110NGM
LB mediaSigma-AldrichL3147Crecimiento bacteriano
con capacidad de color de agitador

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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